王文靜

（中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074）

引言

高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，采用高壓輸液系統(tǒng)，以不同極性的單一或混合溶劑作為流動相，利用高效色譜柱對待測物質(zhì)先分離再進行檢測的一類儀器分析方法。該方法具有高效﹑高靈敏度﹑快速﹑易于自動化的特點，在醫(yī)藥衛(wèi)生﹑食品質(zhì)量與安全﹑石油化工﹑生理生化和環(huán)境保護等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。特別是在藥學研究領(lǐng)域，高效液相色譜法是必不可少的一類儀器分析方法［1］。因此，“儀器分析”課程要求藥學院學生能熟練掌握高效液相色譜法的基本理論知識并同時配備相應(yīng)實驗課程，幫助學生合理運用該方法對待測物質(zhì)進行定性或定量分析。

高效液相色譜法作為“儀器分析”課程中色譜分析法的一個重要組成部分，其涉及的理論知識面很廣，包括色譜法的基本概念﹑流動相的種類及洗脫能力﹑色譜流出曲線﹑色譜分離原理﹑色譜分離方程以及液相檢測器等。在實際教學過程中，由于《高效液相色譜法》章節(jié)中涉及大量計算方程式和相關(guān)參數(shù)，且部分參數(shù)表示方式很接近，如分配系數(shù)K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度，分配比k=溶質(zhì)在固定相中的質(zhì)量/溶質(zhì)在流動相中的質(zhì)量。這導(dǎo)致學生在學習過程中容易對公式混淆﹑記憶困難。另外，高效液相色譜法作為最常用的儀器分析方法之一，其重難點是如何設(shè)計適當?shù)纳V條件對待測物質(zhì)進行分離。需要根據(jù)待測物質(zhì)的物理或化學性質(zhì)，選擇不同分離原理色譜柱﹑流動相體系及比例﹑流速﹑檢測器等，在最短時間內(nèi)達到完全分離。雖然在對應(yīng)的實驗課程中設(shè)計了“利用高效液相色譜法檢測不同廠家雙黃連口服液中黃芩苷含量”的實驗，但該實驗只是一個驗證性實驗，主要進行定量分析。實驗中流動相體系及比例﹑流速﹑色譜柱及檢測器均已經(jīng)確定，學生在實際操作過程中無法體會流動相洗脫能力的差異﹑流動相對分離度的影響﹑柱效與流速之間的關(guān)系﹑不同色譜柱分離原理以及不同檢測器的適用范圍，從而導(dǎo)致教學效果不理想。

案例教學法是以案例為基礎(chǔ)的一類開放式﹑互動式的教學方法，起源于20世紀20年代，由美國哈佛商學院所倡導(dǎo)，于1990年之后在國內(nèi)教育界開始探索［2］。該方法通過教師提供特定案例材料，學生閱讀材料﹑查閱文獻﹑積極探索﹑擬定解決方案，在課堂上進行分組或集中討論，對不同解決方案進行對比分析，總結(jié)經(jīng)驗，最終達到強化記憶﹑熟練掌握知識點的效果。案例教學法鼓勵學生獨立思考，培養(yǎng)學生的自主思維，引導(dǎo)學生在解決問題的過程中掌握理論知識，通過共同探討，調(diào)動學生的學習主動性，從而提高教學質(zhì)量。

一、案例選擇

案例是以教學為目的，具有典型性﹑客觀生動性以及多樣性的特點。好的案例必須緊扣對應(yīng)的理論知識，并且來源于實踐，而不是主觀臆測和虛構(gòu)的。同時，案例應(yīng)該存在多種解決方案，可為學生提供充分的探索空間?！秲x器分析》教材中高效液相色譜法部分的實例，往往是為了證明某些理論而給出的實驗結(jié)果，忽視了方案設(shè)計及條件摸索的過程，使學生難以將結(jié)果與原理相結(jié)合。在國內(nèi)外學術(shù)期刊中，每年都會有大量基于高效液相色譜法建立的分析方法，用于特殊物質(zhì)的定性或定量檢測。這些研究論文通常是根據(jù)待測物結(jié)構(gòu)推測其物理或化學性質(zhì)，設(shè)計檢測方案并逐步優(yōu)化，最終形成針對特殊物質(zhì)的分析方法?？梢詫⒋祟愌芯空撐淖鳛榻虒W案例，以高效液相色譜法的核心問題“分離—檢測”為導(dǎo)向，在課堂上進行分析討論，培養(yǎng)學生文獻查閱﹑實驗方案設(shè)計﹑數(shù)據(jù)分析以及成果展示等各方面的能力。

二、教學案例——根據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)選擇不同的分離方法

高效液相色譜法的關(guān)鍵步驟是分離樣品，根據(jù)分離機制的不同，可以分為吸附色譜法（adsorption chromatography）﹑分配色譜法（partition chromatography）﹑離 子色譜法（ion chromatography）﹑分 子排阻色譜法（size exclusion chromatography）﹑鍵合色譜法（bonded-phase chromatography）﹑親和色譜法（affinity chromatography）［3］。

1.液-液分配色譜法的特點是固定相和流動相均為液體，通過化學反應(yīng)將有機分子鍵合在擔體表面，形成一層單分子薄膜，利用組分在固定液與流動相中溶解度的差異，實現(xiàn)分離。根據(jù)固定液與流動相的極性差別，將液-液分配色譜法分為正相和反相色譜法。正相色譜法以硅膠為擔體，通過化學反應(yīng)以氰基或氨基取代硅膠中的羥基形成固定相，選擇正己烷等非極性溶劑作為流動相，固定相極性大于流動相極性，極性小的組分先流出色譜柱。適用于分離中等極性的組分，如芳香醇﹑芳香胺﹑甾族﹑脂和有機氯農(nóng)藥等。反相色譜法是將十八烷基﹑苯基或辛烷基等鍵合在硅膠上作為固定相，以水和溶于水的有機溶劑（乙腈﹑甲醇﹑乙醇等）作為流動相。極性小的組分在固定液中的溶解度大，后流出色譜柱。適用于分離非極性或中等級性的組分，如天然小分子化合物﹑同系統(tǒng)﹑烷烴﹑激素等。

環(huán)孢素A（Cyclosporine A,CsA）是真菌產(chǎn)生的具有11個氨基酸的環(huán)肽類化合物（如圖1），溶于甲醇﹑乙醇﹑二氯甲烷﹑丙酮，微溶于水。臨床上用于治療器官和組織移植后的排異反應(yīng)［4-5］。根據(jù)其脂溶性特點，選擇液-液分配色譜法進行分析，采用反相C18（十八烷基鍵合硅膠）作為固定相，甲醇-水和乙腈-水體系作為流動相。結(jié)果表明CsA保留時間對有機相比例變化比較敏感，隨著有機相比例降低，其保留時間明顯增加，且甲醇-水體系變化比乙腈-水體系更明顯。乙腈比例為75%～85%，甲醇比例為84%～88%，CsA的保留因子（k）控制在3～7范圍內(nèi)。

圖1 Cyclosporine A、次黃嘌呤、黃嘌呤和番茄紅素化學結(jié)構(gòu)

2.液-固吸附色譜法以固體吸附劑為固定相，利用組分分子與吸附劑間吸附力的差異進行分離。常用的固體吸附劑有硅膠﹑氧化鋁﹑活性炭﹑高分子多孔微球（有機膠）﹑分子篩及聚酰胺等。吸附色譜法中的流動相主要為非極性的烴類（如己烷﹑庚烷），可以加入某些有機溶劑（如甲醇﹑二氯甲烷﹑加酸）調(diào)節(jié)流動相極性的pH值，固定相極性大于流動相，為反相色譜。流動相極性越大，洗脫能力越強；組分極性越大，保留時間越長。吸附色譜法對異構(gòu)體和具有不同官能團的化合物選擇性較好，常用于分離相對分子量中等的油溶性物質(zhì)。

番茄紅素是植物性食物中存在的一種類胡蘿卜素，廣泛存在于番茄﹑西瓜﹑葡萄柚等水果中，為目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑，同時還可以降低前列腺癌等多種腫瘤和心血管疾病發(fā)生的風險。其不僅作為食品加工的天然色素，且越來越多地應(yīng)用于保健食品﹑藥品和化妝品中。番茄紅素為直鏈形碳氫化合物，具有11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵（圖1），結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，具有多種順反異構(gòu)體。對其順反異構(gòu)體的分離和分析多采用常規(guī)的C8或C18色譜柱，但效果不理想，很難達到完全分離。李偉等［6］在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇液-固吸附色譜法對番茄紅素異構(gòu)體進行分離。該方法選擇Nucleosil 300-5（Macherey-Nagel）色譜柱，以正己烷為流動相，對不同樣品中的番茄紅素異構(gòu)體實現(xiàn)較好分離。

3.離子交換色譜法是以硅膠為基體的化學鍵合離子交換劑或交聯(lián)聚苯乙烯為基體的離子交換樹脂為固定相，流動相為具有一定離子強度并對pH有一定緩沖能力的水溶液，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離。組分離子對固定相的親和力越大，交換力越強，越容易交換到固定相上，保留時間也越長；反之，親和力小的離子，保留時間短。離子交換色譜法主要用于分離離子和可離解的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)﹑多糖﹑寡核苷酸﹑噬菌體﹑病毒等。

肌氨肽苷注射液是臨床上用于治療心血管疾病的常用藥物?！吨袊幍洹芬?guī)定其中主成分次黃嘌呤的含量應(yīng)為標示量的85%～115%。現(xiàn)行標準以C18為固定相，以磷酸二鉀緩沖溶液（0.001 mol·L-1，pH 6.9）-甲醇（100∶0.2）為流動相，對次黃嘌呤含量進行測定。由于標準中有機相比例過低，導(dǎo)致待測物出峰時間太短，次黃嘌呤與其干擾物黃嘌呤的分離度很難達標，因此須要開發(fā)新方法對次黃嘌呤的含量進行測定［7］。由于化學結(jié)構(gòu)不同（圖1），在pH值為2.5的水溶液中，次黃嘌呤會發(fā)生解離，約38%以正離子存在，而黃嘌呤則不會解離，仍為中性分子。因此，白璧煒等［8］根據(jù)兩者的不同性質(zhì)，選擇離子交換色譜法對次黃嘌呤含量進行測定。采用磺酸基陽離子交換鍵合硅膠為固定相，以水（0.001 mol·L-1稀硫酸調(diào)節(jié)pH為2.2﹑2.5﹑2.8和3.5）為流動相。結(jié)果顯示，pH值為2.5時，色譜峰寬最窄﹑理論塔板數(shù)最高且出峰時間較快。因此，該方法的最適條件為pH=2.5±2.0。與現(xiàn)行標準相比較，新方法穩(wěn)定性好﹑干擾少﹑分離度高，且無須配制對照品進行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，節(jié)省時間和成本。

4.分子排阻色譜法又稱為凝膠色譜法，是目前最常用的分離技術(shù)之一。分離原理主要是以具有一定孔徑分布的多孔凝膠填料作為固定相，依靠待測樣品的分子尺寸與凝膠孔徑間的關(guān)系進行分離。大分子組分難以進入凝膠孔徑內(nèi)，只能隨流動相在填料間隙移動，最先洗脫出來；中等大小的組分可以通過較大的孔徑進入凝膠填料內(nèi)部，在柱中滯留，較慢洗脫出來；小分子組分可以進入凝膠填料的大部分孔徑，滯留作用更強，最后洗脫出來。該方法具有保留時間短﹑譜峰窄﹑柱壽命長﹑生物相容性好等特點，廣泛用于大分子的分級和大分子物質(zhì)（如核酸﹑蛋白質(zhì)﹑油脂和多糖）的分離。

淀粉是由葡萄糖分子通過糖苷鍵聚合而成的大分子物質(zhì)，經(jīng)過機械﹑化學或生化工藝的加工，廣泛應(yīng)用于食品﹑醫(yī)藥﹑紡織及造紙等領(lǐng)域［9］。葡聚糖是淀粉的酶解產(chǎn)物之一，窄相對分子質(zhì)量分布范圍的葡聚糖在臨床上有很高需求。已有報道稱相對分子質(zhì)量增大及分布不均勻會引起右旋糖酐注射液的過敏反應(yīng)［10］。《中國藥典》自2000年版起規(guī)定以相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布測定法對右旋糖酐注射液質(zhì)量進行控制。因此，需要一種能夠準確﹑快速測定淀粉降解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的方法來衡量產(chǎn)品質(zhì)量。劉艷群等［11］于2005年發(fā)表了一篇關(guān)于運用凝膠滲透色譜法（GPC）測量淀粉酶解產(chǎn)物分子量的研究論文。淀粉經(jīng)過淀粉酶酶解，許多長鏈﹑大分子的多糖被水解成了小分子，不同分子量組分進入凝膠孔的機會有所差異，最終達到以長鏈分子在前﹑短鏈分子在后的順序從柱中淋洗出來的目的，之后這些組分以譜帶形式進入示差折射檢測器進行檢測，通過與標準品所繪制的標準曲線對比計算出樣品分子量。該方法重復(fù)性好，可以用于淀粉酶解反應(yīng)的監(jiān)控和指導(dǎo)淀粉制品的加工。

5.親和色譜是一種利用固定相的結(jié)合特性來分離物質(zhì)的色譜方法。該方法將能與待分離物質(zhì)發(fā)生可逆吸附的生物大分子（抗原/抗體﹑酶﹑受體蛋白﹑細胞膜等）通過一定技術(shù)手段與固定相載體相偶聯(lián)，以此作為固定相填充色譜柱。當含有待分離物質(zhì)的混合物隨著流動相流經(jīng)色譜柱時，樣品中存在的親和配基與偶聯(lián)的生物大分子發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生滯留。而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中快速流出，從而實現(xiàn)對目標成分的選擇性分離。

黃芪甲苷（Astragaloside IV）具有增強免疫力﹑降血糖﹑強心降壓﹑抗腫瘤和抗衰老等多種藥理活性，是中藥黃芪的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，用于評價黃芪及其制劑質(zhì)量［12］?！吨袊幍洹罚?000年版）規(guī)定采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLCELSD），以C18為填充劑，乙腈-水（32∶68）作為流動相，對黃芪甲苷含量進行測定。但該方法對儀器設(shè)備要求較高，且樣品預(yù)處理工序煩瑣，不適于大批量樣品的快速檢測。于生蘭［13］基于抗原抗體反應(yīng)的特異性，建立了一種快速﹑準確﹑靈敏的黃芪甲苷免疫分析檢測方法。首先通過合成的黃芪甲苷人工抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，利用黃芪甲苷與載體結(jié)合制備成的免疫親和色譜柱，靶向分離純化得到單克隆抗體，建立黃芪甲苷間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法，用于黃芪甲苷的含量測定［14］。同時，在本研究的基礎(chǔ)上，還可以選擇抗AST單克隆抗體作為配基，制備免疫親和色譜柱，用于黃芪甲苷的特異性分離和純化，為黃芪及其制品的研究提供基礎(chǔ)。

為進一步強化學習效果，提升學生對高效液相色譜法不同分離機制的理解，可以根據(jù)選擇的案例，制訂如下教學方案：（1）學生分組。按照授課人數(shù)，將學生平均分為6～8組。（2）課題設(shè)計。根據(jù)待測物質(zhì)的不同性質(zhì)以及實驗要求，設(shè)計四個研究課題，幫助學生掌握不同的分離原理及檢測方式。人參中不同人參皂苷的分離純化，牛初乳加鈣咀嚼片中免疫球蛋白IgG的含量測定，磷酸硝酸溶液中鈣﹑鎂﹑鐵﹑鋁離子的分離，頭孢克肟顆粒中聚合物的含量測定。（3）分析方法設(shè)計。學生以小組為單位，選擇一個課題研究。利用課余時間查閱文獻，通過分析待測物性質(zhì)及實驗要求，設(shè)計一個或多個合理的分析檢測方法。（4）匯報討論。每個小組推選一名學生，以PPT的形式對本組設(shè)計的實驗方案進行展示，其他學生提問并評價其合理性。

通過案例教學，可以鍛煉學生查閱文獻﹑設(shè)計實驗及團隊合作等各方面的能力，為今后的工作及科研提供助力。同時，在自主學習﹑解決問題的過程中，進一步加深學生對課堂知識的理解，并能舉一反三﹑靈活運用。

三、教學方法探索

只有“儀器分析”課堂教學足夠生動活潑，才能夠激發(fā)學生的學習興趣，從而提升學生的學習自主性，這不僅需要從課堂內(nèi)容下功夫，還要從授課方式上雙管齊下，助力培養(yǎng)能夠真正推動社會發(fā)展的新型人才。下面就“儀器分析”課堂教學方法進行探討，以推進高校課堂“雙一流”建設(shè)。

首先，學生在課堂中能充分表達意見和想法，在思考中碰撞出思維的火花，能夠讓學生在課堂教學中充分發(fā)揮主觀能動性。在課前布置學習任務(wù)，促進學生自主學習，在課堂教學中充分尊重學生的主體地位，爭取把課堂還給學生。如在《緒論》章節(jié)教學中，教師可以組織學生進行“儀器分析與我們?nèi)粘Ｉ畹穆?lián)系”小組討論，列舉日常生活和工作中接觸到的分析儀器及其作用；探討儀器分析的發(fā)展現(xiàn)狀及存在的問題與挑戰(zhàn)。

其次，近年來新的儀器分析方法及檢測技術(shù)均得以迭代升級，雖然基本的分析方法原理依然適用，但是教材中仍存在大量關(guān)于老舊儀器構(gòu)造的內(nèi)容，課堂授課內(nèi)容結(jié)合不同專業(yè)的需求，將相關(guān)科研成果融入課堂，注重跟蹤相關(guān)新技術(shù)﹑新方法，緊跟時代步伐將其反映在教學中。以高水平科學研究支撐高質(zhì)量人才培養(yǎng)，定制具有專業(yè)特色的課堂。

同時，“儀器分析”是一門理論與實踐并重的課程。因此，在理論授課之外，實踐教學也占有重要的地位。從專業(yè)特色出發(fā)設(shè)計應(yīng)用實例，課堂知識緊密聯(lián)系生產(chǎn)實際，最終形成“思考—理論—實踐—解決實際問題”的綜合授課模式。

結(jié)語

目前，本科生的理論課程學時短﹑知識面廣，而實驗教學多為驗證性實驗，學生不能對實驗原理進行深入了解，無法將理論知識與實際操作相結(jié)合。案例教學是一種教師提出案例材料，學生查閱文獻﹑互相討論的模式，讓學生既能掌握基礎(chǔ)專業(yè)知識，也能提高解決實際問題的能力。有效提高學生的科學素養(yǎng)，為日后的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。