張丹丹?趙浩然?劉文坤?李寧寧?常笑?陳德俊

摘要：目的 對(duì)頭孢克洛中聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行初步分析。方法 以0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）為溶劑，室溫放置4 d，制備頭孢克洛強(qiáng)制聚合溶液；采用HPSEC法對(duì)強(qiáng)制聚合物溶液中各雜質(zhì)進(jìn)行分離，結(jié)合二維液相脫鹽技術(shù)、柱切換-LC/MSn技術(shù)，根據(jù)各雜質(zhì)一級(jí)、二級(jí)精確質(zhì)量信息及聚合機(jī)制，初步鑒定主峰前各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 對(duì)頭孢克洛強(qiáng)制聚合溶液中的9個(gè)聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析，并初步分析其產(chǎn)生機(jī)理。結(jié)論 強(qiáng)制聚合溶液可作為頭孢克洛原料及制劑中聚合物雜質(zhì)研究分析用系統(tǒng)適用性溶液。本研究中推測(cè)的聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)頭孢克洛原料及其制劑的雜質(zhì)譜研究及質(zhì)量控制有重要參考意義。

關(guān)鍵詞：頭孢克洛；聚合物雜質(zhì)；化學(xué)結(jié)構(gòu)；柱切換-LC/MSn；二維液相色譜

中圖分類號(hào)：R978.1，R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Analysis of polymer impurities of cefaclor

Abstract Objective To identify the structures of polymer impurities in cefaclor raw materials. And the mechanisms of their production were analyzed. Methods The cefaclor forced-polymerization solution was prepared with 0.05 mol/L phosphate buffer （pH8.0） at room temperature for 4 days. The impurities in the forced-polymerization solution were separated by HPSEC method， and the structures of the impurities before the main peak were identified according to the primary and secondary precise mass information and the polymerization mechanism， combined with two-dimensional liquid desalination technology and column switching LC/MSn technology. Results Preliminary elucidation was conducted on 9 polymer impurity structures present in the cefaclor forced-polymerization solution. Concurrently， an examination was conducted on their mechanisms of production. Conclusions The cefaclor forced-polymerization solution can be used as suitable solution for the study and analysis of polymer impurities in cefaclor. The predicted polymer impurity structures in this study have important reference significance for the impurity profile study and quality control of cefaclor raw materials and their preparations.

Key words Cefaclor; Polymer impurities; Chemical structure; Column switch-LC/MSn; 2D-HPLC

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床廣泛使用的抗菌藥物，其原料與制劑在生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)過程中易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì)[1]。β-內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物雜質(zhì)容易引發(fā)過敏反應(yīng)甚至過敏性休克反應(yīng)，但卻是其雜質(zhì)譜控制中相對(duì)薄弱的環(huán)節(jié)[1-2]。隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物的認(rèn)知也不斷深入[3-5]。

頭孢克洛（cefaclor）為第二代半合成頭孢菌素，最早由美國(guó)禮來(lái)制藥公司成功研制。其作用機(jī)制是通過與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白相結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，臨床適用于敏感菌所致泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚軟組織感染等[6-7]。頭孢克洛化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，其C7位側(cè)鏈上有自由氨基，易于與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合，從而生成頭孢克洛聚合物雜質(zhì)。

目前，國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)頭孢克洛中的聚合物雜質(zhì)均未予以控制。雖有文獻(xiàn)采用Sephadex G-10凝膠色譜柱[8]及TSKgel G2000SWxl色譜柱法[9-10]對(duì)頭孢克洛制劑中的聚合雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，但是對(duì)頭孢克洛聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究卻鮮有報(bào)道。本文采用二維液相色譜法結(jié)合柱切換-LC/MSn法對(duì)頭孢克洛原料中的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)合頭孢克洛結(jié)構(gòu)性質(zhì)、雜質(zhì)的質(zhì)譜信息及聚合機(jī)制，推測(cè)聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)并探討其可能來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 儀器

MS105DU型電子天平，Thermo Q-Exactive plus二維高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有雙三元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、變色龍軟件、Q-Exactive plus質(zhì)譜檢測(cè)器、Mass frontier7.0軟件）。

1.2 樣品與試劑

頭孢克洛原料藥（生產(chǎn)廠家：齊魯安替制藥有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（分析純；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；磷酸（分析純；天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨、乙腈（色譜純；Fisher Scientific）；去離子水為屈臣氏瓶裝純凈水。

1.3 高效凝膠排阻色譜（HPSEC）方法

色譜柱：TSK-gel G2000 SWxl（填料：球狀親水硅膠，300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液[0.005 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61：39）]- 乙腈（94：6）；檢測(cè)器：263 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；用于HPSEC法分離頭孢克洛中聚合物雜質(zhì)。

1.4 柱切換-LC-MS法

1.4.1 一維色譜系統(tǒng)

方法同“1.3”高效凝膠排阻色譜（HPSEC）方法，進(jìn)樣體積增加至40 μL。

1.4.2 二維色譜系統(tǒng)

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（C18，

2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：5 mmol/L醋酸銨溶液，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫：0～（t+6） min （t為目標(biāo)雜質(zhì)在一維色譜系統(tǒng)的保留時(shí)間），5%B；（t+6）→（t+21） min，5%～95%B；（t+21）→（t+26） min，95%B；（t+22）→（t+27）min，5%B。切換閥：六通閥；切換用定量環(huán)體積：500 μL。用于對(duì)一維色譜系統(tǒng)分離的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行脫鹽處理及質(zhì)譜定性研究。

1.4.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；掃描電壓：3.8 kV；毛細(xì)管溫度： 320 ℃；鞘氣流速：40 mL/min；輔助氣流速：10 mL/min；一級(jí)質(zhì)譜方法：正離子模式，分辨率70000，掃描范圍m/z 100～1500；二級(jí)質(zhì)譜方法：分辨率17500，NCE：10，20，30。

1.5 強(qiáng)制聚合溶液配制

0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）：0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61：39），并用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。

強(qiáng)制聚合溶液：精密稱取頭孢克洛約140 mg，置10 mL量瓶中，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）制成約含頭孢克洛14 mg/mL的溶液。室溫條件下避光放置4 d，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2 結(jié)果

2.1 HPSEC法分析頭孢克洛原料中聚合物雜質(zhì)

參照《中國(guó)藥典》2020年版頭孢地嗪鈉[11]有關(guān)物質(zhì)Ⅱ檢查方法及文獻(xiàn)[9]，進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化。建立的HPSEC法分析頭孢克洛強(qiáng)制聚合溶液，在頭孢克洛主峰之前分離出6個(gè)弱保留值雜質(zhì)（圖2），即雜質(zhì)1～6。

2.2 柱切換-LC/MS法推測(cè)頭孢克洛聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

采用在線柱切換-LC/MS法將雜質(zhì)1～6分別切入至定量環(huán)中，經(jīng)脫鹽處理后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，雜質(zhì)5峰中包括4個(gè)共流出雜質(zhì)峰，其他5個(gè)雜質(zhì)峰中分別含有1個(gè)雜質(zhì)峰。結(jié)合頭孢克洛結(jié)構(gòu)性質(zhì)、雜質(zhì)的質(zhì)譜信息及聚合機(jī)制，推斷質(zhì)譜中分析出的9個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及來(lái)源，初步可推定其中6個(gè)聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其他3個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及來(lái)源有待進(jìn)一步研究。

2.2.1 已推定的聚合物雜質(zhì)

雜質(zhì)2經(jīng)柱切換進(jìn)入質(zhì)譜后，可檢出雜質(zhì)2-a（圖3A）。在雜質(zhì)2-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 1397.21、m/z 1419.19的準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H]+、[M+Na]+峰，推測(cè)雜質(zhì)2-a的分子量為1396 Da（圖3B）；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 699.11的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)2-a的單體加氫離子（圖3B）；其可能結(jié)構(gòu)及來(lái)源見圖3C。初步推測(cè)其聚合反應(yīng)過程：頭孢克洛C-3位水解成羥基后，與另一分子頭孢克洛通過酰胺化聚合生成聚合物1或聚合物2；聚合物1、聚合物2的自身再聚合以及聚合物1和聚合物2之間的再聚合均可生成雜質(zhì)2-a。聚合位點(diǎn)主要包括頭孢克洛、頭孢克洛C-3水解物7位側(cè)鏈的游離氨基和四元內(nèi)酰胺環(huán)，理論上可形成多種異構(gòu)體。

將雜質(zhì)5切換至質(zhì)譜可以檢出4個(gè)共流出的雜質(zhì)峰（雜質(zhì)5-a，雜質(zhì)5-b，雜質(zhì)5-c，雜質(zhì)5-d）（圖4）。在雜質(zhì)5-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 699.15準(zhǔn)分子離子峰（[M+H]+）；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 350.08的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)5-a的單體加氫離子；即雜質(zhì)5-a的分子量應(yīng)為698 Da。在其二級(jí)質(zhì)譜圖中，存在羥基脫水碎片m/z 681.14 （m/z 699-18），脫羧基碎片m/z 655.12（m/z 699-44）。初步推測(cè)，此聚合物雜質(zhì)系由頭孢克洛C-3位水解后自身聚合而成。其可能結(jié)構(gòu)及來(lái)源見圖5A。

在雜質(zhì)5-b的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z

663.13、m/z 685.11的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在

m/z 332.07的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)5-a的單體加氫離子；推測(cè)雜質(zhì)5-b的分子量為662 Da。在其二級(jí)質(zhì)譜圖中，脫羧基碎片m/z 619.15（m/z 663-44）。初步推測(cè)，頭孢克洛水解后經(jīng)分子內(nèi)酰胺化生成哌嗪類衍生物（即中間體1），再經(jīng)分子內(nèi)重排、脫水，生成吡嗪類衍生物（即中間體2），中間體2與其C-3位水解物（即中間體3）發(fā)生酰胺化反應(yīng)生成雜質(zhì)5-b。其結(jié)構(gòu)及來(lái)源分析見圖5B。

在雜質(zhì)5-c的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在

m/z 699.15、m/z 716.18的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+NH4]+峰；且其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 350.08的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)5-c的單體加氫離子。即雜質(zhì)5-c的分子量應(yīng)為698 Da，初步推測(cè)其為聚合物雜質(zhì)5-a的差向異構(gòu)體。

在雜質(zhì)5-d的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z

735.09、m/z 757.07的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在

m/z 368.05的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)5-d的單體加氫離子。即雜質(zhì)5-d的分子量為734 Da，推測(cè)其應(yīng)為頭孢克洛二聚物或頭孢克洛差向異構(gòu)體二聚物，其結(jié)構(gòu)及來(lái)源分析見圖5C。

將雜質(zhì)6經(jīng)柱切換進(jìn)入質(zhì)譜后可檢出雜質(zhì)6-a（圖6）。在雜質(zhì)6-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z735.09、m/z 757.07的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 368.05的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)6-a的單體加氫離子。即雜質(zhì)6-a的分子量應(yīng)為734 Da，與雜質(zhì)5-d分子量相同。推測(cè)其為頭孢克洛二聚物或頭孢克洛差向異構(gòu)體二聚物。

2.2.2 有待進(jìn)一步研究的雜質(zhì)

將雜質(zhì)1經(jīng)柱切換進(jìn)入質(zhì)譜后，可檢出雜質(zhì)1-a（圖7A）。在雜質(zhì)1-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 1030.17、m/z 1052.15的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+峰，推測(cè)雜質(zhì)1-a的分子量為1029 Da。1032峰、1034峰為1030峰的氯同位素峰， 1030峰、1032峰、1034峰豐度比為9：6：1，表示分子內(nèi)含2個(gè)氯原子。但其具體結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

將雜質(zhì)3經(jīng)柱切換進(jìn)入質(zhì)譜后，可檢出雜質(zhì)3-a（圖7B）。在雜質(zhì)3-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 935.12準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 468.06的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)3-a的單體加氫離子。初步推測(cè)雜質(zhì)3-a的分子量為934 Da，可能為頭孢克洛二聚體衍生物，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

將雜質(zhì)4經(jīng)柱切換進(jìn)入質(zhì)譜，可分析檢出雜質(zhì)4-a（圖7C）。在雜質(zhì)4-a的全掃描一級(jí)質(zhì)譜圖中存在

m/z 879.13、 m/z 901.11的準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H]+、

[M+Na]+峰；其二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z 440.07的分子離子峰，應(yīng)為聚合物雜質(zhì)4-a的單體加氫離子。初步推測(cè)雜質(zhì)4-a的分子量應(yīng)為878 Da，可能為頭孢克洛二聚體衍生物，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

3 討論

由頭孢克洛的分子結(jié)構(gòu)可知，其聚合反應(yīng)途徑主要為C-7位側(cè)鏈的伯氨基與另一分子母核四元內(nèi)酰胺環(huán)的羰基的反應(yīng)[2]。本研究對(duì)頭孢克洛聚合物雜質(zhì)的LC-MS分析揭示，其主要為頭孢克洛或頭孢克洛水解物按上述機(jī)理反應(yīng)形成的二聚體或多聚體，與C-7位含有相似側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的頭孢氨芐、頭孢拉定等的聚合反應(yīng)途徑相似。但由于頭孢克洛C-3位的氯基團(tuán)較易水解成羥基，其水解物可能發(fā)生分子內(nèi)酰胺化生成哌嗪類衍生物，再經(jīng)分子內(nèi)重排、脫水，生成吡嗪類衍生物參與聚合反應(yīng)，又使得其與頭孢拉定、頭孢氨芐的聚合反應(yīng)途徑的不同，表現(xiàn)出一定的復(fù)雜性，這可能是出現(xiàn)多個(gè)尚待進(jìn)一步研究的雜質(zhì)的原因。

本研究制備了頭孢克洛強(qiáng)制聚合反應(yīng)溶液，采用HPSEC法進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合2D-HPLC、柱切換-LC/MS現(xiàn)代色譜分析技術(shù)，對(duì)頭孢克洛的聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)合頭孢克洛結(jié)構(gòu)性質(zhì)、雜質(zhì)的質(zhì)譜信息及頭孢菌素的聚合反應(yīng)機(jī)制，對(duì)頭孢克洛聚合物雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并初步推測(cè)了其產(chǎn)生機(jī)制，為后續(xù)頭孢克洛聚合物的研究及抗生素中聚合物雜質(zhì)的形成機(jī)理研究提供了參考。同時(shí)，對(duì)頭孢克洛原料及制劑的雜質(zhì)譜研究、質(zhì)量控制具有重要參考意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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