胡子然 陳濤 李哲媛 張曉琳 林欣 蔡凌翼 于小凡 賈曉宇 李蓯洲 王金環(huán)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是一種以造血細(xì)胞譜系減少,主要以全血細(xì)胞減少為特征的骨髓造血衰竭疾病(bone marrow failure,BMF),主要分為先天性和獲得性兩大類,先天性AA發(fā)病率低,其中絕大多數(shù)患者屬于原發(fā)性獲得性AA[1]。本病的病因及發(fā)病機(jī)制未明,其致病因素主要包括化學(xué)或物理損傷(包括藥毒性和輻射)、遺傳缺陷以及免疫介導(dǎo)異常[2]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分化異常、功能亢進(jìn)所致造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞顯著減少是AA的主要發(fā)病機(jī)制[3]。AA在我國的年發(fā)病率約為0.74/10萬,高于世界平均水平2～3倍,可發(fā)生于各年齡段,但好發(fā)于青壯年(15～25歲)以及老年群體(65～69歲),且無明顯性別差異[4]。一部分AA患者會并發(fā)高危的血細(xì)胞減少癥,約15%的患者會發(fā)展為骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)或急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML);重型AA患者(severe aplastic anemia,SAA)如果缺乏有效的治療,2年存活率只有30%左右,嚴(yán)重影響AA患者的生存質(zhì)量與生存率[5-8]。因此,AA對患者帶來的不良后果與預(yù)后導(dǎo)致臨床迫切需要一種簡便、易耐受、高效的檢測方法,但目前AA的診斷仍僅局限于排除性診斷,精確的診斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷標(biāo)志物成為影響該病患者治療與預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。一些新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或miRNA分子為AA的診斷及分期提供了更加科學(xué)高效的支持。特別是運(yùn)用一些靈敏且準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物作為檢測指標(biāo),可以更好地進(jìn)行AA的診斷、治療方案的選取以及預(yù)后的判定。本研究將對AA的診斷標(biāo)志物進(jìn)行綜述,以期為診斷及治療提供新的思路。

1 外周血生物標(biāo)志物

1.1 抗COX-2自身抗體(Anti-COX-2 autoantibody) Kelkka等[2]發(fā)現(xiàn)了一種與健康對照組差異倍數(shù)>20的免疫性再生障礙性貧血(immune aplastic anemia,IAA)限制性自身抗體蛋白Anti-COX-2 autoantibody(aCOX-2 ab)。隨后他們在一個包括405例IAA患者、815例健康對照的試驗中發(fā)現(xiàn),以ROC曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)為陽性閾值的情況下,37%的成年IAA患者aCOX-2 ab陽性表達(dá),同時陽性患者血小板計數(shù)水平更低,aCOX-2 ab陽性與診斷時的血小板計數(shù)之間也存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(OR=1.34)。aCOX-2 ab在HLA-DRB1*15∶01陽性患者中表現(xiàn)出了高特異性與高敏感度[2]。這意味著二者可能共同確定了一種類型的IAA,盡管相關(guān)機(jī)制尚未明了。同時已有研究表明HLA-DRB1*15∶01陽性的AA患者對環(huán)孢素A的治療更為敏感,療效更加顯著,環(huán)孢素A也因為其相對低廉的治療成本及較少的不良反應(yīng)在國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛[9-10]。免疫抑制療法(immunosuppressive therapy,IST)或者艾曲泊帕等生長因子受體激動劑的治療效果并未在aCOX-2 ab陽性與陰性患者之間顯示出差異性,但由于aCOX-2 ab陽性患者的樣本量僅13例,且中位年齡較小,因此還需繼續(xù)驗證[2]。相比較于骨髓活檢以及骨髓穿刺,解離增強(qiáng)鑭系元素滎光免疫檢測(DELFIA)檢測所需的血清樣本采集更加簡便且更易耐受。aCOX-2 ab聯(lián)合HLA-DRB1*15∶01是較為理想的AA診斷指標(biāo)組合,對AA的篩查具有良好的臨床應(yīng)用價值,同時該標(biāo)志物的高敏感度與特異性也為解決鑒別AA與其他BMF的長久困難提供新的方向。

1.2 循環(huán)Dickkopf-1(DKK1)蛋白 Giudice等[11]使用SOMAscan技術(shù)篩選了28例AA患者治療前后的血清蛋白,以及7例接受標(biāo)準(zhǔn)IST治療和TPO受體激動劑治療的SAA患者的血漿蛋白,總共發(fā)現(xiàn)了有希望成為AA診斷或者預(yù)后指標(biāo)的19種血清蛋白和28種血漿蛋白。為了確認(rèn)該結(jié)果的普遍性,他們采集了65例SAA患者在接受治療前、IST 6個月、IST1年的血清樣本進(jìn)行Luminex檢測,基于AA的發(fā)病相關(guān)性選擇其中以Dickkopf-1(DKK1)為代表的4種蛋白進(jìn)行驗證。根據(jù)患者預(yù)后情況分為完全緩解組、部分緩解組以及無緩解組,ANOVA分析顯示:完全緩解組血清DKK1蛋白水平在治療前、IST 6個月以及1年后顯著高于其他2組。通過非配對T檢驗發(fā)現(xiàn),DKK1蛋白在完全緩解組與無緩解組之間的特異性比其他3種蛋白更為顯著。將1年的隨訪數(shù)據(jù)生成Logistic回歸和廣義線性模型以預(yù)測IST預(yù)后情況,把患者治療前和IST 6個月的數(shù)據(jù)應(yīng)用于該函數(shù)得到:以DKK1蛋白水平為代表的數(shù)學(xué)模型對治療前的患者反應(yīng)性的預(yù)測敏感度為48%、特異度達(dá)到82%,而在治療6個月時的預(yù)測敏感度可達(dá)76%、特異度為83%,與實際結(jié)果對比準(zhǔn)確率為79%[11]。血小板是循環(huán)DKK1蛋白產(chǎn)生的主要來源[12]。Giudice等[11]發(fā)現(xiàn)AA患者血清循環(huán)DKK1蛋白水平低于正常對照組1.5倍的現(xiàn)象也在一定程度解釋了AA患者血小板計數(shù)下降的問題。DKK1蛋白在血液系統(tǒng)疾病中的相關(guān)研究較少,此次發(fā)現(xiàn)可能也預(yù)示了其在AA等免疫介導(dǎo)異常所致的血液病中的診療潛力。血清DKK1對于提高AA的診斷檢出率有一定幫助,其在預(yù)測IST療效表現(xiàn)出了高敏感度和特異度,為AA預(yù)后的預(yù)測提供了新方向。雖然缺少DKK1蛋白預(yù)測模型在其他AA治療方式中的研究比對,但綜合已有研究也可發(fā)現(xiàn),DKK1蛋白對臨床治療方案的選取仍具有一定的參考價值。

1.3 Component 1q(1Q) C1q是補(bǔ)體經(jīng)典途徑C1的一個亞基,它可調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞,不僅參與啟動機(jī)體抵御病原體的第一道防線,而且在固有免疫和特異性免疫過程中發(fā)揮主要的樞紐作用[13]。Ding等[14]發(fā)現(xiàn),134種蛋白質(zhì)在NSAA患者和正常對照之間存在差異表達(dá),而C1q差異表達(dá)更為顯著。他們之后通過酶聯(lián)免疫吸附測定測定40例治療前NSAA患者、40例緩解期NSAA患者、20例SAA患者、20例特發(fā)性血小板減少性紫癜患者和20例自身免疫性溶血性貧血患者以及20例健康個體血清樣本C1q濃度證實:NSAA組血清C1q水平在治療前明顯低于正常對照組以及緩解期NSAA組。此外,NSAA組血清C1q水平低于SAA組,但是SAA組、正常對照組和緩解期NSAA組血清C1q水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。為更好了解C1q的臨床臨床意義,將血清C1q水平與NSAA臨床指標(biāo)包括血細(xì)胞計數(shù)和免疫指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,血清C1q濃度與粒細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)和網(wǎng)織紅細(xì)胞比率呈正相關(guān)。此外,血清C1q濃度與mDC/pDC比值呈正相關(guān)與CD4/CD8比值呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明,補(bǔ)體途徑在AA的免疫發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。C1q在SAA與NSAA的差異表達(dá),為疾病嚴(yán)重程度的判定提供了一個新的可靠生物標(biāo)志物。雖然運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行血清C1q檢測是簡便高效的,但是C1q水平變化是否具有臨床診療價值,仍然需要大量的相關(guān)研究來驗證。

1.4 細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4) 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群,Treg的免疫調(diào)節(jié)功能主要通過抑制T細(xì)胞增值,以及細(xì)胞因子和自身抗體的產(chǎn)生來表現(xiàn)。同時,它可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)、單核巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞的功能。既往研究顯示,AA患者的Treg細(xì)胞含量低于正常人,且功能缺損,分泌細(xì)胞因子的非Treg增加[15]。在SAA患者群中,Treg數(shù)量普遍低于NSAA患者,但在IST后數(shù)量可有恢復(fù),這提示Treg具有用于疾病的診斷、嚴(yán)重程度的分析以及預(yù)后監(jiān)測的潛力。目前已知SAA發(fā)病機(jī)制是髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cell,mDC)被某些未知抗原激活,使其抗原呈遞異常,產(chǎn)生大量Ⅰ型淋巴細(xì)胞因子,激活CD8+T細(xì)胞,從而導(dǎo)致骨髓造血衰竭。而DC的主要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)是Treg細(xì)胞,且此過程主要依賴于抗原刺激[16]。Liu等[17]實驗結(jié)果顯示Treg細(xì)胞表面上的CTLA-4表達(dá)與mDCs表面上的HLA-DQ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果表明,SAA患者外周血中Treg數(shù)目和CTLA-4表達(dá)減少,并且mDC的異常活化可能是由于mDC上的MHCⅡ類分子抗原呈遞異常引起的,從而啟動了一系列的免疫細(xì)胞活化,Treg對mDCs的調(diào)節(jié)作用通過CTLA-4與HLA-DQ共同實現(xiàn)。結(jié)合AA臨床免疫細(xì)胞分析,SAA患者外周血Treg細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)與NK細(xì)胞數(shù)、CD4+T/CD8+T比值呈正相關(guān),與CD8+T細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān);mDC表面HLA-DQ表達(dá)與外周血Treg細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞數(shù)、CD4+T/CD8+T比值呈負(fù)相關(guān)。目前已有學(xué)者將CTLA-4單克隆抗體作為SAA等自身免疫性疾病治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究,而該抗體已用于腫瘤臨床治療中且取得了良好的療效[18]。以上結(jié)果證實CTLA-4水平與SAA相關(guān)臨床指標(biāo)的顯著相關(guān)性,為IST療效提升及疾病復(fù)發(fā)監(jiān)測的研究提供了思路;同時,mDC上的MHCⅡ類分子HLA-DQ調(diào)節(jié)機(jī)制可能揭示了Treg細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。

2 基于分子水平的診斷指標(biāo)

2.1 miRNA分子 miRNA是一組內(nèi)生的非編碼小分子RNA,一般含有18～25個核苷酸。Xiao等[19]提出miRNA對于調(diào)節(jié)免疫具有重要作用。miRNA也可存在于細(xì)胞外如微泡、外來體和微粒中。這些循環(huán)miRNA可以在血清、血漿、尿液和唾液中被檢測和定量[20]。循環(huán)miRNA可反映機(jī)體的生理和病理狀況,并且具有高度穩(wěn)定性,這使其具有充當(dāng)各種疾病的生物標(biāo)志物的能力[21]。Hosokawa等[22]在AA患者血漿中發(fā)現(xiàn)3種比例失調(diào)的miRNA且與正常人群相比差異倍數(shù)>1.5倍,其中miR-150-5p、miR 146-5p比例上調(diào),miR-1比例下調(diào),同時在患者接受IST后,三者比例向正常水平回歸。但是miR-150-5p僅在治療有效的患者間顯著降低,而無論IST對患者是否有效,miR-1水平均會上升。并且他們發(fā)現(xiàn),在AA與MDS患者之間存在5種差異明顯的miRNA(miR-150-5p、miR-146-5p、miR-1、miR-22-3p和miR-424-5p),這些miRNA分子具有繼續(xù)研究以鑒別AA與MDS的價值。Hosokawa等[22]提出了一種新的檢查方式以提高AA診斷陽性率并且監(jiān)測AA對IST的反應(yīng),也為未來揭示疾病發(fā)展中相關(guān)循環(huán)miRNA的潛在作用機(jī)制,以及其與IST關(guān)聯(lián)性提供思路。該研究也反映了體液檢查在鑒別AA和MDS中的應(yīng)用與研究價值,體液檢查由于具備患者易耐受的特點(diǎn),因此也更好在臨床中推廣。

2.2 RNA拷貝數(shù) Wilms tumor 1(WT1)是一種腫瘤抑制基因,可識別間皮細(xì)胞增生、惡性間皮瘤、卵巢囊腺癌、性腺母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤及結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞腫瘤,在血液惡性腫瘤和其他腫瘤患者的未成熟胚細(xì)胞中過表達(dá)[23-25]。Ishiyama等[26]發(fā)現(xiàn),WT1基因在獲得性AA患者外周血中表達(dá)增加,隨后用定量PCR(聚合酶鏈反應(yīng))試劑盒對63例AA患者和5例MDS患者的WT1拷貝數(shù)(/μgRNA)進(jìn)行連續(xù)測量,首次測量時,41%未接受治療的AA患者WT1陽性表達(dá),而59%的正在接受治療的患者體內(nèi)WT1基因呈陽性,之后2～105個月的隨訪發(fā)現(xiàn),大多數(shù)AA患者的WT1拷貝數(shù)逐漸增加,但只有3例AA患者WT1拷貝數(shù)的最大變化率>20.0(WT1拷貝數(shù)的最大值與首次測量的WT1拷貝數(shù)的比值),并且這3例患者分別在第2、46和105個月時并發(fā)骨髓增生異常綜合征。MDS患者的WT拷貝數(shù)690～5 700(中位數(shù)2 000)一直保持較高水平,而在大多數(shù)拷貝數(shù)>50WT1陽性AA患者中,WT1基因主要在粒細(xì)胞富集而非單核細(xì)胞中。這提示AA患者體內(nèi)WT1拷貝數(shù)持續(xù)增加可能是由于粒細(xì)胞中WT1基因表達(dá)增加。實驗表明,在緩解期AA患者中,WT1拷貝數(shù)變化率>20.0的患者可能會有發(fā)生MDS的風(fēng)險,需要審慎監(jiān)測[27]。雖然該實驗中發(fā)展為MDS/AML的AA患者的WT1拷貝數(shù)變化率高達(dá)20.0,但由于AA患者的觀察期(中位數(shù)46個月)可能不足以進(jìn)行病情演變,一些WT1拷貝數(shù)中等偏高的患者在較長的觀察期后可能存在病情變化的潛在風(fēng)險。目前AA和低增生MDS之間很難鑒別[27]。如果在早期檢查骨髓,則診斷為AA;如果出現(xiàn)某些克隆的情況下進(jìn)行檢查,診斷將是MDS[28]。而WT1拷貝數(shù)變化率發(fā)現(xiàn)為AA與MDS相關(guān)發(fā)病機(jī)制的分子水平研究提供了新的方向。通過PCR監(jiān)測AA患者體內(nèi)的WT1數(shù)變化率有可能成為預(yù)測AA轉(zhuǎn)歸的生物標(biāo)志物。

3 基于骨髓的檢驗診斷

在既往研究中,B10細(xì)胞對炎癥、自身免疫疾病和癌癥的免疫調(diào)節(jié)作用引起了廣泛關(guān)注[29-31]。Gu等[32]收集24例SAA患者、14例NSAA患者和20例正常人的骨髓后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基分離出單核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并刺激細(xì)胞,隨后通過流式細(xì)胞術(shù)分離出細(xì)胞,免疫熒光雙標(biāo)記測定IL-10與CD19的比值并以此來反映B10細(xì)胞及B10祖細(xì)胞在B細(xì)胞中的比例。有實驗結(jié)果表明,與健康對照組相比AA患者骨髓中B10細(xì)胞和B10祖細(xì)胞在CD19+B細(xì)胞中的比例降低,而SAA組骨髓B10細(xì)胞和B10祖細(xì)胞在CD19+B細(xì)胞顯著低于NSAA組,同時B10細(xì)胞比例與反映骨髓增生嚴(yán)重程度的臨床血液指標(biāo)如周血中性粒細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和血小板計數(shù)之間呈正相關(guān),B10細(xì)胞水平越低,也意味著疾病越嚴(yán)重[1]。盡管B10細(xì)胞用于AA診斷的高效性與特異性還需在大樣本實驗中進(jìn)一步探索,但是其與AA嚴(yán)重程度的相關(guān)性揭示了B10細(xì)胞的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)在AA發(fā)病機(jī)制中的重要作用。郝立君等[33]報道了B10細(xì)胞影響免疫性血小板減少癥的發(fā)展和免疫調(diào)節(jié),但是其在AA中的潛在作用機(jī)制以及作用靶點(diǎn)尚不清楚。聶甜等[34]的研究證實,再生膠囊可能通過促進(jìn)AA大鼠外周血IL-10和TGF-β1水平的提高達(dá)到促進(jìn)AA大鼠恢復(fù)骨髓造血的功能。B10細(xì)胞水平的干預(yù)是否有助于AA的治療,值得后期的進(jìn)一步研究。

綜上所述,AA是臨床較為常見的骨髓造血功能衰竭性疾病。在AA的診斷方法中,血常規(guī)檢查應(yīng)用最為普遍,也是先行診斷采取的方式,患者血紅蛋白、血小板及白細(xì)胞的數(shù)目明顯低于正常指數(shù)則提示AA,但該診斷方式不夠精確,容易出現(xiàn)漏診以及誤診[35]。骨髓相關(guān)檢查權(quán)威且可靠,它能最直觀地反映患者的骨髓造血情況,提高AA診斷的陽性率,至今仍然是一項重要的診斷方法。將傳統(tǒng)的診斷方法與前沿生物技術(shù)聯(lián)合能較大提高AA的診斷效率以及準(zhǔn)確性。對于占絕大多數(shù)AA比例的IAA患者群體,aCOX-2 ab表現(xiàn)出了高度的敏感度及差異性,具有成為臨床診斷標(biāo)志物的潛力,且運(yùn)用現(xiàn)存的診斷技術(shù)檢驗該項指標(biāo)是簡便且高效的,對于臨床應(yīng)用及推廣具有很高的價值。隨著表觀遺傳學(xué)在各種疾病的診斷以及預(yù)后中不斷推廣,miRNA的差異表達(dá)等表觀學(xué)的改變也越來越受到重視,其在AA的診斷、鑒別及治療中的監(jiān)測取得了良好的效果。但目前為止,患者依然未發(fā)現(xiàn)針對全部或者部分AA群體百分之百準(zhǔn)確且特異的診斷標(biāo)志物,聯(lián)合多種指標(biāo)進(jìn)行診斷疾病或許是未來精準(zhǔn)檢測AA以及鑒別AA與其他BMF疾病的重要方式。針對AA發(fā)病機(jī)制的研究,以及探索各個指標(biāo)在AA發(fā)病過程中的潛在免疫功能,仍然是未來研究的一大熱點(diǎn)。