崔夢(mèng)宇 , 蘇 思 , 邢麗麗 , 木 蘭 , 高瑞娟 , 郭棋棋 , 任 洪 , 祁冬冬 , 于晶峰

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100 ; 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100 ;3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090 ; 4. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100 ;5. 呼倫貝爾市第三人民醫(yī)院精神疾病基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)室 , 內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 022150)

蜱是一種吸血寄生蟲,可以傳播原生動(dòng)物、立克次體、螺旋體和病毒等,被認(rèn)為是僅次于蚊子的疾病傳播媒介。蜱可以寄生在家畜、野生動(dòng)物和人類等脊椎動(dòng)物身上[1-2],大多數(shù)蜱在飽血后脫離宿主,落到地面,受精的雌蜱脫離宿主后,在棲息地產(chǎn)卵繁殖[3]。蜱的一生中大部分時(shí)間脫離宿主,因此植被中有大量游離蜱存在。蜱分布廣泛但不均勻,以樹林、灌木叢和草地居多,放牧區(qū)域更是蜱類疾病的多發(fā)地帶[4]。因此,開展對(duì)寄生蜱和游離蜱的調(diào)查,對(duì)蜱傳疾病的預(yù)警和控制具有十分重要的意義。

內(nèi)蒙古自治區(qū)位于我國(guó)北部邊疆,東西狹長(zhǎng),占地面積118.3萬平方公里,是我國(guó)第三大省區(qū)。毗鄰我國(guó)多個(gè)省份,并與蒙古國(guó)和俄羅斯接壤。內(nèi)蒙古自治區(qū)生態(tài)環(huán)境差異較大,從極端的干旱區(qū)跨越到溫帶濕潤(rùn)區(qū),生態(tài)系統(tǒng)包括森林生態(tài)系統(tǒng)、草地生態(tài)系統(tǒng)、荒漠生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)等[5],但總體來說,內(nèi)蒙古自治區(qū)屬高原草原型氣候,擁有我國(guó)豐富的草原牧區(qū)和重要的森林基地,得天獨(dú)厚的地理生態(tài)環(huán)境不僅為蜱的生長(zhǎng)和繁殖提供了條件,也使得該地區(qū)成為我國(guó)蜱傳疾病的重要疫區(qū)之一[6-8]。由于蜱傳疾病具有自然疫源性,蜱標(biāo)本的采集多在人跡罕至的森林和牧場(chǎng),加上蜱的生活史特點(diǎn),研究者們受采樣時(shí)間和地理位置所限,只能對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)的部分地區(qū)和部分蜱種分布進(jìn)行研究,整體全局分布還不清楚。本試驗(yàn)為了解內(nèi)蒙古自治區(qū)蜱種類的分布情況,于2021—2023年首次在內(nèi)蒙古自治區(qū)全境東部和西部選擇森林、草地、荒漠和農(nóng)田等不同的生態(tài)環(huán)境開展蜱的調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2×TaqPCR Mix預(yù)混液,購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL5 000 DNA Marker,購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;CelRed核酸染料,購(gòu)自蘭博利德生物技術(shù)有限公司(北京);Invitrogen瓊脂糖,購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó));血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、PGM-T Vector產(chǎn)物克隆試劑盒和TOP 10感受態(tài)細(xì)胞,均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)ChampGel 5 000,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品;NANODROP2000c,基因科技(上海)股份有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖水平電泳槽,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;SZ 680連續(xù)變倍體視顯微鏡,重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 調(diào)查地點(diǎn)和時(shí)間 2021年4月—2023年7月對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)全境以分層隨機(jī)方式,對(duì)呼倫貝爾市新巴爾虎右旗、阿龍山鎮(zhèn)、牙克石市和大楊樹鎮(zhèn),興安盟阿爾山市,赤峰市天山鎮(zhèn),錫林郭勒盟蘇尼特右旗,鄂爾多斯市成川鎮(zhèn),巴彥淖爾市烏拉特前旗、烏拉特中旗、烏拉特后旗和磴口縣共12個(gè)地區(qū)進(jìn)行采樣。因巴彥淖爾市磴口縣緊靠阿拉善右旗,阿拉善盟為典型的荒漠區(qū),已在巴彥淖爾市的荒漠生態(tài)系統(tǒng)采樣,故而并未在阿拉善盟采樣。具體采樣地點(diǎn)見圖1。

圖1 蜱樣本采樣地圖

1.3.2 調(diào)查方法 于2021—2023年蜱活躍期結(jié)合牧民參與調(diào)查的意愿,采用拖旗法和人工采集法

(使用鑷子輕輕將宿主體表寄生的蜱夾取并放入收集管中)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)中12個(gè)調(diào)查地點(diǎn)進(jìn)行采樣。

1.3.3 蜱形態(tài)學(xué)鑒定 在體視顯微鏡下觀察蜱的假頭、氣門板、生殖孔、盾板、須肢有無背刺或腹刺、哈式器、有無幾丁質(zhì)增厚部等形態(tài)學(xué)特點(diǎn),根據(jù)《蜱類學(xué)》[9]和《常見病媒生物分類鑒定手冊(cè)》[10]進(jìn)行蜱形態(tài)學(xué)屬、種鑒定。

1.3.4 蜱DNA提取 將經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的蜱用75%酒精浸泡1 min消毒體表,用PBS清洗3遍,置于濾紙上將水分充分吸干。研缽、研磨杵和鑷子等提前高溫滅菌,使用前用液氮預(yù)冷,對(duì)調(diào)查地點(diǎn)的每個(gè)蜱種取1～2只蜱,單只一組充分研磨3遍。將研磨的蜱組織按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.5 引物合成 參考GenBank中軟蜱和硬蜱的18S rRNA、16S rRNA和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COI)基因的序列,應(yīng)用Oligo 7.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1),引物序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物信息

1.3.6 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 應(yīng)用18S rRNA、16S rRNA和COI基因引物,以提取的DNA為模板,進(jìn)行聚合

酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL:DNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,2×TaqMaster Mix 11 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物加入到1.5%瓊脂糖凝膠中,110 V、30 min條件下電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中將目的片段的特異性條帶切下,用通用型DNA純化回收試劑盒回收目的片段。膠回收產(chǎn)物在16 ℃條件下與PGM-T Vector過夜連接,轉(zhuǎn)化至TOP 10感受態(tài)細(xì)胞中,并在含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性克隆篩選。挑取可疑菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng),將陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將成功測(cè)序的18S rRNA、16S rRNA和COI基因序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析。使用MEGA 7軟件,采用最大似然(Maximum likelihood,ML)法[11],以微小扇頭蜱作為外群,經(jīng)過1 000次的Bootstrap計(jì)算,分別構(gòu)建3個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)得到的計(jì)數(shù)資料應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行差異性顯著檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著。統(tǒng)計(jì)在不同宿主中采集的蜱種。按照公式(1)計(jì)算Jaccard相似性系數(shù)[12],分析不同生態(tài)環(huán)境中蜱群落相似性。

q=c/(a+b-c)

(1)

式中:a和b分別為2個(gè)群落各自所擁有的物種數(shù)目,c為2個(gè)群落共有的物種數(shù)目。當(dāng)0≤q<0.25,2個(gè)群落間極不相似;當(dāng)0.25≤q<0.50,2個(gè)群落間中等不相似;當(dāng)0.50≤q<0.75,2個(gè)群落間中等相似;當(dāng)0.75≤q≤1.00,2個(gè)群落間極相似。

2 結(jié)果

2.1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定 共采集5 029只皆處于成蟲階段的蜱(表2),其中包括1 719只游離蜱和3 310只寄生蜱,于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,結(jié)果顯示,所采集的蜱隸屬于2科5屬5種,分別為硬蜱科的草原革蜱(Dermacentornuttalli)、全溝硬蜱(Ixodespersulcatus)、邊緣璃眼蜱(Hyalommamarginatum)和嗜群血蜱(Haemaphysalisconcinna)以及軟蜱科的波斯銳緣蜱(Argaspersicus)。因未采集到雄性波斯銳緣蜱,故本試驗(yàn)無法提供其參考照片。以上5種蜱的假頭基形狀、盾板、生殖孔和氣門板等有一定的區(qū)別(表3和圖2)。

表3 顯微鏡觀察不同品種蜱的主要鑒定特征

圖2 蜱的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2 PCR擴(kuò)增 草原革蜱、全溝硬蜱、邊緣璃眼蜱、嗜群血蜱和波斯銳緣蜱的18S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為756 bp,16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為420 bp,COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為557 bp(圖3),與預(yù)期大小相符。

圖3 蜱的18S rRNA(A)、16S rRNA(B)和COI(C)基因的PCR擴(kuò)增

2.3 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 將成功測(cè)序的18S rRNA(GenBank序列號(hào):OR 039313～OR 039324、OR 936234)、16S rRNA(GenBank序列號(hào):OR 039050～OR 039061、OR 936207)和COI(GenBank序列號(hào):OR 039519～OR 039530、OR 936649)基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析,結(jié)果如圖4所示,本調(diào)查的草原革蜱、全溝硬蜱、邊緣璃眼蜱、嗜群血蜱和波斯銳緣蜱基因序列分別與GenBank中同種類蜱的基因序列同源性達(dá)96.0%以上,與同屬蜱種的基因序列在同一大支上,不同屬蜱種的基因序列在不同分支上;6個(gè)地理種群的草原革蜱混合分布,不存在地理隔離。18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,同種類蜱的基因序列與GenBank中同屬種的參考基因序列自展值僅大于76.0%,無法鑒定到種水平;16S rRNA和COI基因序列與GenBank中同種類的參考基因序列比對(duì),自展值均大于96.0%。

圖4 不同蜱種18S rRNA(A)、16S rRNA(B)和COI(C)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 不同生態(tài)壞境中蜱的構(gòu)成 由表4可知,草原革蜱存在于除森林生態(tài)系統(tǒng)外的3種生態(tài)環(huán)境中,全溝硬蜱存在于森林生態(tài)系統(tǒng)和草地生態(tài)系統(tǒng)2種生態(tài)環(huán)境中,邊緣璃眼蜱和波斯銳緣蜱均只存在于荒漠生態(tài)系統(tǒng),嗜群血蜱只存在于森林生態(tài)系統(tǒng)。不同的生態(tài)環(huán)境中分布的蜱種存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6 734.068,P<0.001)。在草地生態(tài)系統(tǒng)中存在的蜱較多(2 963只),占蜱總數(shù)的58.92%;其次是森林生態(tài)系統(tǒng)(1 721只),占蜱總數(shù)的34.22%。

表4 內(nèi)蒙古自治區(qū)不同生態(tài)環(huán)境中采獲蜱的數(shù)量

2.5 不同生態(tài)環(huán)境中蜱群落相似性 由表5可知,森林生態(tài)系統(tǒng)與荒漠生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)均沒有相似性,相似性系數(shù)為0;草地生態(tài)系統(tǒng)與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中等相似,相似性系數(shù)為0.50;草地生態(tài)系統(tǒng)與森林生態(tài)系統(tǒng)中等不相似,相似性系數(shù)為0.33;荒漠生態(tài)系統(tǒng)與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和草地生態(tài)系統(tǒng)中等不相似,相似性系數(shù)分別為0.33和0.25。

表5 內(nèi)蒙古自治區(qū)不同生態(tài)環(huán)境蜱群落Jaccard相似性系數(shù)

2.6 不同宿主采集的蜱種 由表6可知,山羊宿主所攜帶的蜱數(shù)量(2 202只,43.79%)最多,種類最豐富。采集的全溝硬蜱均為野外游離蜱,故未在表中呈現(xiàn)該蜱種的宿主情況。

表6 不同宿主采獲蜱情況

3 討論

本調(diào)查發(fā)現(xiàn),草原革蜱是內(nèi)蒙古自治區(qū)地區(qū)優(yōu)勢(shì)蜱種,占此次采獲蜱總數(shù)的58.32%,這與黃天鵬[13]的研究結(jié)果一致。全溝硬蜱和嗜群血蜱主要分布在東北的黑龍江省和遼寧省,孳生地的溫度變化大是蜱種分布的主要影響因素,針闊混交林的覆蓋率越大越適合這2種蜱的生存。這2種成蜱的活動(dòng)期均在4～8月,高峰在5月至6月初;其可以攜帶立克次體、森林腦炎病毒和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒等[14-16]。草原革蜱主要分布在北方,包括內(nèi)蒙古自治區(qū)等省份,該蜱一般在3月底至6月中旬積極活動(dòng),成蜱高峰為4月和5月,灌叢草地的覆蓋率越高越適合草原革蜱的生存;其可以攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體、無形體、布魯氏菌和巴貝西蟲等蜱傳病原體[17]。璃眼蜱主要分布在新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)和遼寧省等地區(qū),荒漠草地的覆蓋率越高越適合該蜱的生存[18]。內(nèi)蒙古自治區(qū)全區(qū)狹長(zhǎng),蜱種豐富,因地形各異可以形成各種獨(dú)特的小氣候,為不同蜱的生存提供了條件。因此,開展蜱媒的監(jiān)測(cè)對(duì)蜱傳疾病的預(yù)防和控制具有重要意義。

本調(diào)查采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合的方法對(duì)采集到的硬蜱和軟蜱進(jìn)行蜱種鑒定,并總結(jié)了在國(guó)內(nèi)分布較廣泛的硬蜱和軟蜱的形態(tài)學(xué)特征,可為后續(xù)研究提供參考。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,本調(diào)查的蜱種與GenBank中同屬蜱種的基因序列在同一大支上,不同屬蜱種的基因序列在不同分支上,表明分子生物學(xué)鑒定較為可靠,且可避免因幼蜱、樣本殘缺等無法進(jìn)行蜱種鑒定的問題?；?6S rRNA和COI基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示,草原革蜱與森林革蜱親緣關(guān)系較近,且在內(nèi)蒙古自治區(qū)不同地區(qū)采集的草原革蜱在系統(tǒng)發(fā)育樹中混雜分布,并未出現(xiàn)地理隔離;但18S rRNA基因無法鑒定到物種水平,這與此前報(bào)道結(jié)果一致[11]。本調(diào)查尚有一定的不足:首先,此次采集樣本中未采獲雄性波斯銳緣蜱;其次,調(diào)查的宿主除牧區(qū)山羊和綿羊外,野生動(dòng)物尚未涉及。后續(xù)可以擴(kuò)大樣本的種類和來源,進(jìn)一步開展蜱類空間分布特征等調(diào)查。

本調(diào)查對(duì)不同的生態(tài)環(huán)境中分布的蜱種差異進(jìn)行卡方分析,以及對(duì)不同生態(tài)環(huán)境蜱群落進(jìn)行相似性分析,均發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)的森林、草地、農(nóng)田和荒漠不同生態(tài)環(huán)境中蜱種分布有所差異,可能與蜱的分布受到空氣中濕度、溫度、植被類型和年度溫差變化等的影響有關(guān),本調(diào)查在不同的生態(tài)系統(tǒng)中采集的蜱類與趙國(guó)平[19]的蜱類區(qū)系分布特點(diǎn)一致。同時(shí),本調(diào)查對(duì)蜱蟲侵染的宿主進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同宿主中山羊感染的蜱蟲數(shù)量較多,以草原革蜱為主,可能與草原革蜱在內(nèi)蒙古自治區(qū)分布廣泛有關(guān),在本次采樣中也證實(shí)草原革蜱除大量存在于草原外,也存在于荒漠。全溝硬蜱僅在蒙東地區(qū)的森林生態(tài)環(huán)境中采集到游離蜱,未采集到寄生蜱,可能與蒙東地區(qū)溫差變化較大和植被類型豐富等因素有關(guān)。在對(duì)蜱蟲預(yù)防和控制過程中可針對(duì)不同生態(tài)環(huán)境、不同宿主采取更加有針對(duì)性的措施。

本調(diào)查于2021—2023年首次對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)全境不同生態(tài)環(huán)境中采集的蜱類進(jìn)行生態(tài)環(huán)境差異分析和蜱種鑒定。內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)發(fā)達(dá)且擁有眾多林區(qū)和牧場(chǎng),農(nóng)牧民與蜱接觸較為密切,對(duì)該地區(qū)進(jìn)行蜱的空間分布調(diào)查具有重要的醫(yī)學(xué)意義,本調(diào)查結(jié)果為內(nèi)蒙古自治區(qū)蜱的防治工作提供了科學(xué)參考依據(jù)。