宋春雷 俞磊 高文波 陳尚琛

摘要：基于選擇實驗動物時的差異性原則，對豚鼠、大鼠和小鼠的脾臟、胸腺、淋巴組織的形態(tài)以及其石蠟切片進(jìn)行比較研究，探討免疫器官的差異，為免疫相關(guān)實驗中實驗動物的選擇提供參考。方法 分別采集豚鼠、大鼠和小鼠的血液進(jìn)行血常規(guī)及血液生理生化檢測，采集脾臟、胸腺進(jìn)行形態(tài)和切片觀察比較。觀察血涂片可以看到豚鼠、大鼠和小鼠外周血液中免疫細(xì)胞有一定差別。根據(jù)血常規(guī)和血液生理生化檢測可見在部分指標(biāo)差異極顯著，部分指標(biāo)差異顯著。器官外觀以及石蠟切片分別有不同之處。

關(guān)鍵詞：豚鼠；大鼠；小鼠；免疫器官；對比研究

現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的教學(xué)、生產(chǎn)、研究活動無法離開實驗動物而展開，選擇適當(dāng)?shù)膶嶒瀯游飳τ趯嶒瀬碚f至關(guān)重要。而實驗動物的選擇一般都要遵守差異性原則，挑選合適的實驗動物，必須遵守差異性原則[1]。

基于此原則，對豚鼠和小鼠的免疫器官進(jìn)行比較研究，以期為免疫相關(guān)的研究選擇實驗動物時提供參考。

豚鼠血清中含有豐富的補(bǔ)體，免疫學(xué)實驗中補(bǔ)體來源大多為豚鼠，且豚鼠致敏反應(yīng)非常迅速，適合用于過敏反應(yīng)的研究。此外豚鼠相較于大鼠、小鼠最特殊的地方在于豚鼠和人類一樣自身無法合成機(jī)體所需的維生素C，必須通過食物獲得。大鼠的優(yōu)點是便于獲得也很容易獲得雜交的親代。而小鼠對外界環(huán)境變化及外來刺激敏感，被廣泛用于各種實驗。為探究三者之間的差異性，本研究采集豚鼠、大鼠與小鼠的脾臟、胸腺、淋巴結(jié)從形態(tài)特征等組織學(xué)特點入手進(jìn)行比較。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級豚鼠10只，3～4月齡；SPF級大鼠10只，2～3月齡；SPF級小鼠10只，3～4周齡。購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

主要使用試劑：酒精，二甲苯，固體石蠟，蘇木素染液，伊紅染液，中性樹膠，氨水。

主要儀器：生物組織包埋機(jī)（YD-6L，金華市益迪醫(yī)療有限公司），生物組織冷凍臺（YD-6L，金華市益迪醫(yī)療有限公司），切片機(jī)（LeicaRM2235，徠卡測量系統(tǒng)有限公司），組織漂片機(jī)（LeicaHI1210，徠卡測量系統(tǒng)有限公司），烘片機(jī)（LeicaHT1220，徠卡測量系統(tǒng)有限公司），光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)（BX43，Olympus），電子天平（FA1204B，上海天美天平儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1）采血。首先讓實驗動物吸入少量乙醚進(jìn)行麻醉。將動物固定于仰臥位置，消毒后將采集的血液分裝入EDTA試管中以血常規(guī)分析血常規(guī)；血液生理生化檢測所需血液量0.75 mL，將血液分裝入試管后使用離心機(jī)，轉(zhuǎn)速1 200 rpm，離心5 min，送檢。

2）免疫器官采樣。使用頸椎脫臼處死法，處死后的實驗動物測量體重數(shù)據(jù)并記錄。

將處死的實驗動物固定于操作臺，剃毛并消毒，沿腹中線剪開暴露腹腔。將脾臟完整取出并用生理鹽水洗凈后擦干，稱量并記錄。取一個腸系膜淋巴結(jié)用生理鹽水洗凈后擦干，裝入無菌袋中。豚鼠的胸腺位于頸部兩側(cè)，大鼠小鼠的胸腺位于胸腔上方，找到胸腺后小心將其取下，生理鹽水洗凈擦干后，稱重并記錄，完成后放入無菌袋中。

3）制作石蠟切片及蘇木精-伊紅染色。組織固定時間在8～24 h以內(nèi)；脫水需分別經(jīng)過75%、85%、95%、100%濃度的酒精。組織切片4 μm，染色。

4）統(tǒng)計學(xué)分析。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，血常規(guī)和血液生化檢測數(shù)值采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗，當(dāng)P＜0.05表示差異顯著，當(dāng)P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠、大鼠與小鼠血常規(guī)數(shù)值測定結(jié)果

血常規(guī)檢測結(jié)果主要與免疫功能有關(guān)，進(jìn)行免疫相關(guān)的實驗時可參考血常規(guī)數(shù)值。送檢后得到的血液常規(guī)數(shù)值測定結(jié)果如表1所示，差異不顯著的項目血紅蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目、單核細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比未展示。

2.2 豚鼠、大鼠與小鼠血液生理生化數(shù)值測定結(jié)果

送檢后得到的血液生理生化數(shù)值測定結(jié)果如表2所示，差異不顯著的項目鈣、堿性磷酸酶、總蛋白、甘油三酯、肌酐、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖未展示。

血液生理生化檢測的數(shù)值反映肝功能、腎功能等機(jī)體多方面的情況，不僅免疫相關(guān)的實驗，許多實驗都需要檢測血液生理生化的數(shù)值，是重要的檢測指標(biāo)。

2.3 豚鼠、大鼠與小鼠臟器系數(shù)的比較

實驗動物的臟器系數(shù)（臟器重量／體重×100％）是其主要的生物學(xué)特性之一，是實驗動物選擇的一個重要指標(biāo)。統(tǒng)計結(jié)果顯示豚鼠與小鼠脾的臟器系數(shù)有一定的差異，胸腺的臟器系數(shù)差異較大（表3）。

2.4 豚鼠、大鼠與小鼠脾臟比較

豚鼠、大鼠與小鼠的脾臟外觀在形狀、大小等差異較大。豚鼠的脾臟顏色為暗紅色，質(zhì)地柔軟，呈扁橢圓形（圖1A）；大鼠的脾臟顏色為暗紅色，質(zhì)地柔軟，呈長條形（圖1B）；小鼠的脾臟顏色為暗紅色，質(zhì)地柔軟，呈長條形。通過圖1D-F比較可見，豚鼠脾臟中白髓較大鼠、小鼠更少，紅髓分布更廣。

2.5 豚鼠、大鼠與小鼠胸腺比較

胸腺是中樞免疫器官，可分成兩葉，表面被膜由結(jié)締組織組成，并且結(jié)締組織伸入胸腺實質(zhì)將其分為一個個小葉，小葉分為皮質(zhì)和髓質(zhì)。皮質(zhì)由于胸腺細(xì)胞密集，導(dǎo)致著色較深；髓質(zhì)含較多上皮細(xì)胞，導(dǎo)致著色較淺。其中胸腺小體只分布在髓質(zhì)，是胸腺髓質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，直徑30～150 μm，隨機(jī)散在分布于胸腺髓質(zhì)。豚鼠的胸腺呈長條狀，位于頸部兩側(cè)，而大鼠小鼠胸腺呈不規(guī)則形，分為兩葉，位于胸腔上方；兩者都呈現(xiàn)脂肪組織的質(zhì)地，易與脂肪混淆。

2.6 豚鼠、大鼠與小鼠淋巴結(jié)比較

淋巴結(jié)表面有薄層致密結(jié)締組織構(gòu)成的被膜，被膜和門部的結(jié)締組織伸入淋巴結(jié)實質(zhì)形成相互連接的小梁。在小梁之間為淋巴組織和淋巴竇。淋巴結(jié)實質(zhì)分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分，二者無截然的界限。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

免疫是機(jī)體重要的生理功能，同時也是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要部分，而實驗動物的選擇很大程度上影響著研究的結(jié)果，根據(jù)項目研究的綜合因素合理地選擇實驗動物，是一個必需的步驟。豚鼠、大鼠、小鼠的免疫器官在各個方面有著不同的差異性，而這些差異性正為實驗動物的選擇提供參考[2-4]。

胸腺是機(jī)體主要的初級淋巴器官，也是T淋巴細(xì)胞的生長、發(fā)育、成熟和分化的場所，是機(jī)體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。胸腺穩(wěn)態(tài)對維持機(jī)體的免疫功能至關(guān)重要。胸腺小體是胸腺髓質(zhì)的特征性結(jié)構(gòu)，參與整個胸腺細(xì)胞發(fā)育、成熟過程和處理壞死細(xì)胞的場所，是胸腺正常免疫功能不可缺少的結(jié)構(gòu)。在衰老的進(jìn)程中，胸腺最先呈現(xiàn)出增齡性萎縮趨勢許多研究表明胸腺的發(fā)育與演化與年齡相關(guān)[5-6]，隨著年齡增大，皮質(zhì)/髓質(zhì)比隨之增加，并且胸腺會慢慢變性，由脂肪細(xì)胞演化胸腺組織間的橫隔，胸腺周圍可能出現(xiàn)脂肪細(xì)胞。小鼠相較于豚鼠更適合作為胸腺發(fā)育相關(guān)的模型，據(jù)研究表明胸腺發(fā)育在小鼠模型中最為典型[7-8]，胸腺系數(shù)是同齡段大鼠之間互相比較的一個較理想的分析指標(biāo)。

衰老是一個持續(xù)和緩慢的過程，影響了人類和動物中不同器官和系統(tǒng)的形態(tài)功能特征，也與免疫系統(tǒng)正常功能的下降有關(guān)。胸腺參與免疫衰老的確切機(jī)制還沒有被完全理解，已有研究證明胸腺被另一種白色脂肪組織取代了它的免疫功能。此外，胸腺脂肪呈現(xiàn)出與在其他白色脂肪組織中，如皮下脂肪組織中相似的細(xì)胞特征。

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，占全身淋巴細(xì)胞總量的25%。脾臟在胚胎時期具有造血功能、濾血功能、儲血功能，還是重要的抗感染免疫和抗腫瘤免疫器官。研究表明，若脾臟切除會增加多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險[9]。

小鼠淋巴結(jié)的組織結(jié)構(gòu)清晰，生發(fā)中心、皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯，與人類的淋巴結(jié)類似。小鼠局部淋巴結(jié)試驗是皮膚致敏性多種替代方法中應(yīng)用最廣全球標(biāo)準(zhǔn)方法， 但不同小鼠品系致敏反應(yīng)程度存在差異[10]。研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠極低蛋白質(zhì)的日糧會不斷減輕身體和脾臟重量，并使胸腺組織萎縮，從而對小鼠胸腺細(xì)胞分化、成熟產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而使外周血中T淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著減少，機(jī)體免疫功能下降。改為高蛋白日糧后，免疫活性可緩慢恢復(fù)，高蛋白日糧能從一定程度上改善低蛋白日糧對機(jī)體能量和物質(zhì)代謝的平衡損傷，減輕對小鼠和大鼠免疫器官的損傷，從而改善機(jī)體的體液免疫功能[11]。但另有研究證明，長期的高蛋白日糧飼喂在某些情況下對免疫功能會產(chǎn)生不利影響，從而抑制宿主抵抗力[12]。

3.2 結(jié)論

血涂片中可以看到豚鼠與小鼠之間白細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量上有顯著的差異，可根據(jù)這些差異判斷應(yīng)選擇哪種實驗動物。豚鼠外周血液中白細(xì)胞含量較多，推測是豚鼠致敏反應(yīng)速度較快的原因。

在血常規(guī)和血液生理生化檢測中，兩兩比較可見豚鼠和小鼠外周血液成分具有差異性；脾臟切片的對比可以看見兩者紅髓白髓分布具有差異性；胸腺切片的對比可以看見兩者胸腺雖然外形不一樣，但具有類似的結(jié)構(gòu)；對淋巴結(jié)切片的對比可以看見不僅是淋巴小結(jié)的數(shù)量，還有免疫細(xì)胞的數(shù)量和密度都存在差異性。

大鼠和豚鼠的血常規(guī)檢測中在噬堿性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞差異極顯著；脾臟切片的觀察，發(fā)現(xiàn)大鼠脾臟的白髓區(qū)域明顯大于紅髓且形態(tài)完整，大鼠擁有更多的淋巴小結(jié)，豚鼠脾臟的紅髓白髓分界則不太明顯，紅髓明顯多于白髓；通過胸腺切片的比較可以看到豚鼠胸腺的胸腺細(xì)胞很密集，豚鼠胸腺中的胸腺小體數(shù)量更多結(jié)構(gòu)更加完整。

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