李艷紅 , 白和平 , 信玉春 , 郭柯宇 , 王金鋒 , 夏力亮 , 吳同壘 , 史秋梅

(1.樂亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 , 河北 唐山 063699 ; 2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室 , 河北 秦皇島 066604 ; 3.河北省廊坊市永清縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 , 河北 廊坊 065600 ;4.河北碩博畜牧服務(wù)有限公司 , 河北 唐山 063500)

豚鼠(Guinea pig)屬嚙齒目、豚鼠科、豚鼠屬,又名荷蘭鼠、荷蘭豬等,是一種集皮毛、觀賞和滋補等多種用途于一身的食草動物,其肉質(zhì)鮮美、口感豐富、蛋白含量高、脂肪和膽固醇含量低[1],在厄瓜多爾、哥倫比亞和秘魯?shù)葒冶灰暈橹匾牡鞍踪|(zhì)來源。豚鼠體型緊湊、外形呆萌可愛,英國等歐洲國家視豚鼠為主要的伴侶動物,加上其生長快、成本低、產(chǎn)仔多、對外界抵抗力強、成活率高和適應(yīng)性強等特點,已成為重要的特種經(jīng)濟動物。

馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)屬乳桿菌目、乳桿菌科、鏈球菌屬,為蘭氏分菌的C 群 β 溶血鏈球菌,為革蘭陽性球菌,是鏈球菌病的主要病原體之一[2-4],可感染多種宿主,如豬、馬、牛、驢、羊、雞、犬、獼猴和豚鼠等,一般通過食物污染或與感染動物接觸感染人。馬鏈球菌獸疫亞種在我國主要感染豬,臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、敗血癥、肺炎和腦膜炎;感染馬、牛、驢、羊的臨床癥狀主要為發(fā)熱、上呼吸道黏膜發(fā)炎、頜下淋巴結(jié)腫脹、化膿和子宮炎等[5-6];感染家禽主要表現(xiàn)為氣囊炎和支氣管栓塞[7];感染犬呈嚴(yán)重的纖維性滲出和出血性肺炎[8];獼猴感染后表現(xiàn)為出血性敗血病變[9]。2021年10月,河北省唐山市某豚鼠養(yǎng)殖場45日齡豚鼠出現(xiàn)精神沉郁、食量下降、眼角有膿性分泌物、消瘦和頭部腫大等臨床癥狀,經(jīng)獸醫(yī)師診斷為繼發(fā)性腦膜炎。經(jīng)一系列檢測判定為細菌感染致豚鼠發(fā)病,通過細菌的分離培養(yǎng),得到1株馬鏈球菌獸疫亞種優(yōu)勢菌,對分離菌株進行中藥和西藥敏感性試驗及致病性試驗,以期為臨床馬鏈球菌獸疫亞種的防治和新型獸藥的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和實驗動物 河北省唐山市某豚鼠養(yǎng)殖場發(fā)病豚鼠,無菌棉拭子蘸取其眼角膿性分泌物,4 ℃送至河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室;4～6周齡健康SPF級BALB/c小鼠,體重25 g,購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016—0002。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂,購自北京奧博星生物科技有限公司;胎牛血清,購自浙江天杭生物科技有限公司;血瓊脂培養(yǎng)基,購自鄭州安圖生物科技有限公司;細菌微量生化鑒定管,購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司;0.4%氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液和抗菌藥藥敏紙片,均購自北京索萊寶科技有限公司;中藥(竹葉紫胡、苦地丁、使君子、蒲公英、苦參、薄荷、金銀花、黃芩、路邊青、大青葉、干姜、紫花地丁、丁香葉、千里光、連翹、甘草、穿心蓮、黃柏和馬鞭草),均購自秦皇島民樂藥店。

1.3 主要儀器 PCR擴增儀,購自杭州朗科學(xué)儀器公司;電子多功能煲,購自潮州中雄家用電器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌的分離純化和形態(tài)學(xué)觀察 在超凈臺中取出棉拭子在血瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,挑取優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)至形態(tài)單一。取純化后的細菌培養(yǎng)物進行革蘭染色,油鏡下觀察分離菌株的染色特性和菌體形態(tài)。

1.4.2 分離菌株的生化鑒定 將分離菌株的純化培養(yǎng)物接種于細菌微量生化鑒定管中,37 ℃培養(yǎng) 24 h,記錄分離菌株對七葉苷、菊糖和山梨醇等10項生化反應(yīng)的結(jié)果,并與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》(第8版)的生化結(jié)果進行比較。

1.4.3 分離菌株16S rRNA基因鑒定 采用熱裂解法提取分離菌株的DNA,將其作為PCR模板,利用16S rRNA通用引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增分離菌株的16S rRNA基因,PCR擴增體系和擴增程序參照參考文獻[10]進行,PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司純化并測序,測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4.4 藥敏試驗 采用K-B試紙法檢測分離菌株對24種臨床常用抗菌藥的敏感性,用滅菌棉簽蘸取適量菌液,均勻涂布于含5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上,將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑,依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)抑菌圈直徑大小判定結(jié)果,試驗重復(fù)3次取平均值。

1.4.5 中藥提取液的制備 將19種中藥粉碎,分別精確稱取10 g加入250 mL燒杯中,加入200 mL超純水浸泡4 h,使用電子多功能煲煮至沸騰,70 ℃煎1 h,用400目濾網(wǎng)過濾,藥渣中再添加200 mL超純水繼續(xù)煎熬、過濾,操作步驟同上,將2次所得藥液合并后70 ℃濃縮至10 mL,即藥液的終濃度為1 g/mL,將藥液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后4 ℃保存,備用。

1.4.6 中藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定 參照參考文獻[10]方法,用試管二倍稀釋法檢測19種中藥對分離菌株的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)值和最小殺菌濃度(Minimal bactericidal concentration,MBC)值,取12支試管,標(biāo)號為1～12,每支試管先添加2 mL 含5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基,再加入2 mL中藥提取液至1號試管,混勻后吸取2 mL液體加入2號試管,依次倍比稀釋至10號試管后棄2 mL液體;最后1～10號試管再加入20 μL分離菌菌液,11號試管加20 μL分離菌菌液作為陽性對照,12號試管加20 μL超純水作為陰性對照,所有試管均于37 ℃ 培養(yǎng)24 h,加入10 μL 0.4% TTC染色液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min,如有大量活菌存在,TTC染色液則被還原為紅色,以培養(yǎng)液顏色未變化的最小藥物濃度為該藥的MIC值。每支試管取50 μL培養(yǎng)物接種于血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,以無菌生長的最小藥物濃度為該藥的MBC值。每種中藥重復(fù)進行3次試驗,取平均值。

1.4.7 動物回歸試驗 將10只小鼠隨機分為對照組和感染組,感染組每只小鼠腹腔注射0.2 mL分離菌菌液,對照組注射等劑量的滅菌PBS,每天觀察小鼠狀況,及時剖檢死亡小鼠,觀察小鼠臟器變化,同時取病變臟器涂抹血瓊脂培養(yǎng)基,進行細菌純化鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)特征和生化鑒定 分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上呈透明、凸起狀小菌落,呈現(xiàn)明顯的β溶血現(xiàn)象;革蘭染色呈陽性、圓球菌,少數(shù)為單個或成對存在,多為3～5個連接、呈短鏈狀,與鏈球菌的生長特性和形態(tài)特征相似。生化鑒定結(jié)果顯示,該分離菌株不能發(fā)酵菊糖和阿拉伯醇,能發(fā)酵山梨醇、海藻糖、乳糖、甘露醇和棉籽糖,能水解水楊苷,不能水解七葉苷,馬尿酸鈉試驗為陰性,與馬鏈球菌獸疫亞種的生化特性相符,初步鑒定該分離菌株為馬鏈球菌獸疫亞種,并將其命名為MLQJ-1。

2.2 分離菌株的16S rRNA基因鑒定 經(jīng)PCR擴增MLQJ-1的16S rRNA基因,得到1 500 bp左右的預(yù)期條帶(圖1);MLQJ-1 16S rRNA基因測序結(jié)果拼接后,經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對,MLQJ-1 16S rRNA測序結(jié)果與馬鏈球菌獸疫亞種的16S rRNA序列同源性達99.72%;MLQJ-1 16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹如圖2所示,MLQJ-1與馬鏈球菌獸疫亞種Bd 19/03株自然聚為一支,與1株馬鏈球菌和7株馬鏈球菌獸疫亞種處于同一小分支,與葡萄球菌處于不同分支,與沙門菌和大腸桿菌相距較遠。結(jié)合形態(tài)特征、生化鑒定和16S rRNA序列分析結(jié)果,判定MLQJ-1為馬鏈球獸疫亞種。

圖1 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增

圖2 基于分離菌株16S rRNA基因所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 藥敏試驗 測量各種抗菌藥的抑菌圈直徑,判斷MLQJ-1對24種抗菌藥的敏感性,結(jié)果如表2所示,分離菌株對氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、土霉素、頭孢噻呋、恩諾沙星和青霉素敏感,對環(huán)丙沙星、替米考星、磺胺間甲氧、黏桿菌素、林可霉素和大觀霉素中介,對阿米卡星、新霉素、卡那霉素、多西環(huán)素、乙酰甲喹、磺胺二甲氧、復(fù)方新諾明、慶大霉素、馬波沙星和氧氟沙星耐藥。

表1 抗菌藥藥敏試驗結(jié)果

表2 中藥藥敏試驗結(jié)果

2.4 中藥MIC值和MBC值測定 經(jīng)試管二倍稀釋法測定19種中藥對MLJQ-1的MIC值和MBC值,結(jié)果如表2所示,苦地丁、苦參、黃芩和千里光的MIC值介于1.9～15.6 mg/mL,竹葉紫胡、使君子、蒲公英和薄荷等15種中藥的MIC值介于62.5～125 mg/mL;苦地丁、苦參、黃芩和千里光的MBC值介于1.9～31.2 mg/mL,竹葉紫胡、使君子、蒲公英和薄荷等15種中藥的MBC值介于62.5～250 mg/mL。

2.5 動物回歸試驗 感染8 h后,感染組小鼠行動遲緩、雙目緊閉、精神沉郁、震顫、被毛逆立、四肢抽搐,與豚鼠發(fā)病癥狀相似;24 h內(nèi)感染組小鼠全部死亡,剖檢可見小鼠心臟、肝臟和脾臟出血,從死亡小鼠脾臟可分離出與馬鏈球菌獸疫亞種形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長特性和生化鑒定結(jié)果一致的細菌;對照組小鼠無死亡,7 d 后全部處死進行檢測,并未檢測到馬鏈球菌獸疫亞種。結(jié)果表明,MLJQ-1具有較強毒力,可致小鼠死亡。

3 討論

本試驗對發(fā)病豚鼠眼角膿性分泌物病料進行檢測,分離到1株呈現(xiàn)明顯溶血的優(yōu)勢菌,通過形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和16S rRNA序列分析確定為馬獸疫鏈球菌亞種。從臨床癥狀來看,發(fā)病豚鼠精神不振、體溫升高、眼瞼有化膿性炎癥、眼結(jié)膜充血、頭部逐漸腫大,與余思義等[11]、張曉佩等[12]觀察到的馬鏈球菌獸疫亞種引起豚鼠眼部感染的臨床癥狀相似。

抗菌藥一直被視為治療鏈球菌的首選藥物,本試驗中抗菌藥藥敏試驗結(jié)果顯示,分離菌株對新霉素、卡那霉素、多西環(huán)素和復(fù)方新諾明等10種抗菌藥耐藥;蒲小峰等[13]研究發(fā)現(xiàn),驢源獸疫鏈球菌對青霉素和四環(huán)素耐藥;程龍飛等[9]研究發(fā)現(xiàn),新疆獼猴源馬鏈球菌對青霉素、新霉素和四環(huán)素等耐藥;苗立中等[14]研究發(fā)現(xiàn),巴拿馬香豬源馬鏈球菌獸疫亞種對青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明有明顯耐藥性。以上研究表明,不同地區(qū)、不同宿主馬鏈球菌獸疫亞種的耐藥性相似,青霉素、四環(huán)素、新霉素和復(fù)方新諾明等不宜繼續(xù)作為臨床常用藥用于治療馬鏈球菌獸疫亞種引起的感染,長期使用抗菌藥會增加耐藥性和獸藥殘留,甚至危害生態(tài)平衡。

本試驗結(jié)果顯示,分離菌株對氨芐西林、阿莫西林和青霉素等8種抗菌藥敏感;陳峰等[15]研究Hartley豚鼠源馬鏈球菌獸疫亞種發(fā)現(xiàn),分離菌株對青霉素、阿莫西林和氨芐西林敏感,與本試驗結(jié)果一致;唐海波等[16]分離的黑豚鼠源馬鏈球菌獸疫亞種同樣對氨芐西林敏感;鐘映梅等[17]的研究結(jié)果也與此一致,提示氨芐西林可以作為治療馬鏈球菌獸疫亞種感染的首選藥物。但該藥也易產(chǎn)生耐藥性,因此需加快研制低耐藥、高效、低毒、安全的藥物,用于馬鏈球菌獸疫亞種感染的防治。

值得注意的是,本試驗首次對分離菌株進行了中藥體外抑菌試驗,中藥MIC值和MBC值的測定結(jié)果顯示,苦地丁、苦參、黃芩和千里光對本試驗所分離馬鏈球菌獸疫亞種的MIC值介于1.9～15.6 mg/mL,MBC值介于1.9～31.2 mg/mL,竹葉紫胡、使君子、蒲公英、薄荷、金銀花和路邊青等15種中藥的MIC值介于62.5～125 mg/mL,MBC值介于62.5～250 mg/mL。結(jié)果表明,所選19種中藥水煎劑都具有較強的抑菌和殺菌作用,臨床應(yīng)用所選中藥進行治療也應(yīng)具有較好的療效。中藥不僅可以預(yù)防和治療病原菌引起的感染,還具有降低飼養(yǎng)成本、減少藥物殘留、建立特色養(yǎng)殖體系等潛在優(yōu)點。

馬鏈球菌獸疫亞種感染的臨床治療過程中,在選擇敏感藥物治療發(fā)病動物的同時,應(yīng)隔離患病動物,減少病原菌在種群之間傳播;加強飼養(yǎng)管理,保持飼養(yǎng)舍清潔衛(wèi)生、干燥通風(fēng),減少病原菌的孳生;糞尿、殘余飼料和患病死亡動物等及時進行無害化處理,防止其成為傳染源;避免直接或間接傳染給人類,對人類健康造成潛在威脅。