王靜，李亞群，汪海燕，宋曜如，李靜,3，王文鑫,3，萬林鈺，周春保，范興*，王福生*

1中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院，安徽合肥 230001；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心感染病醫(yī)學部/國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100039；3北京大學302臨床醫(yī)學院，北京 100039

新 型 冠 狀(新 冠)病 毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)疫苗是預防新冠病毒感染(coronavirus disease，COVID-19)重癥化及死亡的重要手段。截至2022年12月，全球范圍內(nèi)已接種疫苗130 億劑次，其中1/4 為滅活病毒疫苗[1]。盡管接種滅活疫苗的人群基數(shù)大，但與mRNA 疫苗或腺病毒疫苗相比，關(guān)于滅活疫苗誘導的細胞免疫反應的研究較少。

當下流行的Omicron 毒株逃逸中和抗體的能力強，難以避免突破感染[2]，新冠病毒免疫應答的研究重點開始從保護機體免受感染(主要由抗體介導)轉(zhuǎn)向降低機體感染后疾病重癥化的風險(主要由細胞免疫介導)[3-5]。多項研究表明，T細胞在預防疾病嚴重程度方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。與體液免疫相比，細胞免疫具有抗原表位保守及衰退速度慢等多方面的優(yōu)勢[8-9]。mRNA 疫苗只能誘導S 蛋白特異性T 細胞反應，滅活疫苗具有N、M、E 等其他抗原蛋白，從而能誘導更加廣譜的特異性T 細胞應答[10-11]。既往關(guān)于滅活疫苗T 細胞應答的研究主要集中在接種疫苗后的短期效應上，且缺乏對抗原特異性T 細胞表型的詳細分析[12]。為探究滅活疫苗誘導的SARSCoV-2特異性T細胞反應的特征及持久性，本研究分析了15名成年個體接種2劑滅活疫苗12個月后外周血中特異性T 細胞的水平及表型特點，并探討了其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入來自解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心2022 年4-6 月招募的15 名醫(yī)護人員。納入標準：(1)年齡≥18 歲；(2)接種過2 劑新冠滅活疫苗。排除標準：(1)對疫苗成分有過敏反應史；(2)既往有SARS-CoV-2感染史；(3)既往有精神疾病或藥物依賴史；(4)不同意參與研究。本研究獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：2020-013-D)。所有受試者在采血前簽署書面知情同意書。15 名研究對象的中位數(shù)年齡為26(23～45)歲；其中男4名，女11名；均無吸煙史、飲酒史及過敏史。所有個體均接種2 劑滅活疫苗，其中接種北京科興滅活疫苗12名，北京生物滅活疫苗3名，2劑疫苗接種間隔28 d[13]，在接種第2劑疫苗351(342～408)d后，收集其外周靜脈血，分析抗原特異性T細胞反應。

1.2 方法

1.2.1 外周血標本及淋巴細胞分離 用EDTA-K2 采血管(美國BD 公司)收集受試者外周靜脈血8～10 ml，4 h 內(nèi) 分 離 外 周 血 單 個 核 細 胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，室溫環(huán)境下以2000 r/min離心10 min，吸取上清血漿保存于-80 ℃，下層部分與等體積PBS混勻后均勻鋪于Ficoll淋巴細胞分離液上，調(diào)整升速及降速至最低檔，以2500 r/min 離心20 min，吸取白膜層，補加PBS 至10 ml，充分混勻后，以2000 r/min離心15 min，洗滌細胞。計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為5×106～1×107個/ml，加入1 ml 細胞凍存液，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 活 化 誘 導 標 記 法(activation-induced markers，AIM)檢測SARS-CoV-2 特異性T 細胞[14]將1×106個PBMCs細胞置于96孔圓底板中，S組、NS組分別加入5 μg/ml SARS-CoV-2 Spike、Non-spike 特異性肽池(附表，江蘇南京金斯瑞公司合成)，加入100 μl無血清培養(yǎng)基(美國Thermo 公司)，2 h 后加入等體積含10%成人血清(北京科霖恩公司)的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將等摩爾量的二甲基亞砜(DMSO，德國WAK 公司)加入DMSO 組，作為陰性對照。24 h 后收集細胞，加入流式抗體CD14-BV510、 CD16-BV510、 CD19-BV510、 CD56-BV510、CD4-AF700、CD8-PerCP-Cy5.5、CD69-BV421、OX40-PE、CD137-APC、CD45RA-BV605、CD27-PECy7、CXCR3-APC-Cy7、CCR6-BV650、CXCR5-BV711(美 國Biolegend 公 司)及Fixable Viability Stain 510、CD3-BUV395、CCR7-BUV496(美國BD 公司)，混合均勻后于4 ℃孵育0.5 h進行表面染色，PBS洗滌，加入200 μl 含1%多聚甲醛的固定液固定細胞，并于24 h內(nèi)置于FACS Symphony A5型流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用卡方檢驗；連續(xù)變量以中位數(shù)表示，組間比較采用Wilcoxon 檢驗(配對數(shù)據(jù))或Mann-Whitney U 檢驗(非配對數(shù)據(jù))。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 成年人接種2 劑新冠滅活疫苗12 個月后T 細胞應答水平 接種第2 劑疫苗后，與DMSO 組相比，大部分個體SARS-CoV-2特異性CD4+T細胞反應水平升 高(S 組： 14/15， P=0.0001； NS 組： 15/15，P＜0.0001)。S 組 特 異 性CD8+T 細 胞 反 應 水 平 比DMSO 組 略 升 高(12/15，P=0.0463)，NS 組 特 異 性CD8+T 細胞反應水平與DMSO 組比較差異無統(tǒng)計學意義(12/15，P=0.0806)，故本研究主要研究CD4+T細胞免疫應答情況。相較于Spike抗原，Non-spike抗原表位同樣也能誘導高水平的特異性CD4+T細胞反應(P＜0.0001，圖1)。

2.2 成年人接種2劑新冠滅活疫苗12個月后抗原特異性T 細胞記憶表型特征 接種2 劑新冠滅活疫苗12 個月后，總CD4+T 細胞主要由中央記憶細胞(central memory，CM：CD45RA-CD27+CCR7+)、1 型效應記憶細胞(effector memory 1，EM1：CD45RA-CD 27+CCR7-)及3 型效應記憶細胞(effector memory 3，EM3：CD45RA-CD27-CCR7-)組成。與總CD4+T 細胞相比，抗原特異性CD4+T 細胞中CM 表型占比增加(S組：64.5% vs.32.8%，P=0.0001；NS組：60.6% vs.32.8%，P＜0.0001)，EM3表型占比下降(S組：2.6% vs.24.4%，P＜0.0001；NS 組：1.0% vs.24.4%，P＜0.0001)。Spike抗原與Non-spike抗原誘導的抗原特異性T細胞記憶表型差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

2.3 成年人接種2劑新冠滅活疫苗12個月后抗原特異性T 細胞分化亞群表型特征 接種2 劑滅活疫苗12個月后，總CD4+T細胞主要由濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell，TFH：CXCR5+)、1 型輔助性T 細胞(T helper 1，Th1：CXCR5-CXCR3+CCR6-)及2 型輔助性T 細胞(T helper 2，Th2：CXCR5-CXCR 3-CCR6-)組成。與總CD4+T細胞相比，抗原特異性CD4+T 細胞表型主要表現(xiàn)為Th2 及1/17 型輔助性T細 胞(T helper 1/17，Th1/17：CXCR5-CXCR3+CCR 6+)表 型，TFH 及Th1 表 型CD4+T 細 胞 比 例 較 低(TFH：S 組 為8.6% vs.18.7%，P=0.0006，NS 組 為5.3% vs.18.7%，P＜0.0001；Th1：S組為3.8% vs.24.3% ，P＜0.0001，NS 組為2.1% vs.24.3%，P＜0.0001)。Spike抗原與Non-spike抗原特異性CD4+T細胞亞群分化表型方面無明顯差別(P＞0.05，圖3)。

3 討 論

SARS-CoV-2 突變株，尤其是Omicron 的出現(xiàn)從根本上改變了COVID-19的流行方式及防疫政策的制定。Omicron突變株能夠逃避基于武漢原始毒株疫苗誘導的抗體中和能力[3-4]，而細胞免疫成為預防感染重癥化的關(guān)鍵[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，成年人接種2劑滅活疫苗12個月后，體內(nèi)仍能檢測到SARS-CoV-2特異性CD4+T細胞，且Non-spike也可以作為優(yōu)勢抗原引起較強的抗原特異性CD4+T細胞反應。SARS-CoV-2特異性CD4+T 細胞以CM 及EM1記憶表型為主，暗示了其具有較強的維持能力；同時病毒特異性CD4+T 細胞大量富集Th2 及Th1/17 表型?？傊@些數(shù)據(jù)證實新冠滅活疫苗能誘導廣泛且持久的抗病毒CD4+T 細胞反應，可能是在Omicron 毒株大流行的情況下減輕感染者疾病嚴重程度的關(guān)鍵。

本研究發(fā)現(xiàn)，滅活疫苗能夠誘導強烈的Spike及Non-spike 抗原特異性CD4+T 細胞反應。除SARSCoV-2 病毒Spike 之外的抗原蛋白，如N、M、NSP3等，同樣能誘導強烈的T 細胞反應，是誘導細胞免疫的重要抗原[17]。mRNA疫苗引起的抗原負荷較高，能誘導強烈的體液免疫，但mRNA 疫苗是針對Spike蛋白設計的疫苗，只能誘導Spike特異性的T細胞反應[18]。滅活疫苗具有較強的體液免疫效應，而誘導細胞免疫的能力較弱，但其具有SARS-CoV-2的所有抗原蛋白，誘導的T 細胞反應更廣泛，具有與mRNA 疫苗相當?shù)募毎庖哒T導能力[11]。本研究進一步證實了滅活疫苗接種者T 細胞反應的廣泛性，提示其能在Omicron 疫情期間發(fā)揮重要的免疫保護作用。

有研究表明，SARS-CoV-2 感染康復者及健康個體在mRNA 疫苗接種后至少6 個月內(nèi)能維持穩(wěn)定的細胞免疫水平[9]。接種2劑滅活疫苗4個月后，健康個體體內(nèi)T 細胞免疫反應水平隨時間延長而下降，但在感染康復者體內(nèi)誘導了持久的T 細胞反應[19]。本研究探討了成年人接種2劑滅活疫苗后T細胞免疫反應的持續(xù)性，發(fā)現(xiàn)滅活疫苗誘導的CD4+T細胞免疫反應至少能持續(xù)12 個月，且以CM 及EM1 記憶表型為主，暗示了其具有很強的持續(xù)能力。目前國內(nèi)正經(jīng)歷Omicron 毒株快速傳播的時期，但感染者重癥化比例及病死率都很低，這可能與滅活疫苗誘導的T細胞免疫反應有關(guān)[20-21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，滅活疫苗誘導的T 細胞免疫反應主要是CD4+T細胞免疫反應。由于抗原遞呈方式等方面的差異，滅活疫苗主要誘導CD4+T細胞免疫反應，而誘導CD8+T細胞免疫應答的能力較弱[11]。另外，與抗原特異性CD4+T 細胞相比，抗原特異性CD8+T細胞的衰減速度更快，在接種疫苗6個月后，大部分個體已不能檢測到抗原特異性CD8+T 細胞反應[9]。

CD4+T細胞亞群分化受到TCR信號強弱及微環(huán)境中細胞因子的影響[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種疫苗12個月后，抗原特異性CD4+T細胞以Th2及Th1/17為主。其中，高比例Th2 表型抗原特異性CD4+T 細胞的出現(xiàn)，可能是由于隨著時間的推移，CD4+T細胞活化狀態(tài)的改變以及CXCR5、CCR6、CXCR3 等標志物表達下調(diào)造成的，CXCR5-CXCR3-CCR6-表型的CD4+T 細胞中只有一部分表達Th2 相關(guān)效應分子[7,23]。Th1/17 表型CD4+T 細胞是一種中間分化態(tài)的細胞亞群，能夠分泌Th1及Th17亞群相關(guān)的細胞因子，可能會通過分泌Th1 相關(guān)細胞因子，發(fā)揮抗病毒免疫反應的作用[24]?？乖禺愋訡D4+T細胞中這兩個亞群的細胞是否具有相應的功能，仍需要進一步研究。

本研究尚存在一些局限性：一是僅檢測了抗原特異性CD4+T細胞的水平及表型特點，疫苗接種后抗體水平、記憶B 細胞水平未研究；二是未排除其他冠狀病毒感染，無法除外有交叉反應的個體；三是受試者樣本量少，且只隨訪1 次，未能檢測到基線及接種疫苗后T 細胞水平的動態(tài)變化，后續(xù)研究中可適當增加隨訪次數(shù)及樣本量，以探索T 細胞的動態(tài)變化。

綜上所述，本研究描述了成年人接種2 劑滅活疫苗后長期記憶性CD4+T 細胞的水平及表型特點。在Omicron 大流行的時期，大量接種滅活疫苗誘導的廣泛且持續(xù)的CD4+T 細胞反應是免疫保護的關(guān)鍵。本研究為后續(xù)基于T 細胞免疫應答的新冠病毒疫苗開發(fā)提供了新的實驗證據(jù)。