宮冉冉 , 胡 濤 , 田文駿 , 宋世豪 , 王曉佳,2

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 , 北京 海淀 100193 ; 2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點實驗室 , 北京 海淀 100193)

病毒的復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程都在宿主細胞中進行,其可利用細胞中的物質(zhì)和能量完成生命活動,并產(chǎn)生新一代病毒。病毒離開宿主不能自我復制,長期以來環(huán)境中的病毒并未引起科學界的廣泛關(guān)注,因此科研人員也沒有做好系統(tǒng)的知識積累和技術(shù)防控準備,導致面對復雜多變且快速傳播的新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)時,無法及時準確地提供建議、對策和措施。因此,各個領(lǐng)域的科研人員展開深刻思考,并圍繞環(huán)境中病毒生存和傳播等方向進行了跨學科交叉合作研究,本文對研究歷程和進展綜述如下。

1 病毒在環(huán)境中的狀態(tài)與致病性

1.1 病毒聚集 一直以來,病毒被認為是沒有自我意識的蛋白質(zhì)和核酸,其生命活動也被簡單定義為細胞內(nèi)無自主意識的復制和翻譯。只有很少一部分人關(guān)注病毒在環(huán)境中的狀態(tài)和行為,及其社會性。病毒在體外環(huán)境中可以相互識別,并通過表面糖蛋白結(jié)合在一起,形成一個具有感染力的組織團體,它們可以在對方的幫助下更好地入侵細胞,從而保存自己的遺傳物質(zhì),保障自身的繁衍生存[1]。

環(huán)境中病毒遇到體外消毒劑時,會自發(fā)聚集在一起,處于病毒團外層的病毒粒子會保護內(nèi)部的病毒粒子不被破壞。在腸道病毒感染者的糞便樣本中,80%的病毒聚集存在,甚至一些聚集體被包裹在細胞碎片中,從而可以在嚴苛的環(huán)境中存活[1]。在抗病毒反應強烈的細胞中,病毒聚集可導致多個病毒基因組共存于同一感染單元內(nèi),因此被感染的細胞能夠釋放更多的子代病毒體[2]。體內(nèi)病毒聚集受宿主生物特性的影響,例如,水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)在唾液中呈纖維蛋白原γ鏈劑量依賴性聚集,但不排除其他蛋白質(zhì)或細胞因子的參與[3]。體外環(huán)境中有許多物理或化學因素可誘導病毒聚集體的產(chǎn)生,例如,鼠肝炎病毒A59毒株對pH敏感性較強,當環(huán)境溫度穩(wěn)定在37 ℃時,該病毒在pH 6.0環(huán)境中穩(wěn)定存在,半衰期為24 h;但在pH 8.0環(huán)境中,病毒尖峰糖蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,病毒迅速且不可逆地失活,半衰期為30 min,同時病毒形成團塊和大聚集體[4]。另外,如表1所示,改變水體條件能夠誘導水中病毒的聚集,在pH為7.0時,脊髓灰質(zhì)炎病毒和呼腸孤病毒均未聚集或混合聚集,在降低水體離子強度后,脊髓灰質(zhì)炎病毒聚集,但呼腸孤病毒仍未聚集,兩種病毒也未形成混合聚集體;在pH為6.0時,脊髓灰質(zhì)炎病毒再次聚集,盡管呼腸孤病毒未聚集,但它附著在脊髓灰質(zhì)炎病毒聚集物上;在pH為5.0及以下時,兩種病毒大量聚集并形成大的混合聚集體[5]。

表1 脊髓灰質(zhì)炎病毒和呼腸孤病毒在不同pH和離子強度下的聚集情況

1.2 病毒顆粒形態(tài) 病毒聚集體成功入侵宿主細胞后,能夠釋放多個病毒基因組,這些多基因組結(jié)構(gòu)能夠促進病毒-病毒相互作用,或加速病毒社會樣特征的進化,更有可能進行胞內(nèi)重組導致不尋常毒株出現(xiàn)[6]。甲型流感病毒粒子具多形性,常表現(xiàn)為球形、絲狀等,從甲流患者體內(nèi)分離出來的病毒毒株常呈絲狀,經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后,子代病毒表現(xiàn)為典型的球形,并伴隨毒力減弱[7]。有些RNA病毒會將每一段基因組都包裝成單獨顆粒,單獨顆粒侵入宿主細胞不會指示子代病毒的產(chǎn)生,病毒若想順利繁殖下去并完成生產(chǎn)性感染,必須抱團共同感染入侵宿主細胞,感染成功的概率也因此提高[8]。

2 病毒的生存規(guī)律和傳播模式

2.1 病毒生存規(guī)律 病毒在環(huán)境中沒有自養(yǎng)能力,需要了解其在環(huán)境中的生存規(guī)律,以研究病毒傳播的可能模式。大氣溫度和相對濕度(Relative humidity,RH)等因素對環(huán)境病原體的生存與傳播有重要影響,SARS-CoV-2和流感病毒的相關(guān)研究均發(fā)現(xiàn),與低RH或高RH相比,病毒在中等RH環(huán)境下更容易被滅活[9]。溫濕度、酸堿度和環(huán)境共存物等都會影響病毒在環(huán)境中存活的持久性。微塑料是近年來新出現(xiàn)的一種顆粒樣污染物,在空氣和水中都可被檢出[10]。據(jù)報道,病毒能夠吸附于微塑料表面以增加其生存、感染和傳播的可能性[10]。除微塑料外,不銹鋼、河水和土壤等非生命環(huán)境也都能夠成為病毒生存的載體,且病毒粒子的完整性可得到有效維持[11]。

流感病毒常通過飛沫傳播,有研究使用包膜噬菌體Phi6作為流感病毒的替代物,發(fā)現(xiàn)Phi6在飛沫中的存活率與環(huán)境的RH密切相關(guān)[12]。此外,Scanlan等創(chuàng)建了亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)的環(huán)境生存模型,并發(fā)現(xiàn)HeV在低溫和高緯度區(qū)域存活率更高[13]。研究污染物上含病毒唾液飛沫的結(jié)構(gòu)和蒸發(fā)動態(tài)及其對病毒活力的影響,有助于認清病毒的生存規(guī)律。本課題組研究發(fā)現(xiàn),唾液中的某些物質(zhì)可以對病毒起直接作用,在液滴殘留的“咖啡環(huán)”區(qū)域內(nèi),抗病毒蛋白和病毒粒子的直接接觸導致病毒活力與RH之間存在一個U-型關(guān)系;隨著液滴干燥,鹽類分子并沒有在咖啡環(huán)中與病毒直接接觸,其中殘留的抗病毒蛋白是影響U-型關(guān)系的重要因素(圖1);在液滴蒸發(fā)和干燥過程中,病毒粒子和咖啡環(huán)中抗病毒蛋白的直接接觸可能有助于U-型關(guān)系的建立;在中等RH時,抗病毒蛋白對咖啡環(huán)內(nèi)病毒粒子的影響最明顯[14]。由于蒸發(fā)誘導對流引起的流動運動,抗病毒蛋白和病毒粒子被夾帶、聚集和積累在咖啡環(huán)中,小顆粒分布在咖啡環(huán)的外層,大顆粒分布在咖啡環(huán)的內(nèi)部,鹽晶體在液滴殘渣的中心形成[14]。病毒和消毒劑的有效成分存在空間分布的差異,這可能是現(xiàn)有一些消毒劑需要加大使用濃度的原因。

圖1 含病毒唾液液滴的蒸發(fā)演化示意圖

2.2 病毒傳播模式 SARS-CoV-2具有很強的傳播能力,能通過與易感者接觸或者經(jīng)呼吸道感染,并無規(guī)律可循。病毒可以在多種因素誘導下形成聚集體或者在同一囊泡中出芽,Andreu-Moreno等證實VSV聚集體的適應能力和生產(chǎn)性感染能力都比VSV獨居體更強[2]。病毒傳播常由攜帶病毒基因組的結(jié)構(gòu)(如脂質(zhì)囊泡)介導,這些結(jié)構(gòu)增加了感染的多樣性[8]。不同類型的集體感染單位能夠?qū)е露鄠€病毒基因組共同傳遞到目標細胞,從而有利于共同感染[15]。

環(huán)境是影響病毒傳播的關(guān)鍵因素,流感病毒是一類典型的氣溶膠傳播病毒,存在明顯的季節(jié)性[9]。在受控環(huán)境中,相對濕度和溫度是影響流感病毒傳播的主要因素[9]。然而,對于環(huán)境流感病毒的生存和傳播,絕對濕度具有比相對濕度更高的影響力[16]。惡劣的天氣環(huán)境(如沙塵暴)對病毒傳播造成的影響更大,風載病毒可借風從起源地被運輸數(shù)千米,當空氣中沙塵含量大時,病毒甚至可被傳播到數(shù)萬米外的地方[17]。

2.3 外泌體 外泌體(Exosomes,EVs)是一種直徑≤100 nm的細胞分泌物,源于溶酶體內(nèi)陷所形成的多囊體(Multivesicularbody,MVB),如圖2所示,MVB與細胞膜融合后,EVs以胞吐形式釋放[18]。EVs性質(zhì)穩(wěn)定,在細胞間通信中至關(guān)重要,可作為蛋白質(zhì)和核酸的載體及生物循環(huán)過程中的標志物,用來診斷疾病[18]。在病毒包裝出芽階段,EVs包裹病毒,逃避免疫應答,提高子代病毒的存活率,并增加感染細胞的多樣性,但其可能會導致突變疊加積累[18-19]。在無包膜病毒中,甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)從細胞釋放后能夠隱藏在源自宿主的膜中,通過類似EVs形式感染宿主[20]。許多病毒顆粒聚集在EVs中可提高病毒的基因重組概率,提高整個病毒種群的適應性,基因組分節(jié)段的病毒可重排形成新基因型病毒(圖2)[21]。也有許多腸病毒顆粒被包裝在EVs中,而后從細胞中非溶解性釋放,與游離單病毒顆粒相比感染效率更高[22]。

圖2 細胞外囊泡介導細胞間非裂解病毒集體傳播示意圖

3 環(huán)境病毒學研究技術(shù)

3.1 病原體檢測技術(shù) 新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)期間,核酸檢測技術(shù)是金標準,SARS-CoV-2核酸檢測原理是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),該方法靈敏度和準確率高,但開展實驗需要專業(yè)的實驗室、實驗儀器和操作人員,并且檢測需用時幾小時[23]。隨著病例數(shù)量的增長,實驗室的檢測工作量加大,總體檢測時長會相應增加,因此限制了該方法的使用。

即時檢測(Point-of-care testing,POCT)能夠在任何時間、任何地點自由開展,與傳統(tǒng)實驗室檢測相比,POCT在樣本處理、儀器使用和操作人員要求方面都有了極大的進步。2012年,Trantum等報道了一種基于咖啡環(huán)效應(Coffee-ring effect,CRE)進行瘧疾檢測的技術(shù)模型,檢測結(jié)果最終以紅、綠、黃3種顏色信號方式呈現(xiàn)[24]。POCT的關(guān)鍵是能夠進行微量檢測,劉宏團隊研發(fā)了一種環(huán)介導等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)與CRE結(jié)合的可視化定量檢測微量核酸的技術(shù),該技術(shù)突破濁度法局限,將反應后的溶液滴加在膠體晶體基板上,副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)沉積形成咖啡環(huán),樣品中病原體含量的高低與咖啡環(huán)的寬度存在比例關(guān)系[25]。CRE與基于毛細管輔助裝置的生物傳感器結(jié)合,能夠?qū)悠愤M行有效預濃縮,顯著提高檢測裝置對目標病毒的敏感性[26]。COVID-19的流行加速了病原體快速檢測新技術(shù)的問世。Samper等研發(fā)出一種新型電化學毛細管流動裝置,該裝置對SARS-CoV-2 N蛋白的IgG抗體敏感,可達到市場檢測標準,且成本較低,有望成為醫(yī)療點的常用檢測技術(shù)[27]。SARS-CoV-2能夠隨生活污水進入排水管道,進而通過飛濺出的水滴進入居民家并造成傳播擴散。Mao等提出了一種利用紙張現(xiàn)場檢測廢水中SARS-CoV-2的技術(shù),能夠快速檢測出廢水中的病原體,且具有便攜和易處理的特點,為疫病的預防和控制提供參考資料[28]。在無法承建專業(yè)實驗室的地區(qū),POCT檢測以其簡單、便攜的特點,廣泛用于環(huán)境病毒的監(jiān)測和預警。

3.2 病毒消殺劑 許多病毒可通過氣溶膠傳播,降雨能夠直接沉降上層大氣中的病毒[29]。Whon等報道了3處不同地點的近地空氣樣本中病毒的空間豐度,結(jié)果介于1.7×106～4.0×107/m3,無顯著差異,同時雨水中檢出的病毒與居民區(qū)檢出的病毒具有相似性[29]。人類大部分時間是在相對封閉的室內(nèi)度過,與外界的氣體交換主要靠開窗或空調(diào)通風系統(tǒng),作為密閉環(huán)境,室內(nèi)類似一個大的微生物培養(yǎng)罐。Prussin等對9處室內(nèi)環(huán)境的病毒豐度進行了檢測,結(jié)果顯示,每立方米空間病毒豐度高達(5.9±3.9)×105;同時,9處室內(nèi)環(huán)境的病毒豐度均明顯高于室外環(huán)境[30]。針對空氣、水、室內(nèi)等環(huán)境進行病原體消毒,需要選擇合適的消毒劑和消殺模式。人們的消毒觀念往往認為消毒劑用量越大、活性越高,更有利于殺滅病毒;事實相反,消毒劑中有機物質(zhì)的存在可能會使病毒聚集體更難分散,使病毒對消毒劑更具抵抗力,因此活性較低的消毒劑才能夠更好地消滅聚集物中的病毒[1]。此外,由于采樣檢測數(shù)據(jù)并不能真實反映整體環(huán)境的病毒存在情況,或許會導致消殺結(jié)果與預期產(chǎn)生偏差,需要格外留意。

3.3 新技術(shù)及其應用潛力

3.3.1 外泌體相似研究技術(shù) 在物理和分子特性上,SARS-CoV-2病毒粒子與EVs具有相似性,因此EVs的分離和檢測技術(shù)也可能適用于病毒[31]。病毒粒子可以聚集在囊泡內(nèi)向鄰近細胞傳播,產(chǎn)生細胞間病毒共感染,細菌的存在可能會促進這種共感染現(xiàn)象的發(fā)生[32]。大多數(shù)巨型病毒需經(jīng)阿米巴吞噬才能入侵細胞,觸發(fā)阿米巴吞噬的首要條件是巨型病毒顆粒大小達500 nm,但直徑僅有250 nm的馬賽病毒(Marseillevirus,MsV)也能觸發(fā)這一途徑[33]。Arantes等報道,MsV能夠形成大型囊泡,其中含有多個病毒粒子,可刺激阿米巴吞噬發(fā)生,暴露于70 ℃中7～10 min的巨型囊泡仍具感染力,而單個病毒粒子失去感染力[33]。被包裹在囊泡中的病毒還可以逃避宿主免疫應答。腸道病毒傳播主要依靠糞-口途徑,糞便中的病毒載量和感染力是病毒傳播力的關(guān)鍵參數(shù)。單分散病毒粒子曾被認為具有最佳感染力,但是進一步研究發(fā)現(xiàn),囊泡內(nèi)病毒聚集體產(chǎn)生的病毒數(shù)量更多[22]。這也表明,糞便囊泡中的“病毒簇”可提高感染成功率,克服復制障礙[32]。這些發(fā)現(xiàn)有助于病毒檢測新技術(shù)的開發(fā)。

3.3.2 流式細胞術(shù) 在對病毒聚集的分析中,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,病毒粒子處于低pH環(huán)境時更易聚集,并可增加病毒共感染的概率[8]。以流式細胞術(shù)為原理的病毒分析被稱為流式病毒測定法(Flow virometry,FVM)[34]。FVM能夠用來測定病毒粒子的物理特征和目標病毒豐度,測量病毒顆粒的大小,但因流式細胞儀對目標物顆粒尺寸的限制,該方法在技術(shù)層面仍存在不少缺陷[35]。

3.3.3 宏基因組技術(shù) 宏基因組被定義為自然界中發(fā)現(xiàn)的全部微生物群的基因組,該技術(shù)以基因文庫為支撐。Breitbart等通過建立海洋中已知病毒的宏基因組文庫成功分析并發(fā)現(xiàn)了多種未知病毒,為了解海洋病毒多樣性、天然藥物研發(fā)和海洋病毒群落探索等提供資料[36]。Whon等采用宏基因組方法對某地區(qū)近地空氣中的單鏈DNA病毒進行分析,顯示出近半數(shù)的未知序列,表明空氣中可能存在某些未知的病毒[29]。宏基因組技術(shù)靈敏度高、準確性強,在發(fā)現(xiàn)新基因型病毒和預警新疾病流行中的應用前景可觀;但基因組文庫未完全覆蓋所有生物的現(xiàn)狀,對該技術(shù)的發(fā)展有所限制。

4 小結(jié)與展望

各種病毒性傳染病的突發(fā)或者持續(xù)發(fā)生,少不了“病毒傳播”這個關(guān)鍵環(huán)節(jié),環(huán)境病毒的檢測為了解病毒傳播途徑和追溯研究提供了重要證據(jù),也成為預防和控制感染范圍擴大的有效手段。COVID-19的肆虐,凸顯出對病毒本“毒”的不了解,深入探究病毒粒子形態(tài)、結(jié)構(gòu)動態(tài)變化及環(huán)境因素對病毒入侵和致病的影響,結(jié)合大數(shù)據(jù)分析預測、建立智能數(shù)據(jù)庫,通過跨學科交叉合作,有利于建立病毒感染的共同認知和研究新范式。