唐 璟，杜 橋，胡曉晨，李依民，高 靜，彭 亮，張 崗

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 / 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心, 陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)省部共建特色秦藥資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育), 陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 712046）

bZIP (basic leucine zipper)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中數(shù)量最大、最保守的基因家族之一，該家族成員均含有由一個(gè)堿性區(qū)域 (basic region) 和一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域 (leucine zipper) 組成的特征保守結(jié)構(gòu)域[1]。堿性區(qū)域含有一個(gè)核定位信號和一個(gè)保守的N-X7-R/K 結(jié)構(gòu)，可特異性結(jié)合DNA；而亮氨酸拉鏈區(qū)域?yàn)長-X6-L-X6-L 結(jié)構(gòu)，具有二聚化能力，該區(qū)域形成二聚體后依賴于堿性區(qū)域結(jié)合在雙鏈DNA 分子上發(fā)揮作用[2]。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可特異性結(jié)合DNA啟動(dòng)子區(qū)的ACGT 核心順式作用元件，如ABRE(ABA-responsive element)、A-box (TACGTA)、C-box(GACGTC)、G-box (CACGTG)，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[3-4]。

許多bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)的生物功能已被闡明，廣泛參與調(diào)控植物體生長發(fā)育、次生代謝物合成及逆境脅迫等生物學(xué)過程。在擬南芥(Arabidopsis thaliana) 中，bZIP17與bZIP28一起介導(dǎo)細(xì)胞生長的多個(gè)基因的非誘導(dǎo)表達(dá)，從而調(diào)控根的伸 長[5]。ABA 反 應(yīng) 元 件 結(jié) 合 因 子 (ABA-responsive element binding factors)ABF2、ABF3、ABF4通過轉(zhuǎn)錄激活葉綠素分解代謝基因和衰老相關(guān)基因，促進(jìn)脫落酸 (abscisic acid, ABA) 介導(dǎo)的葉綠素降解和葉片衰老[6]。TabZIP74正調(diào)控小麥 (Triticum aestivum) 條銹病抗性[7]。此外，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活某些次生代謝物的生物合成通路基因表達(dá)，影響次生代謝物的合成。葡萄 (Vitis vinifera)VvibZIPC22可激活類黃酮合成途徑關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子進(jìn)而指導(dǎo)黃酮醇生物合成[8]。DkbZIP5通過結(jié)合DkMYB4啟動(dòng)子區(qū)域的ABRE 元件，并以依賴ABA 的方式，調(diào)控參與原花青素生物合成的基因DkMYB4的 表 達(dá)[9]。 TGACG 結(jié) 合 因 子 (TGACG motif-binding factors)TGA6通 過 響 應(yīng) 水 楊 酸 信 號 調(diào)控黃花蒿 (Artemisia annua) 中青蒿素的生物合成[10]。AabZIP1在ABA 誘導(dǎo)下直接結(jié)合AaMYC2的啟動(dòng)子而上調(diào)其表達(dá)，從而正向調(diào)控青蒿素的生物合成[11]。同時(shí)，藥用植物bZIP基因通過介導(dǎo)MeJA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與次生代謝物合成。雷公藤 (Tripterygium wilfordii)TwTGA1受 茉 莉 酸 甲 酯 (methyl jasmonate，MeJA) 誘導(dǎo)，能調(diào)節(jié)長春花生物堿合成[12]。在MeJA 誘導(dǎo)下，bZIP17和bZIP60參與調(diào)控紫花苜蓿 (Medicago sativa) 三萜皂苷生物合成[13]。

蓼科大黃屬多年生高大草本植物掌葉大黃(Rheum palmatum) 是我國傳統(tǒng)大宗藥材大黃的基源之一，因其喜涼爽濕潤氣候，故多分布于中國甘肅、四川、青海、陜西等高海拔區(qū)域，今多為栽培品[14]。大黃以干燥根及根莖入藥，性味苦、寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效[15]。大黃含有蒽醌類、黃酮類等化學(xué)成分，其中蒽醌類和蒽酮類為大黃的特征性成分，也是大黃發(fā)揮藥效的主要活性成分[16]。次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑復(fù)雜，通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其中的一系列關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響藥材品質(zhì)形成[17-18]。鑒于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子對植物次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控作用，掌葉大黃bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和功能研究尚未報(bào)道。為此，本研究基于三代全長轉(zhuǎn)錄組測序挖掘掌葉大黃bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族，對該家族成員進(jìn)行特征分析，同時(shí)結(jié)合RNA-seq 數(shù)據(jù)分析RpbZIPs基因在不同器官及MeJA 處理下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究大黃bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

MeJA、無 水 乙 醇；RN38-EASYspin Plus 植 物RNA 提 取 試 劑 盒 (Aidlab 公 司)； PrimeScript?RT Master Mix 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、TB Green?Premix ExTaq? Ⅱ (TliRNaseH Plus) (TaKaRa 公司)。K5800 自動(dòng)檢測超微量分光光度計(jì) (凱奧公司)、StepOnePlus?Real-Time PCR (qPCR) 儀 (美 國Applied Biosystems公司)。

1.2 材料

掌葉大黃一年生植株和成熟種子于2021 年8 月采集于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)和政藥用植物園，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定。

取一年生植株3 株，將葉、根、根莖3 個(gè)部位各等量混合后，由廣州基迪奧生物科技有限公司測序分析。在每個(gè)裝有200 g 泥炭土 (klasmann) 的塑料花盆中 (黑色，直徑9 cm、高12.5 cm)點(diǎn)播4 顆大小均勻、飽滿的掌葉大黃種子，培養(yǎng)條件光周期為光照16 h、黑暗8 h，光照強(qiáng)度9 000 lx，溫度(23 ± 2) ℃。首次澆水200 mL，之后每3 d 澆水50 mL。選取完整均勻的一月齡幼苗，激素處理組對整株噴施200 μmol·L-1MeJA，對照組噴施溶劑，所有樣品進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)3 次，分別于處理后12 h 取樣，將根和葉等量混合于液氮中速凍，進(jìn)行RNA-Seq 分析。

選取長勢均勻、完整的一月齡幼苗，處理組噴施200 μmol·L-1MeJA，對照組噴施溶劑(將助溶劑95%乙醇與試驗(yàn)組相同倍數(shù)進(jìn)行稀釋)；兩組均設(shè)置0 h 為空白對照，Mock 為溶劑對照，所有樣品重復(fù)3 次，分別于處理后3、6、12 和24 h 進(jìn)行取樣，于液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存，供后續(xù)qRT-PCR 驗(yàn)證分析。

1.3 全長轉(zhuǎn)錄組測序及RpbZIP 鑒定

掌葉大黃全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為課題組前期所構(gòu)建[19]。使用BlastX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 將全長轉(zhuǎn)錄組測序所得完整的isoform 在Nr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、SwissProt (http://www.expasy.ch/sprot) 和KEGG (http://www.genome.jp/kegg)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋分析。

將預(yù)測的蛋白序列與Plant TFDB (http://planttfdb.gao-lab.org/) 進(jìn)行 hmmscan 比對，將預(yù)測到的TF 進(jìn)行歸類后，從中篩選bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因。通過BlastX 比對、ORF Finder 分析篩選出具有完整ORF的bZIP全長基因。利用NCBI-CD search 和ExPASy(https://prosite.expasy.org/prosite.html) 驗(yàn) 證 編 碼 蛋 白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 蛋白序列特征分析

利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_autom at.pl?page=npsa_sopma.html) 對 掌 葉 大 黃bZIP 轉(zhuǎn) 錄因子蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) 進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用軟件Jalview (https://www.jalview.org/download/)的MAFFT 功能進(jìn)行多序列比對；MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/streme) 進(jìn)行Motif分析，并用TBtools 進(jìn)行可視化。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

以已鑒定完成的擬南芥bZIP 氨基酸序列為參照，使用MEGA 7 將掌葉大黃與擬南芥的bZIP 蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析 (采用鄰接法，Bootstrap 為1 000 次)。

1.6 基因表達(dá)模式分析

基于掌葉大黃不同部位的RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，分析bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)差異 (以FPKM 值計(jì)算)；另從MeJA 處理的掌葉大黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選顯著差異表達(dá)的RpbZIP基因 (FDR ＜0.05 且|log2FC| ＞ 1)。二者均用TBtools 進(jìn)行均一化和可視化繪圖。

1.7 qPCR 驗(yàn)證

基于RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)選擇MeJA 處理后表達(dá)顯著上調(diào)或下調(diào)的RpbZIP基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，以β-actin[20]為內(nèi)參基因。利用NCBI-Primer(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi )設(shè)計(jì)引物 (表1)，由北京奧科合成引物。用RN38-EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒提取植物總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳和K5800 超微量分光光度計(jì)用于檢測RNA 的質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT Master Mix) 合 成cDNA 第 一 鏈。qPCR 反應(yīng)按照TB Green?Premix ExTaq? (TaKaRa,RR420A, 中國) 試劑盒說明書配置10 μL 體系。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性 95 ℃ 5 s，退火 60 ℃30 s，延伸 60 ℃ 34 s, 40 個(gè)循環(huán)。技術(shù)重復(fù)和生物重復(fù)各3 次，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 掌葉大黃bZIP 基因qPCR 引物Table 1 The qPCR primers for bZIPs genes in Rheum palmatum

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26 軟件對掌葉大黃bZIP基因響應(yīng)外源激素的表達(dá)量進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，并使用Graphpad 8.0 繪圖。P＜ 0.05 代表有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RpbZIPs 基因鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

從掌葉大黃全長轉(zhuǎn)錄組中鑒定到63 個(gè)具有完整結(jié)構(gòu)域的全長RpbZIPs，按照RNA-Seq 中的isoform順序?qū)⑵渲孛麨镽pbZIP1～RpbZIP63。RpbZIPs蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，RpbZIPs基因編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)目為144 (RpbZIP54)～787 (RpbZIP1)aa (表2)，分子量16 457.34～85 075.16 Da，等電點(diǎn)為5.04 (RpbZIP55)～10.10 (RpbZIP59)，說明主 要為中性和堿性蛋白；RpbZIP10和RpbZIP34所編碼的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)分別為27.80 和30.23，為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為50.84 (RpbZIP7)～87.62 (RpbZIP19)；總平均親水性均為負(fù)值，均為親水性蛋白。除了RpbZIP60和RpbZIP63沒有β 轉(zhuǎn)角，其余61 個(gè)RpbZIPs均由α 螺旋、延伸鏈、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)組成，且以α 螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

2.2 RpbZIPs 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0 構(gòu)建RpbZIPs 與擬南芥AtbZIPs轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系 (圖1) 。根據(jù)擬南芥的分組規(guī)則將所有bZIPs 分為13 個(gè)亞族 (A～K 和M、S)，除了J 和M 亞族無掌葉大黃bZIP 成員，其他11 個(gè)亞族都同時(shí)含有擬南芥和掌葉大黃bZIP 成員。其中，A 組成員最多，包含RpbZIP 成員12 個(gè)，AtbZIP 成員13個(gè)；I 組所含RpbZIP 成員最多，為14 個(gè)，而擬南芥有10 個(gè)成員，掌葉大黃的I 家族成員可能發(fā)生復(fù)制事件；M 和J 組均只包含1 個(gè)AtbZIP 成員。

圖1 掌葉大黃與擬南芥bZIP 成員系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Figure 1 Phylogenetic relationships of Rheum palmatum and Arabidopsis bZIP members

2.3 RpbZIPs 蛋白結(jié)構(gòu)分析

RpbZIPs 多序列比對結(jié)果表明，63 個(gè)RpbZIPs蛋白都包含典型的bZIP 家族結(jié)構(gòu)域 (圖2) ，即堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。該堿性結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)保守的N-X7-R/K 結(jié)構(gòu)，其次是兩個(gè)保守的堿性氨基酸精氨酸 (R) 和賴氨酸 (K)；亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的特征為L-X6-L-X6-L，堿性區(qū)域和第一個(gè)亮氨酸相對保守。此外，發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域部分氨基酸被疏水殘基取代，其中RpbZIP8 堿性區(qū)域的R / K 被一個(gè)異亮氨酸 (I) 取代；亮氨酸拉鏈的部分亮氨酸被異亮氨酸、纈氨酸 (M)、甲硫氨酸 (F) 等疏水氨基酸取代。

圖2 RpbZIPs 多序列比對Figure 2 Sequence alignment of RpbZIPs

使用MEME 對63 個(gè)RpbZIPs 蛋白進(jìn)行保守基序分析 (圖3)，共鑒定了12 個(gè)Motif，所有RpbZIP 蛋白均含有典型堿性亮氨酸拉鏈基序Motif1，Motif2只存在于I 和E 亞族，Motif3 只存在于S 和C 亞族，Motif4 為I 亞族特有基序，Motif6、Motif8、Motif12僅于A 亞族部分成員中發(fā)現(xiàn)。同一亞族內(nèi)RpbZIPs所含Motif 的種類和總體分布相似，同一亞族內(nèi)的RpbZIPs 可能有相似的功能。

2.4 RpbZIPs 基因表達(dá)模式分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對63 個(gè)RpbZIPs在掌葉大黃葉、根及根莖3 個(gè)部位的基因表達(dá)進(jìn)行熱圖聚類分析。RpbZIPs基因表達(dá)具有組織特異性，23 個(gè)RpbZIP基因主要在葉中表達(dá) (圖4A)；39 個(gè)RpbZIP基因主要在根或根莖中表達(dá)；RpbZIP49在3 個(gè)部位中均無表達(dá)。其中有部分處于同一亞族的RpbZIP基因的表達(dá)模式相似，可能在相同的部位共同發(fā)揮功能，如E 亞族的RpbZIP29、RpbZIP36、RpbZIP40、RpbZIP42、RpbZIP48和H 亞族的RpbZIP60、RpbZIP63等。

圖4 掌葉大黃不同組織及MeJA 處理12 h 后RpbZIP 基因的表達(dá)熱圖Figure 4 Expression heat map of RpbZIP genes in different tissues and RpbZIP genes at 12 h after MeJA treatment

基于MeJA 處理12 h 的大黃幼苗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出13 個(gè)顯著差異表達(dá)的RpbZIPs基因。熱圖聚類分析結(jié)果表明，7 個(gè)RpbZIP基因 (RpbZIP14、RpbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP30、RpbZIP41、RpbZIP43、RpbZIP61) 在MeJA 處理12 h 后基因表達(dá)上調(diào) (圖4B)，6 個(gè)RpbZIP基 因 (RpbZIP19、RpbZIP23、RpbZIP26、RpbZIP36、RpbZIP42、RpbZIP59) 表達(dá)下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，RpbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP61等基因在大黃藥用部位根和根莖中的表達(dá)量較高且響應(yīng)MeJA。

2.5 RpbZIPs 候選基因的表達(dá)驗(yàn)證

以MeJA 處理0 、3 、6、12、24 h 的掌葉大黃幼苗為材料，以MeJA 差異表達(dá)候選的6 個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，進(jìn)行RpbZIP基因表達(dá)qPCR 驗(yàn)證 (圖5)。以0 h (CK) 作 為 空 白 對 照，Mock 作 為 溶 劑 對 照，RpbZIP14、RpbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP61在 處 理12 h 的表達(dá)量高于溶劑對照組，RpbZIP26、RpbZIP42在MeJA 處理12 h 的表達(dá)量低于溶劑對照組，與轉(zhuǎn)錄組測序基本一致。

圖5 MeJA 處理下RpbZIP 基因的相對表達(dá)量Figure 5 Relative expression levels of RpbZIP genes under MeJA treatment

RpbZIP14、RpbZIP16、RpbZIP61在MeJA 處理3 h的表達(dá)量均達(dá)到峰值，RpbZIP14在6 h 開始表達(dá)量呈下降再上升趨勢；RpbZIP16在3 h 表達(dá)量達(dá)到峰值為CK 的71.23 倍，之后呈下降趨勢；RpbZIP17的表達(dá)量在12 h 內(nèi)持續(xù)上調(diào)至峰值為CK 的68.75倍；RpbZIP26在MeJA 處理3～24 h 的表達(dá)量均低于CK 的0.5 倍；RpbZIP42在24 h 內(nèi)(除6 h 外)表達(dá)量持續(xù)下調(diào)。

3 討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子通常以二聚化形式依賴堿性區(qū)域特異性結(jié)合DNA 啟動(dòng)子區(qū)，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控，控制植物體內(nèi)多種生命過程[21-22]。隨著轉(zhuǎn)錄組與基因組測序技術(shù)的發(fā)展，bZIP 在擬南芥[23]、水稻 (Oryza sativa)[24]、玉米 (Zea mays)[25]等植物中已被廣泛研究。本研究基于掌葉大黃全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出63 個(gè)RpbZIPs 轉(zhuǎn)錄因子基因。其數(shù)目少于藥用植物丹參 (Salvia miltiorrhiza) (70)[18]、紫花苜蓿 (138)[26]、薏 苡 (Coix lacryma-jobi) (81)[27]、野 菊(Chrysanthemum indicum) (75)[28]等，多于大麻 (Cannabis sativa) (55)bZIP數(shù)目[29]，說明bZIP基因家族數(shù)目在不同物種中變化較大。進(jìn)一步結(jié)合掌葉大黃根、根莖及葉片3 個(gè)部位及MeJA 處理的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，富集到藥用部位中大量表達(dá)且同時(shí)受MeJA誘導(dǎo)的候選基因，并驗(yàn)證了6 個(gè)基因與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。本研究為后續(xù)RpbZIP 功能研究及其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

RpbZIP 蛋白主要為不穩(wěn)定親水蛋白，等電點(diǎn)5.04～10.10，說明RpbZIP 轉(zhuǎn)錄因子在多種微環(huán)境中發(fā)揮作用，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。系統(tǒng)進(jìn)化表明，除J 和M 亞族無RpbZIP 成員外，RpbZIP 家族成員分布在11 個(gè)亞族內(nèi)。多序列比對發(fā)現(xiàn)RpbZIP 的堿性結(jié)構(gòu)區(qū)域最保守，而亮氨酸區(qū)域含有大量的疏水殘基，符合bZIP 的結(jié)構(gòu)特征[22]。除了共有保守結(jié)構(gòu)域，RpbZIP 不同亞族之間還存在其他保守位點(diǎn)，其中RpbZIP8 堿性區(qū)域的R / K 被一個(gè)異亮氨酸 (I) 取代，該特征與黃花蒿中AabZIP78的結(jié)構(gòu)變化相一致[30]；E 亞族RpbZIPs 在亮氨酸拉鏈區(qū)域有一個(gè)保守的脯氨酸殘基，可干擾同源二聚體的形成[31]；I 亞族成員在R / K 保守位置均為K，該特征可能與維管束發(fā)育功能相關(guān)[22]。MEME 分析顯示，同亞族RpbZIP 成員擁有相似Motif，結(jié)合多序列比對，存在于所有RpbZIP 中的Motif 1 很可能代表bZIP 保守結(jié)構(gòu)域，而其他Motif 可能影響基因家族的功能多樣性[32]。

bZIP 各個(gè)亞族廣泛參與植物生長發(fā)育過程，A亞族主要參與ABA 響應(yīng)和逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[33]；D 亞族 (TGA 因子) 主要參與防御反應(yīng)及根的生長發(fā)育[34-35]；F 亞族參與植物鋅防御反應(yīng)和鹽脅迫響應(yīng)[36]；H 亞族主要由HYH 和HY5 轉(zhuǎn)錄因子組成，參與次生代謝產(chǎn)物生物合成與光信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等[37]；而S 亞族的生物功能較為廣泛，參與植物生殖發(fā)育，還可響應(yīng)機(jī)械刺激、干旱和低溫等[22]。H 亞族RpbZIP成員均在葉中表達(dá)，根及根莖中幾乎無表達(dá)，推測這些基因主要參與葉中次生代謝產(chǎn)物生物合成與光信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。S1 組AtbZIP11控制生長素依賴的主根生長[38]；AtbZIP1及AtbZIP53在根中控制鹽脅迫下的代謝重編程[39]，而RpbZIP61在掌葉大黃根及根莖中高表達(dá)，且受MeJA 誘導(dǎo)，可能參與根及根莖的發(fā)育和代謝。

大量研究表明，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可響應(yīng)各種激素，參與植物生物合成和抗逆相關(guān)基因的調(diào)控。茉莉酸甲酯作為一種重要的植物激素，在植物防御反應(yīng)及次生代謝產(chǎn)物生物合成中起著重要的作用[40]，常被用于藥用植物次生代謝物合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因挖掘研究。如穿心蓮 (Andrographis paniculata)中鑒定發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)ApbZIPs在葉片中表達(dá)最高，且MeJA 處理后顯著上調(diào)，可能參與調(diào)控穿心蓮內(nèi)酯的生物合成[41]。本研究利用MeJA 處理12 h 掌葉大黃幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到13 個(gè)顯著差異表達(dá)的RpbZIPs，結(jié)合不同組織部位表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)RpbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP26、RpbZIP61等在掌葉大黃根及根莖中大量表達(dá)且響應(yīng)MeJA 處理。RpbZIP16、RpbZIP17屬 于 CPRF1 (Common Plant Regulatory Factor 1) 因 子，受MeJA 誘 導(dǎo)。黃 花 蒿CPRF1 因子AabZIP33和AabZIP38調(diào)控藍(lán)光介導(dǎo)青蒿素的生物合成[29]；歐芹 (Petroselinum crispum) CPRF1抑制查爾酮合酶 (CHS) 基因的啟動(dòng)子活性，從而下調(diào)黃酮類化合物的積累[42]。RpbZIP26屬于TGA 因子，MeJA 處理抑制其表達(dá)。大多數(shù)TGA 因子含有MeJA 反應(yīng)元件TGACG-基序，在MeJA 處理下主要參與次生代謝產(chǎn)物生物合成及防御相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[43-44]。因此，響應(yīng)MeJA 的RpbZIP16、RpbZIP17、RpbZIP26等可能參與大黃次生代謝產(chǎn)物生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和抗逆反應(yīng)，其具體功能還有待于后續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

本研究在掌葉大黃全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到63 個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，并分析其編碼蛋白理化性質(zhì)、多序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化等特征。通過比對掌葉大黃不同組織及MeJA 處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出掌葉大黃藥用部位中高表達(dá)且可能響應(yīng)MeJA 的候選基因，并對其基因表達(dá)模式進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，進(jìn)一步明確RpbZIPs對MeJA 的響應(yīng)特性，為后續(xù)RpbZIP 功能研究及大黃次生代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。