李 藝, 溫藝紅, 伍華燕, 姜佳雪, 歐 濤, 陳凱茵, 劉宇鵬, 單志新*

(1)南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部廣東省臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510080;2)華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 廣州 510006;3)南方醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)心內(nèi)科, 廣州 510080)

心肌肥厚是心臟在受到長(zhǎng)期壓力負(fù)荷后的代償反應(yīng),可分為生理性或病理性肥厚,其特征為心肌細(xì)胞的體積增加和結(jié)構(gòu)改變,并伴隨著心肌收縮力的提高[1]。生理性心肌肥厚通常是由于體育鍛煉等正常生理刺激所導(dǎo)致[2],而病理性心肌肥厚則與心血管病理性改變緊密相關(guān),增加心衰(heart failure, HF)和其他嚴(yán)重心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。因此,深入研究心肌肥厚發(fā)生的病理機(jī)制將為心肌肥厚和心衰的治療研究提供科學(xué)依據(jù),具有重要意義。

長(zhǎng)非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子,與mRNA不同,lncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)功能,但它們對(duì)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控發(fā)揮重要作用[6]。研究表明,lncRNA通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和細(xì)胞周期發(fā)揮重要生物學(xué)功能[7-9],與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10,11]。研究lncRNA參與疾病發(fā)生的作用機(jī)制,為探尋潛在的疾病治療靶點(diǎn)提供新的視角[12-14]。

丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是糖酵解中的關(guān)鍵酶[15],其參與催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,同時(shí)產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)為細(xì)胞供能[16,17]。哺乳動(dòng)物中主要有肌型丙酮酸激酶和肝型丙酮酸激酶。肌型丙酮酸激酶(pyruvate kinase muscle,PKM)包括PKM1和PKM2兩種亞型[18]。PKM1主要分布于對(duì)能量需求較大的肌肉組織中,而PKM2分布更為廣泛,它在胚胎發(fā)育、腫瘤細(xì)胞和某些成年組織中都有表達(dá)[19,20]。鑒于PKM2對(duì)能量代謝和生長(zhǎng)的調(diào)控作用具有多樣性和復(fù)雜性,研究PKM2在細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制,將有助于加深對(duì)于疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)[21,22]。

課題組前期研究證實(shí),lncRNA RP11-879F14.2能夠與PTBP1(polypyrimidine tract binding protein 1,PTBP1)相互作用來(lái)發(fā)揮抑制人心房肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用[23],而RP11-879F14.2對(duì)心肌肥厚是否具有調(diào)控作用及其可能機(jī)制尚不清楚。本研究利用原代分離培養(yǎng)乳小鼠心室肌細(xì)胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes, NMVCs)和乳大鼠心室肌細(xì)胞(neonatal rat ventricular cardiomyocytes, NRVCs),利用重組腺病毒載體介導(dǎo)表達(dá)RP11-879F14.2,探究RP11-879F14.2對(duì)心肌細(xì)胞肥大表型的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

利用HF患者和健康器官捐獻(xiàn)者的心肌組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析和RP11-879F14.2表達(dá)的定量PCR檢測(cè)。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)No.GDREC2019238H(R1)),手術(shù)標(biāo)本來(lái)源:廣東省心血管病研究所,病例資料同以往報(bào)道。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生(1～3日齡)SPF級(jí)C57BL/6乳小鼠,新生(1～3日齡)SPF級(jí)Sprague dawley(SD)乳大鼠,雌雄不限,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCXK(粵)2022-0002。

1.3 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(ZETA LIFE);胰蛋白酶(0.25 % Trypsin-EDTA)和DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco);去氧腎上腺素(phenylephrine,PE)(Sigma Aldrich);iFluorTM647標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(Yeasen);4×SDS 加樣緩沖液(loading Buffer)(TaKaRa);預(yù)混型qPCR試劑盒(2×STBR Green Premix)和逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(Evo M-MLV RT Premix)(Accurate Biology);RIPA蛋白質(zhì)裂解液(Beyotime);蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(碧云天);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific);線粒體壓力測(cè)試試劑盒(Agilent);PVDF膜(Millipore);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(TINYA BIOTECH);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara);Trizol裂解液和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine(Invitrogen);兔抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)抗體(abcam);兔抗骨骼肌肌動(dòng)蛋白抗體α1(skeletal muscle actin alpha 1,ACTA1)抗體、鼠抗GAPDH抗體(Protein Technology);兔抗心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)抗體(Bioworld);PCR引物由廣州睿博公司合成(Table 1)。

1.4 C57BL/6乳小鼠和SD乳大鼠心肌細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)和處理

取新生1～3日齡的SPF級(jí)C57BL/6乳小鼠或SD乳大鼠心臟置于高壓滅菌后預(yù)冷的PBS溶液中,修剪心臟周?chē)难芙M織及擠壓心腔內(nèi)殘留的血液,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,加入5 mL胰蛋白酶(0.25 % trypsin-EDTA)和7 mL預(yù)冷的PBS,4 ℃、70 r/min水平震蕩消化過(guò)夜。次日,仍可見(jiàn)完整的心組織,加入10 % F12完全培養(yǎng)基終止消化后留取心組織,加入7 mL無(wú)血清F12和70 μL膠原酶II,37 ℃、70 r/min水平震蕩10 min,用巴士管吹打直至組織完全消化,立即用完全培養(yǎng)基終止消化,用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾,300 ×g離心5 min,棄上清,用完全培養(yǎng)液重懸沉淀,轉(zhuǎn)移至T75瓶中,置于37 ℃、5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5～2 h,進(jìn)行差速貼壁,未貼壁的即為乳鼠心肌細(xì)胞,將分離的乳鼠心肌細(xì)胞懸液均勻鋪于預(yù)先用鼠尾膠原I包裹的12孔板,待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)24 h,用PBS清洗細(xì)胞,更換新的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后處理。

Table 1 The PCR primer sequences

1.5 RT-qPCR檢測(cè)

使用Trizol法從人心肌組織或NMVCs樣本中提取總RNA。取1 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(Evo M-MLV RT Premix)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,利用Vii7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)進(jìn)行qPCR檢測(cè)RP11-879F14.2以及MYH7、Acta1、PKM2和NPPA等基因表達(dá)水平。以Actb作為檢測(cè)的內(nèi)參對(duì)照基因。以2-ΔΔCt或2-ΔCt法計(jì)算檢測(cè)基因的表達(dá)水平。所用引物序列見(jiàn)Table 1。

1.6 Western 印跡檢測(cè)

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完成后去掉培養(yǎng)基,每孔細(xì)胞加500 μL高壓滅菌后的PBS輕輕清洗2次,每次5 min,吸干PBS,加入適量提前配好的含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,4 ℃靜置10 min待細(xì)胞充分裂解,刮取細(xì)胞裂解液至1.5 mL EP管中,全程保持4 ℃。提前預(yù)冷離心機(jī),刮取完成后置于離心機(jī)中并配平,離心條件:4 ℃,12 000 ×g,15～20 min,吸取上清,去除細(xì)胞沉淀。蛋白質(zhì)定量10 μg(用DEPC水或者RIPA裂解液補(bǔ)齊),加入4×SDS-PAGE 加樣緩沖液,金屬浴或水浴鍋中99 ℃蛋白質(zhì)變性10 min,10 % SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜。根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白質(zhì)大小裁下PVDF膜,利用對(duì)應(yīng)的特異性抗體β-MHC(1∶1 000)、ACTA1(1∶2 000)、ANP(1∶1 000)、和GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育過(guò)夜,第 2 d用TBST溶液漂洗3次,每次5 min,常溫孵育對(duì)應(yīng)二抗1 h,TBST溶液漂洗3次,每次5 min。使用LAS 500 GE-化學(xué)發(fā)光成像儀。Image J (National Institutes of Health(NIH)開(kāi)發(fā))對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析,采用目的蛋白質(zhì)/內(nèi)參的灰度值比值比較蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7 鬼筆環(huán)肽染色

將分離的NRVCs懸液均勻鋪于預(yù)先用鼠尾膠原I包裹的共聚焦皿,24 h后更換為無(wú)血清F12培養(yǎng)基同步化處理12 h,利用50 μmol/L PE 處理NRVCs 24 h,用RP11-879F14.2重組腺病毒感染處理24 h,棄去培養(yǎng)基,用PBS漂洗2次;加入500 μL 4 %多聚甲醛固定液,室溫靜置15～30 min,棄去多聚甲醛固定液,PBS漂洗2次,每次5 min;加入500 μL 0.1 % TritonX-100透化液,室溫靜置5 min,棄去透化液,PBS漂洗2次;每個(gè)共聚焦皿中加入500 μL新鮮配置的鬼筆環(huán)肽工作液(1 mL 1 % BSA溶液加入1 μL 1 000×iFluorTM647標(biāo)記鬼筆環(huán)肽),室溫避光染色60 min,PBS漂洗2次,每次5 min,滴入3滴DAPI封片劑,置于4 ℃避光保存,使用LSM 900 蔡司-激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.8 Seahorse檢測(cè)

Seahorse XF96能量代謝儀分析細(xì)胞能量代謝變化。將NMVCs接種于XF96孔細(xì)胞培養(yǎng)板穩(wěn)定生長(zhǎng)過(guò)夜,第2 d用重組腺病毒感染處理24 h,隨后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞外酸化速率(extracellular acidification rates, ECAR)。在ECAR檢測(cè)過(guò)程中,在3次檢測(cè)間隙依次加入10 mmol/L葡萄糖、1.0 μmol/L寡霉素和50 mmol/L 2-脫氧葡糖,加入寡霉素后的ECAR即為糖酵解能力。另外,檢測(cè)NMVCs的細(xì)胞氧耗速率(oxygen consumption rates, OCR)。在OCAR檢測(cè)過(guò)程中,在3次檢測(cè)間隙依次加入1.5 μmol/L寡霉素、2.0 μmol/L 線粒體解偶聯(lián)劑FCCP和0.5 μmol/L魚(yú)藤酮/抗霉素A(Rot/AA)。加入FCCP后的OCAR達(dá)到最大耗氧量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在GraphPad軟件上進(jìn)行。兩組間的數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法;多組間的數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法,組間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RP11-879F14.2在心衰患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)

麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)染色結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,HF患者心肌的心肌細(xì)胞面積顯著增大,大約增加2倍(P<0.01)(Fig.1A)。RT-qPCR結(jié)果顯示,相較于健康器官捐獻(xiàn)者,RP11-879F14.2在HF患者心肌組織中表達(dá)顯著升高,大約升高5倍(P<0.001)(Fig.1B)。

Fig.1 Up-regulation of RP11-879F14.2 in the myocardium of patients with heart failure (HF) (A) Representative images with WGA staining showed that the cross-sectional area of cardiomyocytes was increased in the myocardium of HF patients (WGA staining, scale bar=100 μm). (B) The expression of RP11-879F14.2 in the myocardium of healthy controls and heart failure patients was detected by RT-qPCR. Mean ± SD, n=3.**P<0.01 vs Vector group,***P<0.001

2.2 過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2抑制乳小鼠心肌細(xì)胞肥大表型

為探究RP11-879F14.2對(duì)生理情況下心肌細(xì)胞肥大表型的影響,本文利用重組RP11-879F14.2腺病毒感染NMVCs。在倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)充分的共表達(dá)的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP),顯示重組RP11-879F14.2腺病毒可有效感染NMVCs,進(jìn)一步的RT-qPCR結(jié)果證實(shí),RP11-879F14.2在NMVCs中表達(dá)顯著增加(Fig.2A),同時(shí)檢測(cè)到肥大相關(guān)基因MYH7、Acta1和NPPA的表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01)(Fig.2B)。Western 印跡結(jié)果顯示,在過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2的NMVCs中,心肌肥厚相關(guān)蛋白β-MHC、ACTA1以及ANP水平顯著降低(P<0.01,P<0.001)(Fig.2C)。利用去氧腎上腺素(PE)誘導(dǎo)NRVCs造成細(xì)胞肥大模型,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2可逆轉(zhuǎn)PE誘導(dǎo)NRVCs中心肌肥厚相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)(P<0.01,P<0.001)(Fig.2D),并抑制PE誘導(dǎo)的NRVCs表面積增加(P<0.01)(Fig.2E)。因此,以上結(jié)果顯示,RP11-879F14.2具有抑制心肌細(xì)胞中肥大相關(guān)基因表達(dá)和心肌細(xì)胞面積增加的作用。

Fig.2 Overexpression of RP11-879F14.2 inhibits the hypertrophic phenotype in NMVCs and in PE-induced NRVCs (A) Adenovirus-mediated efficient over-expression of RP11-879F14.2 in NMVCs. The infection of recombinant RP11-879F14.2 adenovirus (rAD-RP11-879F14.2) was monitored by the co-expressed marker of GFP; scale bar=100 μm. (B) The mRNA expression of Myh7, ACTA1 and NPPA was detected by RT-qPCR. (C) The protein expression of β-MHC, ACTA1 and ANP in NMVCs was determined by Western blot. (D) The protein expression of β-MHC, ACTA1 and ANP was suppressed in PE-induced NRVCs upon overexpression of RP11-879F14.2. (E) Morphological observation of NRVCs by Phalloidin-iFluor 647 staining assay revealed that overexpression of RP11-879F14.2 attenuated PE-induced nRVC hypertrophy (scale bar=20 μm). Mean±SD, n=3.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs Vector in B and C,**P<0.01,***P<0.001 vs Vector+vehicle in D and E,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001 vs Vector+PE in D and E

2.3 丙酮酸激酶同工酶M2介導(dǎo)RP11-879F14.2抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)

為進(jìn)一步探究RP11-879F14.2抑制心肌細(xì)胞肥大的具體機(jī)制,本文對(duì)健康器官捐獻(xiàn)者和心衰患者心肌組織的RNA樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,RNA-seq結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2可引起NMVCs中顯著的差異基因表達(dá)改變(Fig.3A)。進(jìn)一步的RT-qPCR和Western 印跡結(jié)果證實(shí),過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2的NMVCs中 PKM2表達(dá)顯著增加(P<0.01)(Fig.3B,3C)。在NMVCs中過(guò)表達(dá)PKM2和RP11-879F14.2可一致地抑制心肌肥厚相關(guān)蛋白β-MHC、ACTA1和ANP表達(dá)(P<0.05,P<0.01)(Fig.3D)。同時(shí),利用PE誘導(dǎo)NRVCs造成細(xì)胞肥大模型,證實(shí)過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2和PKM2可顯著下調(diào)PE誘導(dǎo)的NRVCs中心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)(P<0.01,P<0.001)(Fig.3E),并能有效逆轉(zhuǎn)PE誘導(dǎo)的NRVCs細(xì)胞面積增加(P<0.01)(Fig.3F)。

Fig.3 RP11-879F14.2 inhibits the hypertrophy-related genes via PKM2 (A) RNA-seq results reveals the differentially expressed genes. (B) PKM2 mRNA expression in NMVCs with over-expression of RP11-879F14.2 was detected by RT-qPCR with over-expression of RP11-879F14.2. (C) PKM2 protein expression in NMVCs with over-expression of RP11-879F14.2 was determined by Western blot. (D) The protein expression of β-MHC, ACTA1 and ANP in NMVCs was analyzed by Western blot. (E) The protein expression of β-MHC, ACTA1 and ANP was consistently inhibited in PE-induced NRVCs upon overexpression of RP11-879F14.2 and PKM2. (F) Morphological changes of NRVCs exposed to PE treatment were visualized by phalloidin-iFluor 647 staining. Overexpression of RP11-879F14.2 and PKM2 could markedly reverse PE-induced increase of cell size of NRVCs (scale bar=20 μm). (G) The protein expression of β-MHC, ACTA1, ANP and PKM2 in NMVCs was detected by Western blot assay. Mean ± SD, n=3.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs Vector in B, C and D,ΔΔP<0.01,ΔΔΔP<0.001 vs Vector +PE in E and F

利用針對(duì)小鼠PKM2 mRNA的小干擾RNA(small interfering RNA, si-RNA)抑制NMVCs中PKM2表達(dá)。Western印跡結(jié)果顯示,沉默NMVCs中PKM2表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)RP11-879F14.2抑制NMVCs中心肌肥厚相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的作用(P<0.001)(Fig.3G)。因此,以上結(jié)果顯示,RP11-879F14.2通過(guò)增加PKM2表達(dá)發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

2.4 過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2和丙酮酸激酶同工酶M2升高乳小鼠心肌細(xì)胞葡萄糖代謝能力

為明確RP11-879F14.2和PKM2對(duì)NMVCs中葡萄糖代謝的影響,本文利用Seahorse XF96細(xì)胞能量分析儀檢測(cè)了過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2和PKM2的NMVCs內(nèi)ECAR和OCR水平。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2與PKM2可一致增加了NMVCs的糖酵解(P<0.05,P<0.01)(Fig.4A,4B)和氧化磷酸化能力(P<0.05)(Fig.4C,4D)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,沉默PKM2表達(dá)對(duì)于RP11-879F14.2上調(diào)NMVCs中糖酵解相關(guān)基因(Glut1、Hk2、Ldha)、三羧酸(TCA)循環(huán)相關(guān)基因(Idh2)和線粒體電子傳遞鏈(ETC)相關(guān)基因(NDUFS1、ND、MT-CO2、SDHB、CYC1)的表達(dá)有顯著的抑制作用。因此,以上結(jié)果提示,PKM2通過(guò)增加心肌細(xì)胞的葡萄糖代謝能力來(lái)介導(dǎo)RP11-879F14.2發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

Fig.4 Overexpression of RP11-879F14.2 and PKM2 elevates the glucose glycolysis and oxidative phosphorylation of NMVCs Measurement of glucose glycolysis activity in NMVCs with over-expression of RP11-879F14.2 (A) and PKM2 (B) by ECAR assay. Measurement of extracellular acidification rate in NMVCs with over-expression of RP11-879F14.2 (C) and PKM2 (D) by OCR assay. MRNA expression of glycolysis-related genes (E), the tricarboxylic acid (TCA) cycle-related genes (F) and mitochondrial electron transport chain (ETC)-related genes (G) in NMVCs by RT-qPCR assay. Mean ± SD, n=3.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

心肌肥厚是心臟應(yīng)對(duì)多種生理和病理刺激時(shí)的代償性反應(yīng),以維持心血管的正常功能,而長(zhǎng)期的病理性心肌肥厚不加以干預(yù)和治療,將最終會(huì)導(dǎo)致心衰的發(fā)生[3-5]。本文發(fā)現(xiàn)RP11-879F14.2在HF患者心肌組織中表達(dá)升高,過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2可以顯著抑制NMVCs中心肌肥厚相關(guān)β-MHC、ACTA1和ANP表達(dá),而過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2也可以顯著抑制PE誘導(dǎo)NRVCs中心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞面積增加,因此,HF心肌中高表達(dá)的RP11-879F14.2具有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。進(jìn)一步通過(guò)RNA-seq篩選、RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)RP11-879F14.2可特異地增加NMVCs中PKM2表達(dá);功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PKM2介導(dǎo)RP11-879F14.2發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)的作用。

丙酮酸激酶作為糖酵解通路中的一個(gè)關(guān)鍵酶,在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24]。PKM1和PKM2是PKM的2種RNA可變剪切亞型,PKM1和PKM2都有共同的外顯子1～8、11～12,只有外顯子9和10導(dǎo)致最終轉(zhuǎn)錄本的差異(PKM2不含外顯子9)[25]。本文發(fā)現(xiàn)RP11-879F14.2可特異地增加PKM2剪切體水平,但具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究闡明。PKM2是一種重要的糖酵解酶,同時(shí)也具有非糖酵解功能[26]。PKM2在心肌重構(gòu)和心肌功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,但現(xiàn)有的相關(guān)報(bào)道存在不一致性[24, 27],而本文結(jié)果證實(shí)PKM2具有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。研究表明,心肌肥厚會(huì)伴隨發(fā)生心肌代謝重塑,其特征是脂肪酸氧化減少,葡萄糖攝取和糖酵解增加[28,29]。本文檢測(cè)了RP11-879F14.2和PKM2對(duì)NMVCs的葡萄糖代謝相關(guān)ECAR和OCR的影響,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2與PKM2可一致增加NMVCs的糖酵解和氧化磷酸化水平。定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,沉默PKM2表達(dá)對(duì)于RP11-879F14.2上調(diào)NMVCs中糖酵解相關(guān)基因、TCA循環(huán)相關(guān)基因和線粒體電子傳遞鏈相關(guān)基因表達(dá)有顯著的抑制作用。因此,本文揭示PKM2除了自身的促糖酵解作用,也可增加NMVCs的氧化磷酸化,相關(guān)深入的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上,本文證實(shí)RP11-879F14.2通過(guò)上調(diào)PKM2發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。后續(xù)我們將建立心肌特異表達(dá)RP11-879F14.2的轉(zhuǎn)基因小鼠,繼續(xù)在細(xì)胞和整體水平探究RP11-879F14.2通過(guò)PKM2抑制心肌肥厚的分子機(jī)制,并在整體動(dòng)物水平明確過(guò)表達(dá)RP11-879F14.2對(duì)小鼠心肌肥厚和心臟結(jié)構(gòu)、功能的影響,為開(kāi)展基于RP11-879F14.2的心肌肥厚治療研究提供科學(xué)依據(jù)和資料。