林結(jié)玲，周 熙，趙 昕，遆慧慧*

（1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

復(fù)方香薷水是一種中藥復(fù)方制劑，源于宋朝《太平惠民和劑局方》經(jīng)典驗方香薷飲，由9 種單味藥材組成，分別為生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻、甘草，其中皺葉香薷為君藥，廣藿香、紫蘇葉為臣藥，甘草、生姜為使藥［1］。復(fù)方香薷水臨床療效確切，可有效治療暑濕感冒、胃腸型感冒、急性胃腸炎、風(fēng)寒感冒等疾?。?］。復(fù)方香薷水現(xiàn)有研究多集中于臨床療效評價，其化學(xué)成分研究匱乏，同時活性成分及其作用機制不明確，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制單一，如謝婷［3］開發(fā)的一種測定復(fù)方香薷水中木香烴內(nèi)酯、麝香草酚、去氫木香內(nèi)酯、香荊芥酚和迷迭香酸含量的方法。然而中藥復(fù)方具有多成分多靶點的特征，單一成分含量表征難以全面反映復(fù)方香薷水的整體質(zhì)量，因此，復(fù)方香薷水的物質(zhì)基礎(chǔ)研究對闡明其藥理藥效和質(zhì)量控制具有重要意義。

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）是常用于中藥復(fù)方定性、定量分析的儀器，具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高與特異性強等優(yōu)點，可用于中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)、成分含量、血清藥物化學(xué)、藥代動力學(xué)以及代謝組學(xué)等多方面研究［4-5］。本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)對復(fù)方香薷水進行定性分析，并對鑒定成分進行藥材歸屬，為其質(zhì)量控制指標(biāo)篩選、安全性評價以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

UPLC-Q-TOF MS儀，配備電噴霧離子源，紫外檢測器，以及數(shù)據(jù)處理工作站Mass Hunter 10.0（美國Agilent 公司）；KQ2200 型機械超聲波清洗器（東莞市超聲波設(shè)備有限公司）；電子天平（美國Sartorious公司）。

對照品：鳥苷、水蘇堿、咖啡酸購自中國食品藥品檢定研究院；迷迭香酸、原兒茶素、木犀草素-7-葡萄糖醛酸、維采寧-2、7-羥基香豆素、新甘草苷、芹菜素-7-葡萄糖醛酸、新異甘草苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草素-7-二葡萄糖苷酸購自上海源葉生物科技有限公司；木犀草苷、芹菜素、甘草酸、紫丁香苷、丹參素、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、檸檬酸、L-焦谷氨酸、甘草苷、異綠原酸C 購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；蘋果酸購自壇墨質(zhì)檢科技有限公司。所有對照品的純度均大于98%。

甲醇、乙醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二次蒸餾水（中國香港屈臣氏公司）。

復(fù)方香薷水及其單味藥材生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻、甘草購自廣州一品紅制藥有限公司。

1.2 樣品制備

復(fù)方香薷水單味藥材粉碎過篩，各取0.5 g 至20 mL 50%甲醇水溶液，超聲30 min，離心（時間：10 min，轉(zhuǎn)速：10 000 r/min，溫度：20 ℃），取上清液過濾裝瓶。復(fù)方香薷水用50%甲醇稀釋10倍。

取上述對照品各稱取10 mg左右加入到10 mL容量瓶中，再加入50%甲醇溶解并定容至刻度線，作為對照品儲備液。其中同分異構(gòu)體綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸和甘草苷、異甘草苷、新甘草苷、新異甘草苷分別稀釋成1 mg/L的單標(biāo)，其他的標(biāo)樣制成1 mg/L的混標(biāo)。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Phe Hex（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相；梯度洗脫：0～5 min，5%～10% B；5～20 min，10%～30% B；20～35 min，30%～40% B；35～55 min，40%～60% B；55～60 min，60%～75% B；60～65 min，75% B，體積流量為0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：UPLC-Q-TOF MS/MS系統(tǒng)，配置ESI 離子源。毛細(xì)管電壓為1000V，霧化氣壓0.24 MPa，干燥氣流速8 L/min，干燥氣溫度300 ℃。在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，碰撞能量為10、20、40 eV，一級質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1000，二級質(zhì)譜掃描范圍：m/z40～1000。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對于有對照品的化學(xué)成分，通過比對對照品的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜圖等信息進行確認(rèn)。對于無對照品的化合物，采用Mass Hunter 10.0 軟件提取其一級精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片，結(jié)合Pubchem 與安捷倫中藥化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫以及查閱文獻進行定性分析。對存在于總離子流圖（TIC 圖），但在數(shù)據(jù)庫上找不到匹配的化合物，可通過分子式以及二級離子碎裂規(guī)律推測其可能結(jié)構(gòu)，結(jié)合Pubchem數(shù)據(jù)庫進一步鑒定確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

本研究利用現(xiàn)代分析技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫和文獻，對復(fù)方香薷水的化學(xué)成分進行定性分析。實驗前期對前處理和色譜條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，前處理優(yōu)化包含優(yōu)化溶劑種類，超聲時間以及離心時間；色譜條件則通過優(yōu)化色譜柱、流動相、流動相pH、流速、柱溫及洗脫梯度，篩選出最佳實驗方案。其中溶劑考察了50%甲醇-水、75%甲醇-水及甲醇對分離分析的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用50%甲醇稀釋的色譜圖峰信息多、峰響應(yīng)值高，故選擇50%甲醇作為溶劑。其他優(yōu)化實驗條件見“1.2”和“1.3”。

2.2 成分分析與鑒定

采用UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)，在優(yōu)化后的儀器條件下對復(fù)方香薷水稀釋液進行分析，Mass Hunter 10.0軟件處理采集數(shù)據(jù)，得到其正、負(fù)離子模式下的TIC圖（見圖1）。最終鑒定出112個化合物，包含25個對照品的確認(rèn)。其中黃酮類22個，苯丙素類20個、有機酸18個、萜類14個、生物堿11個、氨基酸5個以及其他類型化合物22個（見表1）。

表1 UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)鑒定復(fù)方香薷水中的化學(xué)成分Table 1 Identification of chemical constituents from Fu Fang Xiang Zuo Shui by UPLC-Q-TOF MS 12

圖1 復(fù)方香薷水的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Fu Fang Xiang Zuo Shui

2.2.1 黃酮類化合物黃酮類是皺葉香薷、廣藿香和紫蘇葉的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗抑郁、抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）和α-葡萄糖苷酶活性等藥理作用［6-8］。黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為基本母核的一類化合物，包含黃酮苷元與黃酮苷。本研究從復(fù)方香薷水中共鑒定出22個黃酮類化合物，根據(jù)結(jié)合的糖數(shù)量可以分為苷元、單糖苷、雙糖苷。這些化合物主要以芹菜素木犀草素和甘草素為苷元，與葡萄糖、葡萄糖醛酸或芹糖結(jié)合成糖苷。

2.2.1.1 黃酮苷元 黃酮苷元質(zhì)譜特征碎片產(chǎn)生主要是由于C 環(huán)發(fā)生斷裂（逆-狄爾斯-阿德爾反應(yīng)），繼續(xù)丟失中性片段CO（28 u）、CO2（44 u）、H2O（18 u）形成。例如峰85 的準(zhǔn)分子離子峰為m/z287.0555［M+H］+，分子式為C15H10O6，失去一個水分子得到碎片離子m/z269.0483［M+H-H2O］+，失去一個CO 后得到m/z241.0559［M+H-H2O-CO］+。C 環(huán)發(fā)生斷裂，生成特征碎片m/z135.0437［M+HC7H4O4］+和m/z153.0179［M+H-C8H5O2］+，再失去CO、H2O 小分子生成離子碎片m/z125.0240［M+HC8H5O2-CO］+和m/z117.0344［M+H-C7H4O4-H2O］+。根據(jù)對照品保留時間、分子離子峰、二級特征碎片對比確認(rèn)，確定該峰為木犀草素，其裂解規(guī)律如圖2所示。

圖2 木犀草素的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.2 Fragmentation process of luteoli

2.2.1.2 黃酮單糖苷 復(fù)方香薷水的黃酮單糖苷是O-苷類化合物，在正離子模式下糖基易斷裂生成豐度較高的苷元。如峰65、67、84 的準(zhǔn)分子離子峰都為m/z463.088 5，分子式為C21H18O12，失去葡萄糖醛酸基（176 u），產(chǎn)生特征碎片m/z287.053 9［M+H-C6H8O6］+，通過文獻［9-10］和數(shù)據(jù)庫對比初步鑒定為木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷或其同分異構(gòu)體，經(jīng)過對照品比對最終確定峰65、67、84為野黃芩苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷和木犀草素-3'-葡萄糖醛酸苷。

峰60、63、79、83在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z417.118 8，推測其分子式為C21H22O9。4個化合物的裂解情況相同，先丟失一個葡萄糖苷基C6H10O5（162 u），生成高豐度碎片離子m/z255.066 1［M-H-C6H10HO5］-，再發(fā)生RDA 裂解，生成黃酮類特征碎片m/z119.050 2 和m/z135.009 0［M-HC6H10HO5-C8H9O］-，結(jié)合文獻和數(shù)據(jù)庫推測其為甘草苷或其同分異構(gòu)體［11］，通過與對照品對比最終確定峰60、63、79、83分別為新甘草苷、甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷，裂解規(guī)律見圖3。

圖3 甘草苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.3 Fragmentation process of liquiritin

2.2.1.3 黃酮雙糖苷 本研究共鑒定出甘草苷元-7-O-D-芹糖-4'-O-D-葡萄糖苷、夏佛托苷、芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-二葡萄糖醛酸和木犀草素7-二葡萄糖苷酸5 個黃酮雙糖類物質(zhì)。黃酮雙糖苷的取代主要發(fā)生在6、7 和8 位，包含五碳糖和六碳糖，裂解方式主要為連續(xù)丟失糖基，形成豐度較高的苷元，如峰61在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z623.124 8，連續(xù)丟失兩個葡萄糖醛酸基，生成m/z447.097 6［M+H-C6H8O6］+、m/z271.060 0［M+H-C6H8O6-C6H8O6］+，根據(jù)碎裂規(guī)律推測和對照品對比確認(rèn)該峰為芹菜素-7-二葡萄糖醛酸，裂解規(guī)律如圖4所示。

圖4 芹菜素-7-二葡萄糖醛酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.4 Fragmentation process of apigenin-7-diglucuronide

2.2.2 苯丙素類化合物苯丙素是由苯環(huán)和三個直鏈碳連接在一起為結(jié)構(gòu)單元（C6-C3）的化合物，包含苯丙酸、香豆素和木質(zhì)素類［12］，該類化合物易丟失CO、CO2、H2O 小分子。本研究共鑒定出20 個苯丙素類化合物，其中迷迭香酸、厚樸酚、7-羥基香豆素、咖啡酸、綠原酸、丹參素、隱綠原酸、新綠原酸等化合物經(jīng)對照品對比得到確認(rèn)。如峰26在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z353.087 5，分子式均為C16H18O9。在碰撞能作用下酰氧鍵易斷裂，丟失C9H6O3、C7H10O5片段，生成m/z191.054 4［M-HC9H6O3］-和m/z179.033 9［M-H-C7H10O5］-二級碎片，繼續(xù)丟失一分子CO2生成135.045 7［M-H-C7H10O5-CO2］-，經(jīng)過與對照品的保留時間和二級碎片規(guī)律對比，鑒定出該化合物為新綠原酸，質(zhì)譜裂解規(guī)律如圖5所示。峰33、37與26分子式相同，且二級碎片的碎裂規(guī)律相同，推測為同分異構(gòu)體，經(jīng)過對照品對比確認(rèn)峰33為綠原酸，峰37為隱綠原酸。

圖5 迷迭香酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.5 Fragmentation process of rosmarinic acid

峰72經(jīng)過與對照品的保留時間和二級碎片對比，確認(rèn)該峰為迷迭香酸。迷迭香酸是紫蘇葉的重要活性成分，具有抗過敏、抗氧化、抗抑郁、鎮(zhèn)驚等作用。該化合物在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z359.078 0，預(yù)測分子式為C18H16O8。在碰撞能作用下，生成m/z197.045 3［M-H-C9H6O3］-、m/z179.034 6［M-H-C9H8O4］-，前者丟失-COO 和H2O形成m/z135.045 1［M-H-C9H6O3-COO-H2O］-，后者丟失一分子H2O后生成m/z161.024 1［M-H-C9H8O4-H2O］-（如圖6）。

圖6 新綠原酸質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.6 Fragmentation process of neochlorogenic acid

2.2.3 萜類化合物本研究共鑒定出14 個萜類化合物，其中半萜類3 個，三萜皂苷類11 個，半萜類化合物來自木香，三萜皂苷類化合物來自甘草，萜類化合物易丟失糖基和中性小分子。如峰103，其在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z823.412 2，分子式C42H62O16，裂解途徑如圖7。先丟失葡萄糖醛酸基和中性小分子H2O，生成碎片m/z647.378 8［M-C6H8O6+H］+、m/z471.343 8［M-2C6H8O6+H］+、m/z453.335 6［M-2C6H8O6-H2O+H］+，質(zhì)譜信息經(jīng)文獻［13］及對照品對比，確定該峰為甘草酸（如圖7）。

圖7 甘草酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.7 Fragmentation process of glycyrrhizic acid

2.2.4 有機酸類化合物本研究從復(fù)方香薷水中共鑒定出有機酸類成分18個，包含蘋果酸、檸檬酸、原兒茶酸、丁香酸、茉莉酸等。該類化合物主要丟失H2O、HCOOH 等中性分子或COO 基團［14］。如峰23 在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z153.018 9，推測其分子式為C7H6O4，二級碎片為m/z109.029 4［M-H-COO］-、m/z108.022 2［M-H-COOH］-、m/z91.018 8［M-H-COO-H2O］-，與文獻［15］和對照品的碎裂規(guī)律一致，確定該峰為原兒茶酸（如圖8）。

圖8 原兒茶酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.8 Fragmentation process of protocatechuic acid

2.2.5 生物堿類化合物本研究共鑒定出了11 種生物堿，包含甜菜堿、水蘇堿、木蘭花堿、牛心果堿、巴婆堿、葫蘆巴堿等，該類化合物主要在正離子模式下響應(yīng)。在碰撞能作用下，含氮雜環(huán)易開裂，丟失CH3、CO 等中性小分子［16］。以峰34 為例，準(zhǔn)分子離子為m/z342.170 6，推測其分子式為C20H24NO4+。在能量碰撞下，含氮雜環(huán)發(fā)生兩種開裂，一種生成m/z45.057 1 和m/z297.111 4［MC2H7N］+碎片，后者丟失-CH3或者-OCH4，生成m/z265.086 2［M-C2H7N-CH4O］+和m/z282.087 2［MC2H7N-CH3］+；另一種環(huán)開裂生成m/z72.080 9 和m/z271.095 7［M-C4H10N］+，前者再丟失CH2，生成特征碎片m/z58.064 9，經(jīng)過與對照品對比后，確認(rèn)該成分為木蘭花堿，其質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖9。

圖9 木蘭花堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.9 Fragmentation process of magnolflorine

復(fù)方香薷水由生姜、木香、歪葉藍、皺葉香薷、廣藿香、紫蘇葉、厚樸、豆蔻和甘草9 種單味藥材組成，其成分種類包含黃酮類、苯丙素類、有機酸、萜類、生物堿、氨基酸類。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用靶點多樣，因此往往有多種藥理作用［17-21］，如復(fù)方香薷水中黃酮類成分的木犀草素可通過阻斷核因子kB（NF-kB）磷酸化活性或其信號通路進而抑制內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達，起到抗炎作用［22］；苯丙素類的厚樸酚可以促進胃動素和胃泌素分泌，抑制胃腸道平滑肌收縮，對胃排空和胃腸推進運動產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用［23］；萜類的木香烴內(nèi)酯可以通過調(diào)節(jié)Ki67、Bcl-2、Caspase-3、Bax 和PTEN 蛋白的表達，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，起到抗結(jié)腸癌作用［24］；黃酮類成分芹菜素、木犀草素、芹苷和木樨草苷等成分對甲型、乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶有較好的活性抑制［25］。復(fù)方香薷水還可用于由新型冠狀病毒肺炎引起的胃腸功能紊亂［26］，但是其作用機制尚未明確，因此今后還需要更深入探索其藥效成分以及作用機制。

3 結(jié) 論

本研究基于UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)分析鑒定復(fù)方香薷水的化學(xué)組成成分，最終鑒定出112 個化合物，包含黃酮類22 個，苯丙素類20 個、有機酸18 個、萜類14 個、生物堿11 個、氨基酸5 個以及其他類型化合物22個，并總結(jié)了化學(xué)成分的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，為其質(zhì)量控制、安全性評價以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。