沙昱彤, 李景超, 易 文

(浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所腫瘤與干細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310058)

自19世紀(jì)中期細(xì)胞學(xué)說被提出以來,細(xì)胞-細(xì)胞相互作用界面一直備受研究者們的關(guān)注。大量研究表明,可以通過細(xì)胞間的接觸來介導(dǎo)參與包括免疫應(yīng)答、上皮層形成、神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和成肌細(xì)胞融合等多種生命活動(dòng)[1]。長久以來,細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(cell-cell interactions, CCIs)一直是多種疾病治療的靶標(biāo)。細(xì)胞間的直接相互作用在多細(xì)胞生物的生長發(fā)育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。這些相互作用可以通過細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)等介導(dǎo)的質(zhì)膜間的物理接觸而發(fā)生。這些關(guān)鍵的相互作用驅(qū)動(dòng)細(xì)胞信號(hào)的傳遞,對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生重要影響。在許多情況下,異常的細(xì)胞間相互作用是導(dǎo)致嚴(yán)重疾病和機(jī)體紊亂的主要原因[2]。

這些CCIs是復(fù)雜的,涉及許多不同的細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的參與。理清這些復(fù)雜的相互作用以及相關(guān)的信號(hào)通路,將會(huì)極大地提高對(duì)細(xì)胞接觸介導(dǎo)的生物過程的認(rèn)知,并能促進(jìn)新的細(xì)胞療法的開發(fā)[3]。因此,隨著基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,如何準(zhǔn)確識(shí)別細(xì)胞間相互作用并對(duì)其進(jìn)行表征和定量,引起了各界的廣泛關(guān)注。近年來,鄰近標(biāo)記是一種十分有前景的研究細(xì)胞間相互作用的方法。其中,酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法在檢測和表征CCIs上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該綜述將標(biāo)記過程中涉及有酶參與的方法定義為酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法,旨在歸納與總結(jié)近年來開發(fā)的酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及現(xiàn)有應(yīng)用。

1 鄰近標(biāo)記方法

近年來,研究CCIs的技術(shù)手段不斷推陳出新,而鄰近標(biāo)記方法已經(jīng)成為一種十分有前景的研究細(xì)胞間相互作用的化學(xué)生物學(xué)方法。這種方法不僅能夠識(shí)別復(fù)雜系統(tǒng)中未知的細(xì)胞間相互作用,還能夠發(fā)現(xiàn)與此類相互作用相關(guān)的特定分子[4-6]。

目前,主要有兩種類型的標(biāo)記策略。一種是依賴基因工程操作,在“誘餌”細(xì)胞表面表達(dá)外源酶,通過其與相鄰細(xì)胞上的受體底物的直接結(jié)合,以便發(fā)生細(xì)胞間鄰近標(biāo)記(接觸依賴性鄰近標(biāo)記方法)。另一種是使用酶或小分子催化劑(例如光催化劑),通過基因工程重組表達(dá)或借助化學(xué)(酶)方法將它們偶聯(lián)在“誘餌”細(xì)胞表面,在適當(dāng)?shù)拇碳せ蚣せ詈?靶向遞送感興趣的標(biāo)記分子,實(shí)現(xiàn)鄰近標(biāo)記(接觸非依賴性鄰近標(biāo)記方法)。常用將含生物素的探針標(biāo)記到鄰近底物上,然后通過鏈霉親和素與生物素的親和力對(duì)被標(biāo)記的底物進(jìn)行富集,之后借助質(zhì)譜、流式細(xì)胞術(shù)或測序等方法進(jìn)行下游檢測分析[3, 7-9]。

鄰近標(biāo)記方法在理解生物分子相互作用方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展,這種方法首先在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域被引入,用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-RNA和蛋白質(zhì)-DNA相互作用[7, 9]。例如,Rhee等[10]使用APEX(ascorbate peroxidase)鑒定得到人類線粒體基質(zhì)內(nèi)的495種蛋白質(zhì),其中包括31種以前未與線粒體關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。Padrn等[11]開發(fā)的APEX-seq技術(shù),其可以解析細(xì)胞內(nèi)RNA的定位,并確定它們?cè)陉P(guān)鍵RNA結(jié)合蛋白質(zhì)附近的富集或缺失。Villaseor等[12]開發(fā)的ChromID,即使用生物素連接酶來識(shí)別與特定染色質(zhì)標(biāo)記相關(guān)的蛋白質(zhì)。細(xì)胞間通訊通常由細(xì)胞表面蛋白質(zhì)之間的相互作用來調(diào)控,盡管存在許多檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interactions, PPIs)的方法,但是精確探測膜蛋白之間的相互作用仍然是一個(gè)難題[6]。

2 酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

細(xì)胞間的相互作用是動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的,近年來已經(jīng)出現(xiàn)了一些酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記的新興方法來識(shí)別和檢測這些相互作用。這種方法的一個(gè)明顯優(yōu)勢是,由于酶和受體底物之間直接的物理接觸或酶催化產(chǎn)生高反應(yīng)性標(biāo)記分子而實(shí)現(xiàn)小的標(biāo)記半徑范圍,所以能夠進(jìn)一步特異性地精準(zhǔn)定位研究目標(biāo)細(xì)胞間的相互作用。下面本文對(duì)近年來開發(fā)的不同酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法進(jìn)行概述(Table 1)。

Table 1 Overview of enzyme-mediated proximity cell labeling methods

2.1 基于過氧化物酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

一種源自植物的工程化抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APEX),現(xiàn)已成為進(jìn)行鄰近標(biāo)記的重要工具。APEX在H2O2存在的情況下,能夠?qū)⑸锼乩野忿D(zhuǎn)化為活性酪胺基自由基,然后攻擊鄰近細(xì)胞表面富含電子的氨基酸殘基例如酪氨酸,并與其偶聯(lián),實(shí)現(xiàn)鄰近細(xì)胞生物素化標(biāo)記(Fig.1A)?；钚岳野坊杂苫陌胨テ诙?t1/2<1 ms)[10],標(biāo)記半徑小(<20 nm)[19]的特性,使得只有靠近APEX部分的蛋白質(zhì)才會(huì)被標(biāo)記。該反應(yīng)能通過去除H2O2和添加淬滅緩沖液來停止,隨后可以使用偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁珠進(jìn)行富集,并借助質(zhì)譜法進(jìn)行后續(xù)的檢測鑒定[13, 20]。APEX還能被用于鑒定與特定RNA[21]或DNA[22]序列相互作用的蛋白質(zhì)。

Fig.1 Schematic illustration of different enzyme-mediated proximity cell labeling methods (A) Schematic diagram of proximity cell labeling method based on ascorbate peroxidase (APEX): In the presence of H2O2, APEX can convert biotin-phenol to biotin-phenoxyl radicals, which biotinylate electron-rich amino acids within a radius of several nanometers; (B) Schematic diagram of the proximity cell labeling method based on biotin ligase (BioID): In the presence of ATP, BirA* catalyzes the conversion of biotin to reactive biotin-AMP, which reacts with neighboring nucleophilic lysine side chains; (C) Schematic diagram of pupylation-based interaction tagging (PUP-IT):By fusing the Pup ligase (PafA) to a “bait” protein, PafA catalyzes the phosphorylation of the C-terminal Glu on biotinylated Pup, in the presence of ATP, which then conjugates to the lysine residue on target proteins; (D) Schematic diagram of labeling immune partnerships by sortagging intercellular contacts (LIPSTIC): An engineered sortase A (SrtA) from Staphylococcus aureus was developed and fused to a cell surface ligand. After ligand-receptor interaction, SrtA can catalyze the transfer of biotin-containing sorting peptides (LPETG peptides) to an oligoglycine (G3/G5) acceptor peptide expressed on a complementary receptor of a neighboring cell; (E) Schematic diagram of interaction-dependent fucosyl-biotinylation (FucoID): Coupling fucosyltransferase (FT) with its natural substrate GDP-fucose, and self-installing FT to N-acetyllactosamine (LacNAc) on the surface of “bait” cells and then FT will catalyze the transfer of its substrate GDP-fucose-biotin to LacNAc glycans on the surface of the “prey” cells; (F) Schematic diagram of proximity cell labeling method based on β-galactosidase (QMID): A chimeric enzyme ZHER-βGal was constructed using the nanobody ZHER that recognizes HER2 and targeted to HER2-positive cells. βGal can convert gFQM-biotin or gFMeQM-biotin to QM-biotin and MeQM-biotin respectively, which then effectively react with nucleophiles, including amines and thiols on proteins of proximal cells. (Created with BioRender.com)

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的標(biāo)記原理與APEX類似,但是它在哺乳動(dòng)物胞質(zhì)環(huán)境中表達(dá)時(shí)是無活性的,因?yàn)镠RP的三維結(jié)構(gòu)由4個(gè)二硫鍵和2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)來維持,該結(jié)構(gòu)在還原條件下易被破壞[20, 23],這也限制了它用于研究細(xì)胞內(nèi)的相互作用。但是HRP在氧化環(huán)境中具有活性,例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔或高爾基體腔和細(xì)胞外區(qū)域,因此,它已被用于活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[20]。而APEX相對(duì)于HRP的主要優(yōu)勢在于它缺乏二硫鍵和鈣結(jié)合位點(diǎn),因此,可以在細(xì)胞的還原胞質(zhì)環(huán)境中表達(dá)而不會(huì)喪失活性[20]。

2.2 基于生物素連接酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

基于APEX和HRP的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法雖然時(shí)間分辨率高,標(biāo)記效率高,但是由于H2O2的毒性,在體內(nèi)應(yīng)用上受到了限制。因此,研究者開發(fā)了一種基于生物素連接酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法。

通過野生型生物素連接酶(biotin ligase, BirA)進(jìn)行鄰近標(biāo)記的問題在于它對(duì)其底物具有嚴(yán)格的選擇性[24],因此,已經(jīng)開發(fā)出另一種被稱為鄰近標(biāo)記生物素識(shí)別(proximity labeling biotin identification, BioID)的方法。該方法使用來自大腸桿菌的BirA突變體(BirA mutant R118G, BirA*)介導(dǎo)生物素與靶蛋白質(zhì)的結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鄰近蛋白質(zhì)的生物素化標(biāo)記,之后使用質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定[15, 24-28]。在ATP存在的情況下,BirA*催化生物素轉(zhuǎn)化為反應(yīng)活性生物素-AMP,它會(huì)與鄰近細(xì)胞表面的賴氨酸殘基側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)(Fig.1B)。雖然生物素-AMP的半衰期(t1/2≈1 min)比過氧化物酶產(chǎn)生的酪胺基自由基中間體長得多,但BioID不需要添加外源性的會(huì)造成細(xì)胞損傷的H2O2,可用于體內(nèi)研究。

BioID的主要缺點(diǎn)是其緩慢的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),這使得此方法標(biāo)記效果緩慢(18～24 h),時(shí)間分辨率差。為了解決這個(gè)問題,研究者們開發(fā)了一種類似的更快的系統(tǒng),稱為TurboID,其標(biāo)記只需10 min[16]。TurboID比上述生物素連接酶相關(guān)鄰近標(biāo)記方法具有更高的反應(yīng)活性,可以實(shí)現(xiàn)更高的時(shí)間分辨率和更廣泛的體內(nèi)應(yīng)用[29]。這種生物素連接酶方法最近才被應(yīng)用于研究細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用,Shafraz等[30]使用與E-鈣粘蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合的TurboID來鑒定上皮細(xì)胞連接中的跨膜結(jié)合伙伴。

此外,還開發(fā)出了一些變體方法,例如split-BioID[31]、Contact-ID[32]和split-TurboID[29, 33],它們也已成為研究細(xì)胞間相互作用的有前景的方法。盡管APEX和BioID已被廣泛用于許多生物系統(tǒng)的鄰近標(biāo)記,但目前主要用于分子層面的相互作用鑒定(即主要通過蛋白質(zhì)組學(xué)),對(duì)于細(xì)胞層面的相互作用鑒定有待進(jìn)一步研究。

2.3 基于Pup連接酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

一種基于小型原核類泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein, Pup)的相互作用標(biāo)記方法(pupylation-based interaction tagging, PUP-IT)與BioID、HRP和APEX不同,它是通過將Pup連接酶(pup ligase, PafA)與“誘餌”蛋白質(zhì)進(jìn)行融合,適用于體內(nèi)外研究。在細(xì)菌中,Pup蛋白C-末端的Gln首先脫氨基為Glu,在ATP存在的情況下,PafA催化Pup上C-末端Glu的磷酸化,然后將C-末端Glu與目標(biāo)蛋白質(zhì)上的賴氨酸殘基側(cè)鏈結(jié)合[6, 34-37]。已有報(bào)道,借助化學(xué)誘導(dǎo)二聚化的FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding protein, FKBP)-FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(FKBP12-rapamycin binding domain, FRB)系統(tǒng),嵌合FRB的PafA可以被靶向附著在細(xì)胞表面的“誘餌”蛋白質(zhì)上,然后對(duì)鄰近相互作用細(xì)胞進(jìn)行生物素化標(biāo)記(Fig.1C),借此成功鑒定得到已知的和多種潛在的CD28相互作用蛋白[3, 6]。

因?yàn)橘嚢彼釟埢谌祟惖鞍踪|(zhì)中幾乎是普遍存在的,因此,這種方法可以催化生物素化的Pup標(biāo)記相互作用細(xì)胞的配體-受體對(duì)和其他鄰近的蛋白質(zhì)。PUP-IT方法標(biāo)記的主要目標(biāo)是細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基側(cè)鏈,這與基于過氧化物酶催化的鄰近標(biāo)記方法中以酪氨酸殘基為目標(biāo)不同。一般來說,蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的含量高于酪氨酸殘基[38]。因此,當(dāng)可用酪氨酸殘基的數(shù)量有限時(shí),可能無法使用APEX和HRP來鑒定潛在的靶蛋白質(zhì)。但是,PUP-IT的標(biāo)記時(shí)間較難控制,可能不適用于空間蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2.4 基于分選酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

不同于使用高反應(yīng)活性標(biāo)記分子的方法,研究者也開發(fā)了很多依賴酶、供體底物和受體底物的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法。在這些方法中,酶和底物之間的距離通常在約10 nm以內(nèi),適用于直接接觸的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用研究。

在“通過依賴于細(xì)胞間接觸的分選酶催化標(biāo)記”(labeling immune partnerships by sortagging intercellular contacts, LIPSTIC)的方法中,研究開發(fā)了一種工程化改造的金黃色葡萄球菌的分選酶A(sortase A, SrtA),并將其通過基因工程技術(shù)融合到細(xì)胞表面配體上。在配體-受體相互作用后,SrtA可以催化含生物素的分選肽(LPETG肽)轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞表面表達(dá)N-末端甘氨酸(G3或G5)受體肽的互補(bǔ)受體上(Fig.1D)[4, 39]。這種使用小肽作為底物的方法易于捕獲瞬時(shí)的配體-受體相互作用,并在體外和體內(nèi)都有成功的應(yīng)用。有研究報(bào)道,LIPSTIC可用于在體內(nèi)外T細(xì)胞活化過程中檢測樹突狀細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間的相互作用。證明LIPSTIC是一種高效、特異性,可以用于體外和體內(nèi)以酶促方式標(biāo)記細(xì)胞間相互作用的方法[4],在免疫學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。但是這種方法依賴基因工程技術(shù)改造細(xì)胞,操作復(fù)雜,并不是通用的方法。

由于野生型SrtA只能標(biāo)記通過基因工程操作而具備在細(xì)胞表面表達(dá)N-末端甘氨酸受體肽的細(xì)胞,因此,一種類似的基于分選酶催化的方法被開發(fā)出來。該方法通過設(shè)計(jì)一種定向進(jìn)化后的SrtA突變體(SrtA variant, mgSrtA)來催化標(biāo)記相互作用細(xì)胞表面蛋白質(zhì)上的N-末端單甘氨酸殘基,從而在LIPSTIC的基礎(chǔ)上進(jìn)行了擴(kuò)展。由于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)上暴露的N-末端單甘氨酸殘基比三甘氨酸豐富得多,因此不需要預(yù)先處理“獵物”細(xì)胞,這提供了一種標(biāo)記細(xì)胞間相互作用的通用方法[5]。

2.5 基于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

盡管已經(jīng)開發(fā)了很多基于酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記方法,但大多都需要通過基因工程進(jìn)行額外的細(xì)胞操作來引入標(biāo)記酶,這將會(huì)阻礙這些方法在研究細(xì)胞間相互作用方面的廣泛應(yīng)用。因此,研究者們也對(duì)此進(jìn)行了優(yōu)化,開發(fā)出了一種依賴于相互作用的巖藻糖基生物素化標(biāo)記方法(interaction-dependent fucosyl-biotinylation, FucoID),適用于研究直接接觸的細(xì)胞間相互作用。該方法克服了需要通過遺傳學(xué)操作的限制,它是通過使用無基因工程策略——化學(xué)酶方法,將來自于幽門螺旋桿菌的α(1,3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase, FT)與其天然底物GDP-巖藻糖[40, 41]進(jìn)行偶聯(lián),然后通過自催化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了FT在“誘餌”細(xì)胞表面N-乙酰-D-乳糖胺(N-acetyl-D-lactosamine, LacNAc)和/或α(2,3)-唾液酸LacNAc上的定位附著,該方法克服了需要通過遺傳學(xué)操作的限制。然后FT會(huì)催化其底物GDP-巖藻糖-生物素轉(zhuǎn)移到“獵物”細(xì)胞表面的LacNAc上,實(shí)現(xiàn)鄰近細(xì)胞生物素化標(biāo)記,以此來鑒定“誘餌”細(xì)胞和“獵物”細(xì)胞之間的相互作用(Fig.1E)。

LacNAc是一種常見的位于細(xì)胞表面的二糖,由于LacNAc和唾液酸化LacNAc在大多數(shù)細(xì)胞類型中均存在大量表達(dá)[17, 42],因此,該標(biāo)記方法具有普遍適用性,可以實(shí)現(xiàn)在2個(gè)相互作用細(xì)胞間的高靈敏度標(biāo)記。

已有研究使用抗原引發(fā)的偶聯(lián)了FT的樹突細(xì)胞,證明了FucoID可以從小鼠腫瘤模型中成功鑒定和分離出內(nèi)源性腫瘤抗原特異性T細(xì)胞[17]。此外,通過這種方法分離得到的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞,顯示出更高的腫瘤殺傷力及與T細(xì)胞活化相關(guān)的基因表達(dá)譜的增加,突出了這種方法具有從腫瘤微環(huán)境中直接獲得腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞用于下游治療應(yīng)用的潛力。但是,在從臨床樣本中無法分離富集得到所需的“誘餌”細(xì)胞時(shí),這種方法無法探測特異性的CCIs。

近期另有研究表明,利用FT的定點(diǎn)化學(xué)偶聯(lián)開發(fā)了位點(diǎn)特異性細(xì)胞-酶偶聯(lián)體探針(site-specific cell-based fucosy-ltransferase conjugate, Cell-sFT)和抗體-酶偶聯(lián)體探針(site-specific antibody-based fucosyltransferase conjugate, Ab-sFT),以使FucoID能夠應(yīng)用于更廣泛的細(xì)胞環(huán)境[42]。研究發(fā)現(xiàn),Cell-sFT不僅可以用于探測DC-T細(xì)胞相互作用,還可以應(yīng)用于探測癌細(xì)胞-T細(xì)胞以及DC-B細(xì)胞相互作用。這些CCIs受嵌合抗原受體-抗原相互作用、程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)-程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1, PD-L1)相互作用或未知的相互作用分子對(duì)控制。此外,使用新開發(fā)的Ab-sFT,以內(nèi)源性癌細(xì)胞作為“誘餌”細(xì)胞,在人類患者臨床樣本中實(shí)現(xiàn)了FucoID。對(duì)FucoID鑒定出的未知CCIs系統(tǒng)中的“獵物”細(xì)胞,通過RNA-seq或流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)行表征,以剖析不同的分子特征,為研究復(fù)雜系統(tǒng)中更廣泛的CCIs開辟了道路。

2.6 基于β-半乳糖苷酶的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法

為了拓展研究不需要直接接觸的細(xì)胞間相互作用,近期開發(fā)了一種被稱為亞甲基醌輔助細(xì)胞空間組織識(shí)別鑒定(quinone methide-assisted identification of cell spatial organization, QMID)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法[18],該方法利用一類具有微米級(jí)標(biāo)記半徑的反應(yīng)性親電子物質(zhì)——亞甲基醌(quinone methide, QM),它可以由β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, βGal)[43-45]酶促脫籠反應(yīng)原位生成。生成的QM在微米半徑范圍內(nèi)擴(kuò)散,并可以共價(jià)標(biāo)記鄰近細(xì)胞上的膜蛋白質(zhì)。

利用識(shí)別人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)的納米抗體ZHER,構(gòu)建一種嵌合酶ZHER-βGal并靶向定位到HER2陽性細(xì)胞上,βGal能夠?qū)FQM-生物素和gFMeQM-生物素轉(zhuǎn)化為QM-生物素和MeQM-生物素,從而有效地標(biāo)記“誘餌”細(xì)胞和鄰近“獵物”細(xì)胞(Fig.1F)。此外,在共培養(yǎng)體系中,應(yīng)用QMID對(duì)與腫瘤細(xì)胞鄰近的巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn),其多種基因的表達(dá)受到2種細(xì)胞的鄰近性的顯著調(diào)控。也能將QMID與scRNA-seq結(jié)合,系統(tǒng)地對(duì)小鼠脾中CD4+和CD8+T細(xì)胞的鄰近細(xì)胞進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,鄰近CD8+T細(xì)胞的成熟的樹突細(xì)胞中脂質(zhì)分解代謝過程和WNT信號(hào)通路均上調(diào)[18]。QMID方法標(biāo)記效率高、適用于各種類型樣品,提供了一種分析各種生物系統(tǒng)中細(xì)胞空間組織的通用方法。

但是在QMID的方法中,由于βGal是通過抗體引入。因此,QMID 僅適用于表面具有特定表位的細(xì)胞類型。

3 問題與展望

綜上,酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法借助基因工程操作在細(xì)胞表面上表達(dá)外源酶,或通過化學(xué)酶法在細(xì)胞表面上偶聯(lián)酶后與其受體底物結(jié)合,或催化供體底物產(chǎn)生高反應(yīng)活性標(biāo)記分子,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間鄰近標(biāo)記。這些方法由于酶和底物之間直接的物理接觸或酶催化產(chǎn)生高反應(yīng)活性標(biāo)記分子,因此,可以實(shí)現(xiàn)小的標(biāo)記半徑范圍。但是,由于大多需要借助基因工程技術(shù)引入標(biāo)記酶和/或受體底物,這可能會(huì)使得一些方法只適用于某些適合工程化改造的細(xì)胞系。因此,也出現(xiàn)了可以繞過此限制的新的標(biāo)記方法,例如FucoID、mgSrtA。除此之外,還有克服依賴“誘餌”細(xì)胞和“獵物”細(xì)胞緊密接觸的方法,例如QMID。

在產(chǎn)生高反應(yīng)活性標(biāo)記分子的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法中,例如像APEX,由于H2O2的毒性,其在體內(nèi)的應(yīng)用受到限制;HRP方法僅限于分泌途徑和細(xì)胞外機(jī)制研究;而BioID標(biāo)記效率低導(dǎo)致時(shí)間分辨率差;TurboID雖然催化活性高,但是它也由于生物素親和力高,標(biāo)記窗口的控制可能較少。而在依賴酶、供體底物和受體底物之間直接的物理接觸的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法中,例如LIPSTIC、PUP-IT和FucoID的方法,由于其底物特異性,依賴基因工程技術(shù)改造細(xì)胞或依賴于相互作用細(xì)胞直接接觸,只適用于接觸依賴性的細(xì)胞間相互作用的研究。而在QMID的方法中,雖然研究不需要直接接觸的細(xì)胞間相互作用,但是βGal是通過抗體引入的,以這種方式,QMID僅限于具有特定表面表位的細(xì)胞類型。

不同酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),因此,酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法仍需進(jìn)一步改進(jìn),未來需要開發(fā)更為通用、簡便、高效特異的方法,更加精準(zhǔn)探測細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用。

眾所周知,糖基化是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,可發(fā)生在至少50%哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)上[46, 47]。糖基化產(chǎn)生了豐富、多樣和高度調(diào)控的細(xì)胞聚糖,這些聚糖經(jīng)常附著在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上。細(xì)胞表面的糖蛋白在細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,正如開發(fā)出的FucoID那樣,對(duì)活細(xì)胞表面的糖蛋白進(jìn)行特定修飾可用于探究細(xì)胞間相互作用,并有助于未來的疾病診斷和治療[17, 42]。細(xì)胞表面糖蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),許多類型的糖蛋白被證實(shí)能作為診治癌癥的靶標(biāo)。例如,唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素家族(sialic acid binding Ig like lectin, Siglecs)可以通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的唾液酸(sialic acid, Sia)來介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用,從而在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[48, 49],未來有望開發(fā)一種利用Siglec和Sia之間特異性相互作用的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法。此外,研究者們旨在尋找一種可以快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測腫瘤的新型生物標(biāo)志物,試想未來可以著重探索更多與細(xì)胞表面特定糖蛋白識(shí)別的酶,拓展開發(fā)出新的酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法,靶向識(shí)別相互作用細(xì)胞,提高檢測細(xì)胞間相互作用的時(shí)空分辨率,更為深入全面地理解癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,期望可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療癌癥。

在免疫細(xì)胞的細(xì)胞間通訊中,B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dendritic cells, DCs)和巨噬細(xì)胞都能攝取和加工處理抗原,并且可以將抗原信息暴露在細(xì)胞表面,以便呈遞給其他免疫細(xì)胞,因此,這些細(xì)胞統(tǒng)稱為抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的主要效應(yīng)細(xì)胞,在免疫反應(yīng)中產(chǎn)生細(xì)胞因子以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)其他類型的免疫細(xì)胞[50, 51]。免疫反應(yīng)的激活依賴于抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞之間的相互作用,對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的檢測和表征,對(duì)于理解免疫反應(yīng)以及開發(fā)新的免疫療法至關(guān)重要。酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法可以發(fā)揮其高靈敏度和特異性的優(yōu)勢來標(biāo)記檢測免疫細(xì)胞間的相互作用。甚至可以進(jìn)一步將酶介導(dǎo)的鄰近細(xì)胞標(biāo)記方法應(yīng)用于臨床研究,高效鑒定特異性識(shí)別腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞,為開發(fā)新的免疫治療策略提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

盡管目前已經(jīng)報(bào)道了很多研究CCIs的方法,但是探測細(xì)胞之間的相互作用仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。由于突觸形成的空間限制和所涉及的細(xì)胞類型較多,這對(duì)于在這種環(huán)境中特異性地識(shí)別細(xì)胞間相互作用帶來了巨大的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)今,研究者仍在不斷地?cái)U(kuò)展開發(fā)新型的鄰近標(biāo)記方法,以進(jìn)一步提高在探測細(xì)胞接觸區(qū)域的時(shí)空分辨率。