童珍珍，高雅麗，許娟娟，黃方，許詣，陳霞

1 上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 201805；2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院兒科

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征的異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機制至今仍不完全清楚［1］。氣道上皮細胞是氣道屏障的重要組成部分。氣道上皮細胞損傷會引起氣道炎癥和氣道重塑，從而導(dǎo)致支氣管哮喘患者氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性［2］。因此，深入探索氣道上皮細胞損傷的分子機制對支氣管哮喘的防治具有重要意義。微小RNA-660-3p（miR-660-3p）在細胞增殖、凋亡及組織纖維化等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。有研究報道，miR-660-3p 在心力衰竭患者心肌組織及血漿中表達上調(diào)，并可作為診斷心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物［3］；在肝纖維化小鼠肝組織中miR-660-3p 高表達，抑制其表達可減輕肝纖維化程度，這為肝纖維化治療提供了潛在的靶標(biāo)［4］。但目前miR-660-3p在支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。miRNA 可通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）完全或不完全互補結(jié)合，引起靶基因mRNA 降解或翻譯抑制，從而參與各種生命活動［5］。在線生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，具有ITAM 基序1 的NFAT 活化蛋白（NFAM1）為miR-660-3p 的靶基因。NFAM1 是一種攜帶ITAM 的跨膜受體，可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。有研究報道，在克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道活檢和炎癥性腸病小鼠血清中均觀察到NFAM1 表達增加，并且在單核細胞和中性粒細胞中亦觀察到NFAM1 高表達［6-7］。但NFAM1 在支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不完全清楚。呼吸道合胞病毒（RSV）是誘發(fā)支氣管哮喘的常見病原體，可引起氣道炎癥反應(yīng)，進而促進支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展［8］。2022 年6 月—12 月，本研究探討了miR-660-3p 靶向NFAM1 對RSV 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡及炎癥因子分泌的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞系16HBE，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。RSV-Long 病毒2 型株，購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所。miR-660-3p 模擬物（miR-660-3p mimics）及其對照序列（NC mimics）、NFAM1過表達載體（pcDNA-NFAM1）及其對照空載體（pcDNA-NC）、NFAM1 突變型質(zhì)粒（NFAM1-MUT）及其野生型質(zhì)粒（NFAM1-WT）以及PCR 引物，購自上海生工生物工程股份有限公司。NanoDrop 2000C 超微量分光光度計，購自美國Thermo Scientific 公司；ABI Prism?7500 型實時熒光定量PCR 儀，購自美國Applied Biosystems 公司；iMark680 多功能酶標(biāo)儀，購自美國BIO-RAD 公司；FACSCalibur流式細胞儀，購自美國Becton-Dickinson公司。TRIzol、LipofectamineTM2000，購自美國Invitrogen公司。Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒、SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。NFAM1 單克隆抗體及兔抗人活化的半胱天冬酶3（Cleaved-Caspase-3）、β-actin 一抗和山羊抗兔IgG二抗，購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) 將凍存的16HBE 細胞快速解凍復(fù)蘇，接種于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞生長至80%左右融合時，胰蛋白酶消化后計數(shù)，按1∶2傳代。取對數(shù)生長期16HBE細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期16HBE 細胞，以2.5 × 105個/孔接種于6孔板，然后置于DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。隨機分為對照組、RSV組、miR-NC +RSV組、miR-660-3p + RSV組、pcDNA-NFAM1 + RSV組、pcDNA-NC + RSV 組、miR-660-3p + pcDNA-NC +RSV 組、miR-660-3p + pcDNA-NFAM1 + RSV 組，按LipofectamineTM2000 說明，miR-NC + RSV 組轉(zhuǎn)染NC mimics，miR-660-3p + RSV 組轉(zhuǎn)染miR-660-3p mimics，pcDNA-NFAM1 + RSV 組轉(zhuǎn)染pcDNANFAM1，pcDNA-NC + RSV 組轉(zhuǎn)染pcDNA-NC，miR-660-3p + pcDNA-NC + RSV組共轉(zhuǎn)染pcDNA-NC和miR-660-3p mimics，miR-660-3p + pcDNA-NFAM1 +RSV組共轉(zhuǎn)染pcDNA-NFAM1和miR-660-3p mimics。對照組和RSV組不予轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，除對照組外，其余各組均予RSV 感染，MOI設(shè)定為0.000 1［9］。感染24 h，收集各組細胞及其培養(yǎng)液。

1.4 miR-660-3p、NFAM1 mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR法。收集各組上述細胞，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000C 超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 10 min，45 ℃ 30 min，72 ℃ 4 min。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：miR-660-3p上游引物5'-CGTAGAGCGGCTAGGGATCG-3'、下游引物5'-CGAATACTCTCTGAGCTGA-3'，內(nèi)參U6 上游引物5'-CGAGATCGATGGAAAACCCCG-3'、下游引物5'-AGGCGCGCGGGAACCTTTA-3'；NFAM1 上游引物5'-CGAAACCTCCGAAGCAA-3'、下游引物5'-AAATTTGCGTCCGTGAC-3'，內(nèi)參GAPDH 上游引物5'-CGAGAGAAGTACCAAGATGAG-3'、下游引物5'-CGAGGCAGGCTTCGACG-3'。PCR 擴增體系共20 μL：2 × SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O補足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共35 個循環(huán)。PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。分別以U6 或GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。收集各組上述細胞，胰蛋白酶消化，用結(jié)合緩沖液重懸制成密度為1 × 105/mL 細胞懸液。取細胞懸液1 mL，1 000 r/min 離心5 min、離心半徑8 cm，棄上清。向沉淀中加入結(jié)合緩沖液500 μL 重懸細胞。然后依次加入Annexin Ⅴ-FITC 10 μL、PI 5 μL，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 NFAM1、Cleaved-Caspase-3 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集各組上述細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。加入適量蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Cleaved-Caspase-3、NFAM1、β-actin一抗（稀釋比分別為1∶500、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，洗膜后加入山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比1∶1 000），37 ℃孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 檢測 收集各組細胞培養(yǎng)液，3 500 r/min 離心10 min、離心半徑8 cm，留取上清液。采用ELISA 法檢測培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6、IL-1β。

1.8 miR-660-3p 與NFAM1 的靶向關(guān)系預(yù)測與驗證 通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-660-3p與NFAM1的靶向結(jié)合位點。取對數(shù)生長期16HBE 細胞，以2.5 × 105個/孔接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長至80%左右融合時，按LipofectamineTM2000 說明，將NFAM1-WT、NFAM1-MUT 分別與NC mimics、miR-660-3p mimics共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV 組與對照組miR-660-3p、NFAM1、Cleaved-Caspase-3 表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較 見表1、2。

表1 兩組miR-660-3p、NFAM1、Cleaved-Caspase-3表達比較（± s）

表1 兩組miR-660-3p、NFAM1、Cleaved-Caspase-3表達比較（± s）

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表2 兩組細胞凋亡率及培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

表2 兩組細胞凋亡率及培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

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2.2 上調(diào)miR-660-3p 表達對RSV 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞Cleaved-Caspase-3 蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平的影響 見表3。

表3 兩組miR-660-3p、Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

表3 兩組miR-660-3p、Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

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2.3 上調(diào)NFAM1 表達對RSV 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞Cleaved-Caspase-3 蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平的影響 見表4。

表4 兩組NFAM1 mRNA、Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

表4 兩組NFAM1 mRNA、Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

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2.4 miR-660-3p 與NFAM1 的靶向調(diào)控關(guān)系 經(jīng)starBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，NFAM1 的3′UTR 存在與miR-660-3p 的結(jié)合位點，見圖1。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，相較于共轉(zhuǎn)染NC mimics 與NFAM1-WT 的16HBE 細胞，共轉(zhuǎn)染miR-660-3p mimics與NFAM1-WT的16HBE細胞熒光素酶活性降低（0.40 ± 0.04 比1.00 ± 0.10；t=16.713，P＜0.05）；相較于共轉(zhuǎn)染NC mimics 與NFAM1-MUT 的16HBE細胞，共轉(zhuǎn)染miR-660-3p mimics 與NFAM1-MUT 的16HBE 細胞熒光素酶活性變化不明顯（0.99 ± 0.08比1.02 ± 0.09；t=0.747，P＞0.05）。

圖1 miR-660-3p與NFAM1的靶向結(jié)合位點示意圖

2.5 上調(diào)NFAM1、miR-660-3p 表達對RSV 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞Cleaved-Caspase-3 蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平的影響 見表5。

表5 兩組Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

表5 兩組Cleaved-Caspase-3蛋白表達以及細胞凋亡率和培養(yǎng)上清液炎癥因子水平比較（± s）

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3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征。據(jù)統(tǒng)計，目前全球約有3 億人罹患支氣管哮喘，并且其患病率仍在不斷上升［10］。支氣管哮喘的發(fā)病機制至今仍不完全清楚，可能與氣道上皮細胞損傷引起的炎癥因子過度釋放有關(guān)。

miRNA是一類在真核生物中廣泛存在的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控，從而廣泛參與人體內(nèi)各種生命活動，如細胞增殖、分化、凋亡等。有研究報道，多種miRNA在哮喘患者支氣管黏膜或血清中異常表達，如miR-511-3p［11］、miR-144-3p［12］，這些異常表達的miRNA 能夠調(diào)控支氣管上皮細胞凋亡以及不同程度炎癥反應(yīng)，可作為臨床治療支氣管哮喘的分子靶點。miR-660-3p 是miRNA 家族成員之一，在細胞增殖、凋亡及組織纖維化等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。有研究報道，miR-660-3p在胃癌［13］、卵巢癌［14］和乳腺癌［15］等惡性腫瘤組織和細胞中低表達，其表達上調(diào)可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等，可作為惡性腫瘤臨床治療的分子靶點。NFAM1為miR-660-3p的靶基因。NFAM1 是一種攜帶ITAM 的跨膜受體，在單核細胞和中性粒細胞中高表達，可促進炎癥因子、趨化因子受體表達，是自身免疫性疾病潛在的治療靶點。有研究報道，NFAM1 在克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道活檢中表達上調(diào)［6-7］。但目前miR-660-3p 和NFAM1在支氣管哮喘發(fā)生、發(fā)展中作用的研究報道較少。

氣道上皮細胞是氣道防御的第一道屏障，在受到外界有害刺激后發(fā)生活化，釋放一系列炎癥介質(zhì)、細胞因子和黏附分子等，加重哮喘患者氣道炎癥［16］。TNF-α、IL-6和IL-1β均屬于促炎癥細胞因子，可刺激炎癥細胞合成和炎癥介質(zhì)釋放，在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，支氣管哮喘患者外周血TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，并且其水平越高，病情越嚴(yán)重［17］。過度炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase是一類與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，Caspase活化是導(dǎo)致細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。作為Caspase級聯(lián)反應(yīng)的重要物質(zhì)，Caspase-3可活化為Cleaved-Caspase-3，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，RSV 誘導(dǎo)后支氣管上皮細胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平及細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3 表達均升高，表明RSV 能誘導(dǎo)支氣管上皮細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，并促進其凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV 感染可上調(diào)支氣管上皮細胞中NFAM1表達；上調(diào)miR-660-3p表達可降低RSV 誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平及細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3表達，提示上調(diào)miR-660-3p 表達可抑制RSV 誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。過表達NFAM1 則可使RSV 感染后支氣管上皮細胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高，促進細胞凋亡和上調(diào)Cleaved-Caspase-3 表達，提示過表達NFAM1 可促進支氣管上皮細胞損傷，誘發(fā)并加重哮喘。

本研究通過在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對miR-660-3p的下游靶基因進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-660-3p 與NFAM1的3′UTR存在互補結(jié)合位點，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸iR-660-3p 與NFAM1 的靶向關(guān)系進行驗證，結(jié)果證實二者存在靶向調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，miR-660-3p 表達上調(diào)對支氣管上皮細胞NFAM1 蛋白表達具有抑制作用，而下調(diào)miR-660-3p 表達則能促進NFAM1 蛋白表達，提示miR-660-3p 對NFAM1 具有靶向負調(diào)控作用。據(jù)此推測，miR-660-3p 可能通過靶向負調(diào)控NFAM1 表達參與RSV 誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞損傷。為了進一步驗證miR-660-3p 的作用機制，本研究在上調(diào)miR-660-3p 表達的基礎(chǔ)上通過pcDNA-NFAM1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來過表達NFAM1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達NFAM1 可逆轉(zhuǎn)miR-660-3p上調(diào)對RSV誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌的抑制作用，提示miR-660-3p可能通過靶向負調(diào)控NFAM1 來抑制RSV 誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌。

綜上所述，miR-660-3p 可通過靶向負調(diào)控NFAM1 抑制RSV 誘導(dǎo)支氣管上皮細胞凋亡及炎癥因子分泌。