田驕，王婷婷，2，徐意，蘇芮，王晶

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2 北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；3 中藥復(fù)方新藥開發(fā)國家工程研究中心

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種以腹痛、腹瀉、便血以及里急后重等為主要特征的腸道慢性炎癥性疾?。?］。UC 的病因目前尚不明確，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，包括免疫因素、遺傳因素和環(huán)境因素等［2］。有研究認(rèn)為，Th1/Th2 免疫軸失衡在UC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，Th1/Th2 免疫軸失衡可導(dǎo)致腸道炎癥加重，加速病情進(jìn)展［3］。目前，UC主要采取藥物治療，如氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等［4］。但這些藥物長期大量使用對(duì)機(jī)體胃腸道的影響較大，易誘發(fā)多種不良反應(yīng)［5］。中醫(yī)學(xué)上并無“潰瘍性結(jié)腸炎”這一病名，根據(jù)其臨床特征，本病歸屬中醫(yī)“痢疾”“泄瀉”“便血”和“腸風(fēng)”等范疇。中藥能夠通過抑制炎癥反應(yīng)及保護(hù)腸道黏膜等途徑改善臨床癥狀，不良反應(yīng)相對(duì)較輕。香連止瀉片原方出自清代沈金鰲《沈氏尊生書》中的“香連化滯丸”，具有清熱祛濕、化滯止痢之功效。盡管已有研究證實(shí)，香連止瀉片對(duì)UC具有較好的臨床療效［6-7］，但對(duì)其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。香連止瀉片的主要成分有木香烴內(nèi)酯［8］、小檗堿［9］、黃連粗多糖［9］、黃連總生物堿［10］、環(huán)氧橙皮油素［11］、白芍總苷［12］，這些成分能夠有效改善UC小鼠結(jié)腸組織病理損傷，進(jìn)而改善UC 癥狀。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香連止瀉片對(duì)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)UC小鼠的治療效果較好，可緩解其體質(zhì)量減輕、稀便、血便及結(jié)腸長度縮短等癥狀或體征，并可修復(fù)結(jié)腸組織病理損傷［13］。但DSS價(jià)格昂貴，其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在動(dòng)物個(gè)體間存在一定差異。惡唑酮為半抗原誘導(dǎo)劑，價(jià)格便宜，小鼠直腸給藥后能夠引起小鼠嚴(yán)重的便血、稀便等癥狀，同時(shí)還能誘導(dǎo)Th1/Th2 免疫軸失衡。2022 年8 月—12 月，本研究探討了香連止瀉片對(duì)惡唑酮誘導(dǎo)UC小鼠的治療作用，并基于Th1/Th2免疫軸探討了其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性BALB/c 小鼠48 只，SPF 級(jí)，8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠于北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23.0 ±2.0）℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h/12 h明暗交替，正常通風(fēng)。本研究經(jīng)北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（倫理審查編號(hào)：YJY-2022-082301）。香連止瀉片，購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司。香連止瀉片研磨粉碎，溶解于超純水中，使其終濃度為10 mg/mL，按體表面積折算法換算，香連止瀉片中劑量為臨床等效劑量，香連止瀉片高、低劑量分別為臨床等效劑量的2、1/2倍。美沙拉嗪緩釋顆粒，購自上海愛的發(fā)制藥有限公司。美沙拉嗪緩釋顆粒用羧甲基纖維素鈉溶解，使其終濃度為2 mg/mL，按體表面積折算法換算，美沙拉嗪給藥劑量為臨床等效劑量。惡唑酮，購自美國BioLegend 公司。流式細(xì)胞儀，購自美國Agilent公司；酶標(biāo)儀，購自美國BioTek 公司。TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒，IFN-γ、IL-4 一抗，HRP 標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG 二抗，APC anti-mouse IFN-γ 抗體、PE anti-mouse IL-4 抗體、PerCP anti-mouse CD4 抗體，購自美國BioLegend公司。

1.2 動(dòng)物分組與干預(yù) 所有BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、美沙拉嗪組以及香連止瀉低、中、高劑量組，每組8 只。模型組、美沙拉嗪組以及香連止瀉低、中、高劑量組采用惡唑酮誘導(dǎo)UC 模型［14］。空白組正常飼養(yǎng)，不予惡唑酮誘導(dǎo)UC 模型。自建模第1 天開始，美沙拉嗪組予美沙拉嗪0.31 g/kg 灌胃，香連止瀉低、中、高劑量組分別予香連止瀉片0.68、1.36、2.72g/kg 灌胃，空白組和模型組予等量超純水灌胃，連續(xù)灌胃7天。

1.3 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)估 灌胃期間，每日評(píng)估DAI。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，體質(zhì)量不變，大便正常；1 分，體質(zhì)量下降＜5%，輕微稀便，輕微血便；2 分，體質(zhì)量下降5%～＜10%，少量稀便，少量血便；3 分，體質(zhì)量下降10%～＜15%，大量稀便，大量血便；4分，體質(zhì)量下降≥15%，嚴(yán)重腹瀉，血液充滿整個(gè)結(jié)腸。DAI評(píng)分=（體質(zhì)量下降評(píng)分+大便性狀評(píng)分+血便評(píng)分）/3。

1.4 結(jié)腸長度測(cè)量和脾臟指數(shù)計(jì)算 末次灌胃結(jié)束，稱量小鼠體質(zhì)量。麻醉后剪開腹腔，分離脾臟并稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。分離結(jié)腸，測(cè)量整段結(jié)腸長度。

1.5 結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察 取小鼠結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，去除黏膜表面的糞便和分泌物，截取同一位置病變結(jié)腸或正常結(jié)腸，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片。切片常規(guī)脫蠟至水，高碘酸溶液氧化，Schiff染色，蘇木素染核，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)變化，計(jì)數(shù)結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.6 結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α 含量檢測(cè) 取部分結(jié)腸組織，置于冰上勻漿，4 ℃下5 000 r/min 離心20 min、離心半徑10 cm，留取上清液。采用ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織上清液IL-1β、TNF-α含量。

1.7 結(jié)腸組織IFN-γ、IL-4 蛋白表達(dá)檢測(cè) 每組取3 只小鼠結(jié)腸組織，剪碎，加入組織裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。加入5 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水浴充分變性。取部分變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至NC 膜上。5% BSA 室溫封閉1 h，分別加入IFN-γ、IL-4、β-actin一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP 標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影。采用Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Th1、Th2 細(xì)胞比例檢測(cè) 末次灌胃結(jié)束，將小鼠麻醉后取血，置于含EDTA 的離心管中，用PBS 將抗凝血液稀釋一倍，輕輕混勻。向離心管中加入3 mL 淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的血液平鋪在淋巴細(xì)胞分離液上層，室溫下低速離心，吸出淋巴細(xì)胞層，離心收集細(xì)胞，RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸，加入Human TruStain FcX?室溫孵育10 min。收集細(xì)胞，加入CD4 抗體室溫避光孵育15 min，細(xì)胞固定液室溫避光固定，細(xì)胞破膜液破膜，分別加入IFN-γ、IL-4抗體室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)，分析Th1 細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例，計(jì)算Th1/Th2。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊性，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間DAI評(píng)分比較 見表1。

表1 各組不同時(shí)間DAI評(píng)分比較（± s）

表1 各組不同時(shí)間DAI評(píng)分比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，△P＜0.05。

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2.2 各組結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)比較 見表2。

表2 各組結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)比較（± s）

表2 各組結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉中劑量組比較，▲P＜0.05。

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2.3 各組結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察和結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量比較 空白組結(jié)腸黏膜上皮完整，黏膜杯狀細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)完整，數(shù)量正常，無空泡，內(nèi)含糖原物質(zhì)正常；與空白組比較，模型組結(jié)腸黏膜上皮不完整，黏膜杯狀細(xì)胞排列不規(guī)則，數(shù)量減少，頂部呈空泡狀，內(nèi)含糖原物質(zhì)減少；與模型組比較，香連止瀉低、中、高劑量組和美沙拉嗪組結(jié)腸黏膜上皮完整，黏膜杯狀細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)完整，數(shù)量正常，頂部部分呈空泡狀，內(nèi)含糖原物質(zhì)趨于正常。空白組、模型組、美沙拉嗪組及香連止瀉低、中、高劑量組結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為（172.75 ± 15.37）、（47.50 ± 5.29）、（159.18 ± 20.61）、（86.85 ± 8.37）、（103.75 ± 9.57）、（135.66 ± 12.50）個(gè)。與空白組比較，模型組結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組及香連止瀉低、中、高劑量組結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著增加（P均＜0.05），以美沙拉嗪組和香連止瀉高劑量組杯狀細(xì)胞數(shù)量增加較為明顯，幾乎趨近于空白組。

2.4 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β含量比較 見表3。

表3 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β含量比較（pg/mg，± s）

表3 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β含量比較（pg/mg，± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，▲P＜0.05。

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2.5 各組結(jié)腸組織IL-4、IFN-γ蛋白表達(dá)比較 見表4。

表4 各組結(jié)腸組織IL-4、IFN-γ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

表4 各組結(jié)腸組織IL-4、IFN-γ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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2.6 各組全血Th1、Th2 細(xì)胞比例及Th1/Th2 比較 見表5。

表5 各組全血Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比較（± s）

表5 各組全血Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05；與香連止瀉低劑量組比較，▲P＜0.05；與香連止瀉中劑量組比較，▽P＜0.05。

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3 討論

近年來，我國UC患病例數(shù)逐漸增多，患病人群呈年輕化趨勢(shì)，多見于20～40歲人群。UC病情輕重不等，多呈反復(fù)發(fā)作的慢性病程，并且隨著病程延長，其癌變概率逐漸升高。UC 不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還會(huì)給患者和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［15］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，外感濕邪、飲食不潔、情志內(nèi)傷等是UC 病情加重的主要原因，而腸道濕熱、氣滯不通則為其基本病機(jī)。香連止瀉片原方出自清代沈金鰲《沈氏尊生書》中的“香連化滯丸”，具有清熱祛濕、化滯止痢之功效，主要用于治療腸中蘊(yùn)熱引起的紅白痢疾。研究發(fā)現(xiàn)，香連止瀉片的主要有效成分能夠不同程度改善UC 癥狀。例如，木香烴內(nèi)酯可改善UC 小鼠腸道菌群狀態(tài)，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫軸平衡［8］；黃連粗多糖聯(lián)合小檗堿對(duì)UC 小鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用［9］，黃連總生物堿對(duì)UC 大鼠腸黏膜損傷具有明顯抑制作用［10］，環(huán)氧橙皮油素可降低UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)以及結(jié)腸組織TNF-α 含量［11］，白芍總苷可減少UC 大鼠結(jié)腸組織TNF-α、PGE2等炎癥因子表達(dá)［12］。盡管已有研究證實(shí)，香連止瀉片對(duì)UC 具有較好的臨床療效［6-7］，但對(duì)其具體作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。

本研究采用惡唑酮誘導(dǎo)UC小鼠模型，探索了香連止瀉片對(duì)UC小鼠的治療作用，并基于Th1/Th2免疫軸探討了其作用機(jī)制。本研究首先通過DAI評(píng)分初步評(píng)估了UC 小鼠疾病嚴(yán)重程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組各時(shí)間DAI評(píng)分均顯著高于空白組；香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組在灌胃給藥3 天后DAI 評(píng)分開始顯著降低。UC模型動(dòng)物因持續(xù)腹瀉和便血，會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸長度縮短。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，而脾臟指數(shù)能夠在一定程度上反映機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸長度顯著小于空白組，脾臟指數(shù)顯著高于空白組；香連止瀉高、低劑量組和美沙拉嗪組則能顯著抑制UC小鼠結(jié)腸長度縮短，香連止瀉高、中劑量組和美沙拉嗪組則能顯著降低脾臟指數(shù)，從而改善小鼠結(jié)腸炎癥狀態(tài)。本研究PAS染色進(jìn)一步觀察了結(jié)腸組織病理形態(tài)變化和結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量及其分泌狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織病理損傷明顯，結(jié)腸黏膜上皮破裂，內(nèi)含糖原物質(zhì)明顯減少，結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低；香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組結(jié)腸組織病理損傷減輕，杯狀細(xì)胞排列較規(guī)則，形態(tài)較完整，內(nèi)含糖原物質(zhì)基本趨于正常，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增多，從結(jié)腸組織病理學(xué)角度上進(jìn)一步印證了香連止瀉片治療UC的有效性。Th1、Th2細(xì)胞由CD4+T細(xì)胞分化而來，正常情況下機(jī)體中Th1/Th2免疫軸處于平衡狀態(tài)。Th1/Th2 免疫軸失衡會(huì)導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞過度活化，從而促進(jìn)腸道炎癥進(jìn)展［16］。Th1細(xì)胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等，具有促炎作用。IFN-γ能夠重新激活CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，從而參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有抑炎作用。IL-4可使CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，活化B 細(xì)胞，從而介導(dǎo)體液免疫和超敏反應(yīng)［17］。作為UC 患者體內(nèi)重要的促炎因子，TNF-α 可誘導(dǎo)趨化因子，激活腸道上皮細(xì)胞，使腸道中性粒細(xì)胞聚集，從而促進(jìn)UC的發(fā)生、發(fā)展。TNF-α還可損傷結(jié)腸血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管通透性增加，進(jìn)一步引起結(jié)腸黏膜損傷［18］。促炎因子IL-1β在UC的病理生理過程中扮演重要角色。UC患者結(jié)腸黏膜中分泌大量IL-1β，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，進(jìn)而刺激腸道黏膜，加重腸道炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β 含量顯著高于空白組，提示UC 小鼠腸道炎癥反應(yīng)明顯。同時(shí)，模型組結(jié)腸組織IFN-γ蛋白表達(dá)以及全血Th1細(xì)胞比例和Th1/Th2均顯著高于空白組，結(jié)腸組織IL-4蛋白表達(dá)和全血Th2 細(xì)胞比例顯著低于空白組，提示UC模型小鼠Th1/Th2免疫軸處于失衡狀態(tài)，腸道黏膜出現(xiàn)明顯炎癥。與模型組比較，香連止瀉各劑量組和美沙拉嗪組均能降低結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β含量及IFN-γ蛋白表達(dá)，提高IL-4蛋白表達(dá)，降低Th1 細(xì)胞比例和Th1/Th2，提高Th2 細(xì)胞比例，糾正Th1/Th2免疫軸的失衡狀態(tài)。本研究以美沙拉嗪作為陽性對(duì)照藥物，其主要成分是5-氨基水楊酸，臨床主要用于治療UC。本研究結(jié)果顯示，與美沙拉嗪組比較，香連止瀉各劑量組在部分指標(biāo)上展現(xiàn)出了更好的效果。例如，香連止瀉中劑量組能夠顯著降低結(jié)腸組織IFN-γ蛋白表達(dá)；香連止瀉中、高劑量組降低Th1細(xì)胞比例的效果優(yōu)于美沙拉嗪組；香連止瀉低劑量組升高Th2細(xì)胞比例的效果優(yōu)于美沙拉嗪組。

綜上所述，不同劑量香連止瀉片對(duì)惡唑酮誘導(dǎo)UC小鼠均有一定治療作用，以香連止瀉片高劑量（2倍的臨床等效劑量）效果最佳；糾正Th1/Th2免疫軸失衡，減輕腸道炎癥，可能是香連止瀉片的作用機(jī)制之一。