劉德芳，晏姣，郭明陽(yáng)，李莞，羅勇，劉濤，楊敏，張耀雷

摘要 目的：探討三黃一龍湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心臟的病理組織學(xué)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）效應(yīng)因子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）和炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)的影響，探討三黃一龍湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)心血管病變的干預(yù)作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：70只Wistar健康雌性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥物組、三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組和安慰劑組，每組10只。除正常組，其余各組大鼠建立佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組分別給予每日生藥量19.8、39.6、79.2 g/kg灌胃，陽(yáng)性藥物組給予來氟米特2.1 mg/kg灌胃，安慰劑組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心臟的病理組織學(xué)變化，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、蛋白印跡法和免疫組化法檢測(cè)外周血和心臟組織AngⅡ、ALD、TNF-α和IL-6的變化。結(jié)果：病理結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，模型組繼發(fā)心肌損傷，主要表現(xiàn)為心肌組織發(fā)生局部炎癥，局部心肌細(xì)胞排列紊亂，個(gè)別大鼠心肌有輕微間質(zhì)水腫。方藥三黃一龍湯能夠顯著改善心肌損傷，使其炎癥病灶縮小，水腫程度減輕，下調(diào)心臟組織AngⅡ和ALD的表達(dá)（P＜0.05），降低外周血和心臟組織TNF-α、IL-6水平（P＜0.05）。結(jié)論：方藥三黃一龍湯可能通過抑制RAAS中AngⅡ和ALD的表達(dá)，減少TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，從而緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)的心血管病變。

關(guān)鍵詞心血管病變；三黃一龍湯；佐劑性關(guān)節(jié)炎；腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，RAAS；腫瘤壞死因子-α

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.008

Effect of Sanhuang Yilong Formula on Angiotensin Ⅱ， Aldosterone and Related Inflammatory Factors in Rats with Cardiovascular Disease Secondary to Adjuvant Arthritis

LIU Defang， YAN Jiao， GUO Mingyang， LI Wan， LUO Yong， LIU Tao， YANG Min， ZHANG Yaolei

General Hospital of Western Theater Command， Chengdu 610073， Sichuan， China

Corresponding AuthorZHANG Yaolei， E-mail： 1449359682@qq.com

AbstractObjective：To investigate the effects of Sanhuang Yilong Formula on heart tissue，renin-angiotensin-aldosterone system（RAAS） and aldosterone（ALD） and inflammatory factors tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6）in the heart of rats with adjuvant arthritis.To explore the intervention effect on secondary cardiovascular disease in adjuvant arthritis rats.Methods：A total of 70 Wistar healthy female rats were randomly divided into normal group，model group，positive drug group，Sanhuang Yilong Formula low-dose group，Sanhuang Yilong Formula medium-dose group，Sanhuang Yilong Formula high-dose group and placebo group，with 10 rats in each group.In addition to the normal group，the other groups of rats constructed? adjuvant arthritis model.Sanhuang Yilong Formula low-dose group，Sanhuang Yilong Formula medium-dose group，Sanhuang Yilong Formula high-dose group were given daily dose of 19.8，39.6 and 79.2 g/kg by gavage，respectively;positive drug group was given leflunomide 2.1 mg/kg by gavage;placebo group was given the equal volume of normal saline by gavage，and the intervention lasted for 4 weeks.Hematoxylin-eosin（HE） was used to observe the histopathological changes of the heart.The changes of AngⅡ，ALD，TNF-α，and IL-6 in peripheral blood and heart tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay，Western Blot and immunohistochemistry.Results：The pathological results showed that compared with the normal group，the model group showed secondary myocardial injury，which was mainly manifested as local inflammation of myocardial tissue，disordered arrangement of local cardiomyocytes，and slight interstitial edema of individual myocardium.Sanhuang Yilong Formula could significantly improve myocardial injury，attenuate inflammatory lesions，reduce edema degree，down-regulated the expression of AngⅡ and ALD in heart tissue（P＜0.05），and decreased the levels of TNF-α and IL-6 in peripheral blood and heart tissue（P＜0.05）.Conclusion：Sanhuang Yilong Formula may alleviate secondary cardiovascular diseases after adjuvant arthritis by inhibiting the expression of Ang-Ⅱ and ALD in the RAAS and attenuating IL-6 and TNF-α production.

Keywordscardiovascular disease; Sanhuang Yilong Formula; adjuvant arthritis; renin-angiotensin-aldosterone system， RAAS; tumor necrosis factor-α

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種致殘率高并累及多系統(tǒng)、多器官的慢性炎癥性風(fēng)濕免疫疾病，RA病人心血管疾病（CVD）發(fā)病率和死亡率顯著增加，超過50%的過早死亡歸因于CVD［1］。RA病人心力衰竭發(fā)生率是普通人群的2倍，且隨著年齡的增加心力衰竭發(fā)生率呈增加趨勢(shì)，女性RA病人心力衰竭發(fā)生率甚至高出普通人群5倍［2］。RA病人心力衰竭的發(fā)病機(jī)制包括缺血性心臟?。↖HD）、炎癥介質(zhì)、抗風(fēng)濕藥物治療和淀粉樣變性［3］，但導(dǎo)致CVD的主要原因尚未明確，故早期防治CVD顯得尤為重要。CVD與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）密切相關(guān)［4］。三黃一龍湯在臨床應(yīng)用10余年，具有苦寒燥濕、通絡(luò)止痛之功效，可降低RA病人炎性指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1、IL-17、干擾素-γ（IFN-γ）表達(dá)水平，改善RA病人臨床癥狀和體征［5-6］。本研究通過構(gòu)建佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討RA心血管病變情況以及三黃一龍湯防治其心血管病變的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雌性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量150～180 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。溫度22～25 ℃，濕度60%，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，倫理審批號(hào)：2022EC1-005。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

三黃一龍湯藥物組成：黃芩15 g，黃連15 g，黃柏15 g，茯苓30 g，威靈仙30 g，秦艽30 g，地龍15 g，白芍30 g，細(xì)辛5 g，生甘草5 g，低、中、高劑量分別配制成濃度為0.99 g/mL、1.98 g/mL、3.96 g/mL的溶液，由中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院提供。來氟米特片，福建匯天生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)191209，規(guī)格為每片10 mg，溶于蒸餾水，制成0.1 g/mL溶液。

1.3主要試劑與儀器

大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（中國(guó)ExCell Bio公司，批號(hào)22J224），IL-6抗體（美國(guó)Genetex公司，批號(hào)GTX110527），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（中國(guó)ExCell Bio公司，批號(hào)22J157），TNF-α抗體（美國(guó)Genetex公司，批號(hào)GTX110520），大鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）ELISA試劑盒（中國(guó)elabscience公司，批號(hào)HRIWM8ND2T），AngⅡ抗體（中國(guó)三鷹公司，批號(hào)18302-1-AP），大鼠醛固酮（aldosterone，ALD）ELISA試劑盒（中國(guó)elabscience公司，批號(hào)6531AFU4HT），ALD抗體（中國(guó)三鷹公司，批號(hào)11159-1-AP），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（中國(guó)博奧森，批號(hào)C-0010），羊抗兔二抗（中國(guó)博奧森公司，批號(hào)bs-0295G），全蛋白提取試劑盒（中國(guó)凱基生物公司，批號(hào)KGP2100），二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（中國(guó)凱基生物公司，批號(hào)KGPBCA），弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)F5881）。電動(dòng)勻漿器（天根）；超低溫冰箱（MDF-U53V，日本松下）；酶標(biāo)儀（普朗）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Thermo ST16R，美國(guó)熱電）；普通光學(xué)顯微鏡（Leica，DM3000，德國(guó)）。

1.4分組、造模與給藥

將70只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥物組、三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組和安慰劑組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)［7］建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，將大鼠直接置于大鼠固定器上，暴露雙側(cè)后足趾，消毒后皮下注射弗氏佐劑0.15 mg/kg，3周后加強(qiáng)免疫，大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、潰爛及行動(dòng)遲緩表明模型成功。按成人體質(zhì)量的每日生藥量190 g/60 kg濃度，三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組分別給予每日生藥量19.8、39.6、79.2 g/kg灌胃，陽(yáng)性藥物組給予來氟米特2.1 mg/kg灌胃，安慰劑組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。正常組與模型組不做任何處理。

1.5血清TNF-α、IL-6水平檢測(cè)

腹腔注射4%水合氯醛1 mL/100 g麻醉大鼠，暴露腹主動(dòng)脈，一次性采血針采血，真空采血管收集，室溫凝固2 h，4 000 r/min離心20 min，分離血清作為待測(cè)樣本。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清TNF-α、IL-6水平。

1.6心臟組織TNF-α、IL-6、AngⅡ和ALD蛋白表達(dá)檢測(cè)

參考文獻(xiàn)［8］的心臟取材方式，應(yīng)用4%水合氯醛1 mL/100 g麻醉大鼠，2 mL空氣栓塞致死，迅速取下心臟，于生理鹽水（含肝素）中洗去血液，至凍存管中保存于－80 ℃。采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)各蛋白表達(dá)變化。首先，利用蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，定量后的蛋白加入loading buffer沸水浴10 min。配制10%分離膠和5%濃縮膠。應(yīng)用10 μg總蛋白進(jìn)行上樣，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），濃縮膠在恒壓80 V、分離膠在恒壓120 V條件下進(jìn)行電脈，300 mA恒流轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜（PVDF）1.5 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗TNF-α和IL-6抗體，anti-AngⅡ和anti-ALD，4 ℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min；羊抗兔二抗1∶4 000室溫孵育40 min，TBST洗膜3次，每次5 min，加入顯影液；通過凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，并計(jì)算各組灰度值。

1.7蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心臟組織病理學(xué)變化

取出各組大鼠心臟，洗去多余血液后移入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，包埋于石蠟中，4 μm切片，烤片1 h，常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木素染色4 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化2次，每次5 s，流水沖洗返藍(lán)10 min，伊紅染色5 s，流水迅速?zèng)_洗多余伊紅，室溫干燥后用中性樹膠封片。于普通光學(xué)顯微鏡（DM3000，德國(guó)萊卡）100倍下觀察各組心臟組織病理學(xué)變化。

1.8免疫組化法檢測(cè)心臟組織中AngⅡ和ALD表達(dá)變化

取大鼠的心臟組織，采用免疫組化法檢測(cè)。脫蠟復(fù)水前與HE染色步驟相同，脫蠟復(fù)水后于酸修復(fù)液中微波爐沸水浴5 min，自然冷卻至室溫，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗3 min，移入3%H2O2中10 min，PBST洗3 min，山羊血清封閉20 min，加入一抗anti-AngⅡ和anti-ALD，4 ℃孵育過夜。將玻片置于PBST洗3次，每次3 min，加入生物素標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG聚合物，室溫孵育20 min，PBST洗3次，每次3 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素，室溫孵育20 min，PBST洗3次，每次3min，加入DAB顯色液顯色2 min，置于流水終止顯色，玻片放入蘇木素染色4 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化2次，每次5 s，流水沖洗返藍(lán)10 min，室溫干燥后用中性樹膠封片。于普通光學(xué)顯微鏡（DM3000，德國(guó)萊卡）100倍下觀察各組心臟病理變化，利用image pro plus測(cè)定各組陽(yáng)性區(qū)域面積及光密度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若符合參數(shù)檢驗(yàn)，組間比較采用one-way ANOVA，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若不符合，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠心臟組織病理學(xué)變化

與正常組比較，模型組心臟組織發(fā)生局部炎癥，局部心肌細(xì)胞排列紊亂，個(gè)別大鼠心肌有輕微間質(zhì)水腫。與模型組比較，三黃一龍湯低、中、高劑量組均能改善心肌損傷，其中以中劑量更為顯著，主要表現(xiàn)為炎癥病灶更小，水腫程度更輕；安慰劑組心肌組織無(wú)顯著變化。詳見圖1。

2.2各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6水平比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組TNF-α、IL-6水平降低，其中以三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組更為顯著（P＜0.05）。詳見圖2、圖3。

2.3各組大鼠心臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），其中以三黃一龍湯高劑量組TNF-α蛋白表達(dá)水平降低最明顯（P＜0.05）。詳見圖4～圖6。

2.4各組大鼠心臟組織AngⅡ、ALD表達(dá)變化

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織AngⅡ、ALD蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組AngⅡ、ALD蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；三黃一龍湯低劑量組、三黃一龍湯中劑量組、三黃一龍湯高劑量組AngⅡ、ALD蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），其中三黃一龍湯中、低劑量組AngⅡ、ALD蛋白表達(dá)降低最明顯（P＜0.05）。詳見圖7～圖10。

3討論

RA病人患CVD的風(fēng)險(xiǎn)主要在于高水平炎癥相關(guān)特異性因子，其中TNF-α通過核因子-κB（NF-κB）通路參與RA伴發(fā)CVD的血管慢性炎癥病程，IL-6是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要參與者［9］。RA病人的炎癥活動(dòng)期，左心室舒張功能受損，左心室相對(duì)壁厚指數(shù)增大［10］，增加了心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)［11-12］。RA與不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有相同的炎癥機(jī)制，TNF-α和IL-6表達(dá)升高，而抗風(fēng)濕藥甲氨蝶呤、TNF-α抑制劑和IL-6受體拮抗劑可降低CVD風(fēng)險(xiǎn)［13］，其中IL-6受體拮抗劑可降低N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平，改善血管內(nèi)皮功能和左心室射血分?jǐn)?shù)及臨床癥狀［14-15］。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的心房顫動(dòng)誘導(dǎo)率和持續(xù)時(shí)間顯著增加，且心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間與TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)［16］。因此，控制RA的疾病活動(dòng)對(duì)防治其臨床心臟病的進(jìn)展非常重要。

研究表明，三黃一龍湯可通過抑制TNF-α、IL-6、IL-17等表達(dá)而控制RA疾病活動(dòng)度，改善其臨床癥狀［5-6］。三黃一龍湯以黃芩、黃連、黃柏3味藥為君藥，黃芩的主要化學(xué)成分黃芩苷具有心臟保護(hù)作用，與調(diào)節(jié)其氧化應(yīng)激與炎癥相關(guān)［17-18］；黃連的主要成分黃連素可通過灌胃大鼠顯著改善AngⅡ誘發(fā)的心肌纖維化，減輕其引發(fā)的心功能不全［19］；黃柏的主要成分黃柏堿可通過減少心肌細(xì)胞凋亡及抑制TNF-α、IL-1β表達(dá)而改善小鼠內(nèi)毒素性心功能障礙［20］。因此，推測(cè)三黃一龍湯對(duì)RA繼發(fā)的心血管疾病具有保護(hù)作用。但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

本研究中，通過HE染色觀察了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心臟組織病理組織學(xué)變化，主要表現(xiàn)為心臟組織發(fā)生局部炎癥，局部心肌細(xì)胞排列紊亂，個(gè)別大鼠心肌有輕微間質(zhì)水腫。采用ELISA和Western Blot檢測(cè)了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血及心臟組織TNF-α、IL-6水平，表現(xiàn)出TNF-α、IL-6表達(dá)上調(diào)；通過Western Blot和免疫組化法檢測(cè)了AngⅡ和ALD，結(jié)果顯示，AngⅡ、ALD表達(dá)顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明佐劑性關(guān)節(jié)炎可激活RAAS導(dǎo)致AngⅡ、ALD表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎性因子TNF-α、IL-6產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)心血管損傷。

本研究還觀察了三黃一龍湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心臟組織病理組織學(xué)及外周血和心臟組織TNF-α、IL-6、AngⅡ及ALD表達(dá)的影響，病理學(xué)表現(xiàn)出三黃一龍湯低、中、高劑量組均能改善心肌損傷，其中以中劑量更為顯著，主要表現(xiàn)為炎癥病灶更小，水腫程度更輕；三黃一龍湯不同劑量均可不同程度地降低外周血和心臟組織中TNF-α、IL-6水平，并能降低心臟組織中AngⅡ、ALD蛋白表達(dá)水平。表明三黃一龍湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎誘發(fā)的心臟損傷具有保護(hù)作用，可能通過抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎系統(tǒng)AngⅡ、ALD的激活減少炎性因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生而改善佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)心血管損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)了三黃一龍湯可能通過抑制AngⅡ、ALD表達(dá)而減少炎性因子的產(chǎn)生，從而緩解RA繼發(fā)心臟損傷，但其具體機(jī)制和主要有效活性成分還需要進(jìn)一步研究闡明。

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（收稿日期：2022-06-26）

（本文編輯鄒麗）