孫曉瑜 , 單 虎 , 黃 娟

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 , 山東 青島 266109 ; 2.山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室 , 山東 青島 266109 ;3.山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心 , 山東 青島 266109)

豬博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)于2009年首次被發(fā)現(xiàn),是從瑞典患有仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬體內(nèi)檢測到的[1]。不少學(xué)者推測PBoV與豬的腹瀉疾病和呼吸道疾病有關(guān)[2],但目前與其致病性相關(guān)的研究較少,適合PBoV體外培養(yǎng)的傳代細胞系也尚未見報道[3]。PBoV常與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)混合感染[4],與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)等也存在較為普遍的共感染現(xiàn)象[5]。目前,我國對于該病毒的研究相對較少,病毒基因組學(xué)信息也不夠豐富,因此,對PBoV進行分子流行病學(xué)調(diào)查和遺傳學(xué)分析,對其防控具有重要意義。

PBoV屬于細小病毒科、博卡病毒屬[6],是一種單鏈線性DNA病毒,無囊膜,二十面體對稱,基因組大小約為5 kb[7]。PBoV基因組由3個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)組成。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1,ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,ORF3位于ORF1和ORF2之間,編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1[8]。根據(jù)NS1蛋白的差異,曾將PBoV分為PBoV 1～5型共5個基因型,且各個基因型之間的同源性較低[9]。隨后有研究提出,將PBoV分為3個不同的群,即PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3[2]。也有研究者提議,如果PBoV的NS1蛋白氨基酸序列同源性低于85%,則將其指定為新毒株[10]。VP1和VP2在基因組上存在序列重疊,VP1序列包含整個VP2序列和1個N-末端區(qū)域(約227個氨基酸),該N-末端區(qū)域稱為VP1獨特區(qū)域(VP1 unique region,VP1u)[11]。PBoV的VP1u存在分泌型磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)基序[12]。序列分析發(fā)現(xiàn),與PBoV同科的大多數(shù)細小病毒在該區(qū)域中都含有保守結(jié)構(gòu)域,在催化位點中具有保守的HDXXY基序,在鈣結(jié)合環(huán)中具有保守的YXGXF基序,具有PLA2活性[13]。

傳統(tǒng)的核酸檢測方法往往需要已知病毒的基因組序列才能進行檢測,Illumina平臺可以對未知病毒進行深度測序,這對于發(fā)現(xiàn)新病原、檢測混合感染和診斷復(fù)雜病例具有重要意義[14]。本試驗利用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)在山東地區(qū)檢測到了PBoV,獲得了3 801 bp的基因組序列,并進行了基因序列特征分析,為未來PBoV全基因組測序和流行病學(xué)調(diào)查提供了基因組數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline,DPBS)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid,EGTA]和三乙?；宜峋彌_液(Tris acetate-EDTA buffer,TAE),均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;微球菌核酸酶,New England Biolabs(NEB)公司產(chǎn)品;病毒核酸提取試劑盒,廣州美基生物科技有限公司產(chǎn)品;PremixTaq和DNA Marker,均為TaKaRa公司產(chǎn)品;瓊脂糖,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 離心機,德國艾本德(Eppendorf)公司產(chǎn)品;水浴鍋,江蘇科析儀器有限公司產(chǎn)品;0.45 μm過濾器和Amicon?Ultra-15離心式過濾器,美國密理博(Millipore)公司產(chǎn)品;高速組織研磨器,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;PCR儀,杭州柏恒科技有限公司產(chǎn)品;核酸電泳凝膠成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集 山東省平度市某養(yǎng)豬場仔豬發(fā)生不明原因腹瀉,剖檢其中1只患病仔豬,采集仔豬的肺臟、腎臟、肝臟、小腸、脾臟和淋巴結(jié),分別各取0.5 g上述樣本放置于1.5 mL離心管中,使用研磨器研磨,然后向每個試管中添加200 μL DPBS進行稀釋,并于-80 ℃保存。

1.3.2 樣本處理和核酸提取 將樣本研磨稀釋液反復(fù)凍融3次,于4 ℃、12 000 r/min離心3 min,取上清。將所有樣本的上清液混合在一起以形成樣本池。使用0.45 μm過濾器過濾上清混合液,并使用離心式過濾器濃縮。使用微球菌核酸酶在37 ℃下消化經(jīng)濃縮的樣本混合液2 h(樣本∶酶∶Buffer=100∶1∶10)。消化結(jié)束時,加入濃度為500 mmol/L、pH為8的EGTA(樣本體積的0.045倍)以滅活微球菌核酸酶,使用病毒核酸提取試劑盒分別提取DNA和RNA,送至上海探普生物科技有限公司進行測序。

1.3.3 病毒宏基因組測序 使用Illumina測序技術(shù)對1.3.2中提取的樣本核酸進行測序,并構(gòu)建Illumina PE文庫。利用BBmap軟件去除核糖體RNA(Ribosomal RNA,rRNA)、宿主和細菌序列,并利用Kraken2軟件進行病毒注釋,使用SPAdes 和SOAPdenovo軟件進行Denovo組裝,將從組裝中獲得的重疊簇與BLAST的Viral NT數(shù)據(jù)庫(V2.10.0+)進行比較,確定進化上親緣關(guān)系最密切的候選參考序列,確定匹配序列所屬的物種,并將符合匹配標準的序列判斷為候選序列,選擇長度≥1 500 bp的片段重疊群(Contigs)進行深度統(tǒng)計。

1.3.4 病毒基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序得到的病毒序列提交到GenBank獲得登錄號,從GenBank數(shù)據(jù)庫下載21株P(guān)BoV參考毒株基因組序列(G1、G2和G3群各選幾株代表株),使用MegAlign軟件的Clustal W方法與參考毒株進行多序列比對分析。應(yīng)用MEGA 11軟件,選擇鄰接法(Neighbor-joining,NJ),Bootstrap值設(shè)為1 000個重復(fù),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.5 病毒基因組序列分析 使用MegAlign軟件的Clustal W方法,將獲得的病毒基因組序列與參考毒株序列進行同源性分析。氨基酸比對結(jié)果用BioEdit 7.0軟件呈現(xiàn)。

1.3.6 樣本中PBoV的PCR檢測 PBoV PCR檢測引物序列參照參考文獻[15],引物序列為PBoV-F:GGTGATCCTGTCAATAAAG(VP1基因核苷酸第82～100位),PBoV-R:TGCAAAGAGTCGATAAAGT(VP1基因核苷酸第194～212位),預(yù)期擴增片段大小為131 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL):PremixTaq12.5 μL,DNA模板3 μL,上、下游引物各0.5 μL(50 μmol/L),去離子水8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,62 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共進行35個循環(huán);最后再72 ℃延伸2 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)3.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 病毒宏基因組測序 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制結(jié)果良好。RNA樣本病毒種水平注釋結(jié)果顯示,只有A型流感病毒(H1N1和H3N2),讀數(shù)(Reads counts)共682次,讀數(shù)比為6.8%,共得到35條重疊群序列,長度為136 ～1 777 bp,未發(fā)現(xiàn)其他豬病相關(guān)RNA病毒。DNA樣本測序數(shù)據(jù)去除rRNA、宿主和細菌序列等污染數(shù)據(jù)后,讀數(shù)共827 395次,讀數(shù)比為4.9%。病毒注釋后,在科水平上,讀取次數(shù)最多的是細小病毒科(Parvoviridae)(圖1A),為2 443次,讀數(shù)比為59.3%;在種水平上,讀取次數(shù)最

圖1 DNA樣本的病毒注釋

多的是PBoV(圖1B),為1 056次,讀數(shù)比為34.5%;其他豬病相關(guān)病毒包括豬巨細胞病毒(Porcine cytomegalovirus)、豬乳腺腺病毒(Porcine mastadenovirus)和豬細環(huán)病毒(Porcine torque teno virus,TTV),讀數(shù)比均<1.0%,拼接比對得到的重疊群序列長度均短于280 bp,所以不予進一步分析。因為PBoV讀數(shù)比最高,是優(yōu)勢病毒,又是豬腹瀉相關(guān)病原,故后續(xù)重點分析PBoV。

2.2 病毒基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 通過測序獲得1段PBoV的基因序列,將其命名為PBoV-SDPD-2022,全長為3 801 bp,包括完整的NS1、NP1基因和不完整的VP1、VP2基因(VP1基因N端968 bp序列,47%覆蓋率;VP2基因N端560 bp序列,34%覆蓋率),序列提交至GenBank,獲得登錄號為OQ860988。通過序列比對,與PBoV-SDPD-2022同源性最高的毒株是PBoV3_VIRES_HuB01_C1(MK378121.1),同源性為97.4%。從GenBank中下載了21株參考毒株的基因序列,與PBoV-SDPD-2022進行比對,分別基于全基因組、NS1基因和VP1基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2),PBoV毒株主要分為3個分支,即PBoV的3個群,PBoV-SDPD-2022與PBoV3_VIRES_HuB01_C1處于同一分支,屬于PBoV G3群。

圖2 PBoV-SDPD-2022與PBoV參考毒株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 病毒基因組序列分析

2.3.1 同源性分析 將毒株P(guān)BoV-SDPD-2022的NS1、VP1和NP1蛋白的編碼基因核苷酸和氨基酸序列分別與21株參考毒株進行比對,同源性分析結(jié)果見表1。針對NS1蛋白,PBoV-SDPD-2022與G1群參考毒株核苷酸序列同源性為49.6%～51.3%,氨基酸序列同源性為40.6%～41.4%;與G2群參考毒株核苷酸序列同源性為52.9%～54.3%,氨基酸序列同源性為38.5%～39.0%;與G3群參考毒株核苷酸序列同源性為79.2%～97.2%,氨基酸序列同源性為79.4%～95.3%。針對VP1蛋白,PBoV-SDPD-2022與G1群參考毒株核苷酸序列同源性為47.9%～51.1%,氨基酸序列同源性為34.8%～39.7%;與G2群參考毒株核苷酸序列同源性為54.9%～55.1%,氨基酸序列同源性為47.0%～47.6%;與G3群參考毒株核苷酸序列同源性為83.4%～97.9%,氨基酸序列同源性為85.0%～98.8%。針對NP1蛋白,PBoV-SDPD-2022與G1群參考毒株核苷酸序列同源性為35.2%～43.6%,氨基酸序列同源性為26.9%～27.4%;與G2群參考毒株核苷酸序列同源性為45.0%～46.4%,氨基酸序列同源性為33.8%～34.2%;與G3群參考毒株核苷酸序列同源性為79.1%～98.5%,氨基酸序列同源性為72.6%～97.4%。結(jié)果表明,PBoV-SDPD-2022與G3群參考毒株同源性較高,且在G3群毒株中,NP1蛋白同源性比NS1和VP1蛋白低。

表1 PBoV-SDPD-2022與參考毒株的同源性分析

2.3.2 NS1蛋白氨基酸序列分析 與G3群參考毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NS1蛋白沒有氨基酸插入現(xiàn)象,但在第654位點處有1個氨基酸的缺失(圖3)。

圖3 PBoV-SDPD-2022與G3群PBoV參考毒株NS1蛋白的氨基酸分析

2.3.3 VP1蛋白氨基酸序列分析 YXGXF基序在PBoV G2和G3群毒株(包括PBoV-SDPD-2022)中均為YLGPF(VPl aa 18～22)(圖4A)。HDXXY基序在PBoV G2和G3群其他毒株均為HDQAY,但在PBoV-SDPD-2022中變?yōu)镠DLAY(VP1 aa 41～45)(圖4A)。與G3群其他毒株相比,PBoV-SDPD-2022和PBoV3_VIRES_HuB01_C1的VP1蛋白在第151和152位點處有2個氨基酸(151G、152P)的插入(圖4B)。

圖4 PBoV-SDPD-2022與PBoV參考毒株VP1蛋白的氨基酸分析

2.3.4 NP1蛋白氨基酸序列分析 與G3群其他毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NP1蛋白在第15、16、35、36、212位點處發(fā)生氨基酸的缺失,在第95位點處有1個氨基酸(P)的插入(圖5)。

圖5 PBoV-SDPD-2022與G3群PBoV參考毒株NP1蛋白的氨基酸分析

2.4 樣本中PBoV的PCR檢測 通過PCR擴增得到大小為131 bp的單一條帶(圖6),與預(yù)期片段大小相符。

圖6 樣本中PBoV的PCR檢測

3 討論

PBoV自2009年發(fā)現(xiàn)以來,已在我國多次發(fā)生疫情,并且在健康豬和腹瀉豬體內(nèi)均可檢測到PBoV,說明PBoV在我國豬群中的感染已經(jīng)較為廣泛。許雅茹等[16]調(diào)查了我國豬群中PBoV的流行情況,對我國部分地區(qū)89份腹瀉病豬糞便樣本進行PCR檢測,結(jié)果顯示,PBoV陽性率為47.19%,其中上海和江西的樣品陽性率最高,山東的樣品陽性率最低,并且鑒定的5株P(guān)BoV均屬于PBoV 3型。另有許多研究在腹瀉樣本中檢測到PBoV[17-18],說明PBoV與豬腹瀉具有一定的相關(guān)性。Aryal等[19]針對PBoV的致病機理進行了研究,用無細菌和其他病毒的PBoV陽性腸內(nèi)容物飼喂缺初乳仔豬,接種PBoV的仔豬出現(xiàn)腹瀉,接種后18 h即可在直腸拭子中檢測到病毒,并且小腸出現(xiàn)肉眼和顯微鏡下可觀察到的病變,通過常規(guī)PCR檢測到了小腸中的病毒,證實了PBoV具有致病性,并將其定性為缺乏初乳的新生仔豬腹瀉的病原體。近年來有研究表明,我國PBoV 3、4和5型(G3群)的感染力要強于PBoV 1和2型[20]。本試驗從腹瀉仔豬體內(nèi)檢測到了PBoV,經(jīng)分析屬于PBoV G3群,在一定程度上也支持了以上觀點。

對于PBoV的分型依據(jù),目前較為混亂,缺乏公認且權(quán)威的分型方法,國際病毒分類委員會曾依據(jù)NS1蛋白氨基酸同源性大于95%為一個基因型的標準將PBoV分為PBoV 1～5型共5個基因型,后又將該分型標準調(diào)整為NS1蛋白氨基酸同源性大于85%為1個基因型[10]。隨著更多新毒株的發(fā)現(xiàn),這一分型方法已經(jīng)難以區(qū)分PBoV。根據(jù)VP1基因?qū)BoV分為G1、G2和G3 共3個基因群[21],可將所有的毒株劃分在內(nèi),且同群內(nèi)毒株基因序列同源性較高,應(yīng)用較為廣泛。余蕊等[22]提到常用的PBoV分型方法有2種:依據(jù)病毒NS1和VP1蛋白的編碼基因序列進行基因型劃分。因此,本試驗基于全基因組、NS1和VP1基因分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結(jié)果顯示,3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹基本一致,PBoV G2群與G3群處于同一大分支,處于G3群的PBoV-SDPD-2022與G2群的同源性也相比于G1群高,猜測G2群與G3群可能由共同祖先重組進化而來。Lau等[23]研究發(fā)現(xiàn),PBoV 4型可能存在重組事件,表明同一宿主內(nèi)的不同毒株可能由重組產(chǎn)生。Zhou等[24]在PBoV G3群的NS1區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個天然重組斷點。但在本試驗中,PBoV-SDPD-2022并未檢測到重組事件。Leisi等[25]研究發(fā)現(xiàn),VP1u的N端區(qū)域負責病毒的內(nèi)化,并且VP1u的二聚體化可導(dǎo)致細胞結(jié)合和內(nèi)化大大增強。本試驗分析了PBoV VP1u的PLA2基序YXGXF和HDXXY,這2個序列的變化不僅影響病毒DNA復(fù)制,還與PBoV的致病性有關(guān)[12]。與PBoV G2和G3群毒株相比,PBoV G1群毒株缺少這2個基序,這可能表明PBoV G1群病毒不能激活PLA2。

本試驗通過病毒宏基因組學(xué)的方法對未知原因的仔豬腹瀉病例進行了病毒檢測,旨在了解腹瀉病例中存在哪些豬源病毒,檢測可能的未知致病病原。雖然之前的報道表明,PBoV常與PEDV、CSFV、PRRSV和PCV2混合感染[4-5],但在本病例中并未檢測到上述病原,主要檢測到了PBoV,雖然也檢測到A型流感病毒(H1N1和H3N2)、豬巨細胞病毒、豬乳腺腺病毒和豬細環(huán)病毒,但病毒豐度很低,因此,PBoV可能為引起該養(yǎng)豬場仔豬腹瀉的主要病原。通過對病毒進行遺傳進化分析,以及結(jié)合相關(guān)報道,目前PBoV G3群在我國流行最為廣泛,但檢測到的完整基因序列較少,未來應(yīng)加強PBoV全基因組測序和流行病學(xué)調(diào)查。