程慧濤，戴遠棠，阮炘賀，李育森，李麗華，段旭琢，單金紅，賈弦澤，徐 斌，王 慶，2，趙會宏，2

(1.華南農業(yè)大學，廣州 510642；2.廣州南沙華農漁業(yè)研究院，廣州 511458；3.廣東海大集團股份有限公司，廣州 511434；4.廣東東源縣現(xiàn)代農業(yè)綜合服務中心，廣東河源 517500)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)屬擬鰲蝦科滑螯蝦屬[1]，原產于澳大利亞北部[2]，屬于熱帶淡水小龍蝦[3]，也被稱為澳洲淡水龍蝦，因其個體大，出肉率高，肉質鮮美，并且具有廣泛的環(huán)境忍耐力，在pH 5.8～8.2、溫度5～37 ℃、溶氧量不低于1.5 mg/L的水體中都能生存，這也使得紅螯螯蝦在水產養(yǎng)殖中具有很大的潛力[4-6]，是世界上最有價值的經濟淡水甲殼動物之一[7，8]。20世紀90年代紅螯螯蝦首次引進中國，目前主要在我國南方地區(qū)養(yǎng)殖[3]，市場歡迎度很高[9]。

物種的遺傳多樣性會因為近親繁殖和遺傳漂變而降低，使物種喪失環(huán)境適應能力和降低物種的抗病力，所以物種高水平的遺傳多樣性就顯得非常重要[10]。對不同地區(qū)的紅螯螯蝦養(yǎng)殖品種進行遺傳分析可為該物種的遺傳資源保護提供依據[3，11]?；蚪M中由1到6個堿基對長單元組成的串聯(lián)重復DNA序列被稱為微衛(wèi)星[10]，具有中性、共顯性、高度的多態(tài)性和跨基因組的隨機分布等特性[12-14]。目前，微衛(wèi)星標記已經被用來分析羊、蛇、蟹、蝦和魚等物種的遺傳分析[12，15-17]。

紅螯螯蝦作為十足目甲殼類動物，通常只會顯示出低水平的等位酶變異[9，18]，而對于一些表現(xiàn)出較低的等位酶變異的物種而言，核基因組中的微衛(wèi)星位點已經被證明對于記錄類似物種的遺傳多樣性具有重要作用[19]。為了解不同地區(qū)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，本研究基于本實驗室先前轉錄組結果，選取篩選了8個微衛(wèi)星位點，對中國不同地區(qū)(廣東省湛江市、廣東省佛山市、廣東省惠州市、廣西自治區(qū)南寧市、浙江省湖州市)的5個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性分析，以期為后續(xù)紅螯螯蝦群體遺傳多樣性研究及相關育種工作提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用的紅螯螯蝦群體分別來自廣東省湛江市(GDZJ)、廣東省佛山市(GDFS)、廣東省惠州市(GDHZ)和廣西自治區(qū)南寧市(GXNN)，從當地養(yǎng)殖戶購買，浙江省湖州市(ZJHZ)購自于浙江水產研究所。每個群體30尾，。取背部適量的肌肉樣品共150份，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒(北京金沙生物技術有限公司)提取樣品DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，微量分光光度計測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物篩選

根據本實驗室開展紅螯螯蝦轉錄組測序得到SSR序列，使用Primer6.0軟件設計引物后進行PCR擴增。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，合成時正向引物F的5’端加上通用Tag的16個堿基的引物序列，第一次擴增DNA時片段就多帶一段Tag序列。第二輪篩選擴增條帶理想的PCR產物進行熒光引物PCR，所用引物是Tag修飾引物和各自對應的反向R引物。用Tag的修飾引物，帶Tag序列的F引物，R引物共3條引物可以一起多重擴增達到目的，最后擴增良好的熒光PCR產物用3730xl測序儀進行檢測，得到的數據進行Genemapper軟件分析，判斷不同引物是否具體片段多態(tài)性，最后獲得8對符合條件的引物(表1)。

表1 8對微衛(wèi)星引物信息Tab.1 Information of eight pairs of microsatellite primers

1.2.3 PCR擴增

用合成的引物的不同引物進行擴增，以擎科金牌Mix(green)試劑盒進行擴增，擴增體系為20 μL：金牌Mix(green) 17 μL、10 μmol/L Primer F(加接頭)1 μL、10 μmol/L Primer R 1 μL、Template(gDNA)1 mL。PCR擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃ 10 s、各引物特異性退火溫度(表1)10 s、72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。最后擴增良好的熒光PCR產物用3730xl測序儀進行檢測，得到的數據使用Genemapper軟件分析。

1.2.4 數據分析

SSR位點和種群的各項遺傳多樣性指標分別在Popgen32[20]中計算，包括觀察到的等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農指數(I)、多態(tài)性信息指數(PIC)、哈迪溫伯格平衡(PHWE)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和等位基因豐富度(Ar)。用FSTAT[10]軟件計算近親繁殖系數(Fis)和遺傳分化指數(Fst)。本實驗的種群遺傳結構是基于STRUCTURE 2.3.3版軟件中的貝葉斯模型的種群聚類方法。采用馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法使用預先設定的種群分組(K)，同時根據等位基因頻率對個體進行計算、抽樣和分組。K值被設定為5，對每個K值進行10次獨立運行，每個周期的重復采樣次數被設定為100 000。最后，根據EVANNO等[21]的方法，在STRUCTURE HARVESTER網站上計算出最佳K值。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性

由表2可知，8個微衛(wèi)星位點Na數范圍在3～12，平均為8.125 0。Ne范圍為1.466 4～4.781 1。I的范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。多態(tài)信息含量的數值范圍為0.280 5～0.764 5，平均值0.590 1，8對引物PIC>0.25，具有較高的多態(tài)信息。綜上，本實驗所開發(fā)的8對SSR引物的多態(tài)性較高。

表2 8對微衛(wèi)星引物的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters at ten microsatellite loci

5個群體在8個微衛(wèi)星位點確定了237個Na(表3)，Na數范圍為2～10，平均為6.05。Ho和He平均值分別為0.490和0.614。每組的Na數在6.000(GXNN)～6.625(GDFS)。所有種群間觀察到的Ar數量無明顯差異，Ar平均值在2.788(ZJHZ)～3.205(GDZJ)。所有群體中平均He在0.593(GDHZ)～0.646(GDZJ)。綜上可以看出遺傳多樣性并未顯著降低。此外，養(yǎng)殖種群的近交系數(Fis)表明GXNN(0.263)、ZJHZ(0.264)這2個地區(qū)的養(yǎng)殖群體比GDHZ(0.155)、GDZJ(0.226)、GDFS(0.158)這3地區(qū)的群體分化更嚴重。

表3 5個紅螯螯蝦群體在8個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性統(tǒng)計Tab.3 Genetic diversity parameters at eight microsatellite loci among five populations of C.quadricarinatus

2.2 遺傳分化分析

群體間分化程度的指標常用Fst和P值量化不同種群間遺傳分化程度(表4)。從結果中可知，GXNN、GDHZ、GDFS 3個種群相似度最高，ZJHZ和GDZJ最低；并且GXNN、GDHZ、GDFS之間基本沒有遺傳分化，ZJHZ和GDZJ之間存在中等程度的遺傳分化。從分子方差分析(AMOVA)結果可知(表4)，種群內遺傳變異較大，占變異總量的98%，種群間的遺傳變異僅占2%，可以看出遺傳變異主要來自種群內。在STRUCTURE(2.3.3版本)軟件中基于貝葉斯模型的群體聚類方法，得到最適delta K值為5(圖1)，表明5個聚類是最可能的種群結構。由圖2可知，5個養(yǎng)殖群體表現(xiàn)明顯的差異，說明這5個種群具有明顯的遺傳結構。

圖1 STRUCTURE分析的ΔK方法繪制的K值變動圖Fig.1 K value change diagram drawn by ΔK method of STRUCTURE analysis

圖2 K=5時150個樣品的STRUCTURE結果Fig.2 The STRUCTURE results of 150 samples when K=5

表4 群體間的Fst值(下三角)和P值(上三角)Tab.4 Fst value(lower triangle) and P value(upper triangle)

表5 5個種群間AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis of microsatellites among five cultured populations

3 討論

3.1 SSR位點多態(tài)性的意義

本研究開發(fā)了8個新的多態(tài)性微衛(wèi)星位點，用于分析廣東湛江、廣東惠州、廣東佛山、廣西南寧、浙江湖州5個地區(qū)不同養(yǎng)殖群體之間的遺傳關系。所有微衛(wèi)星Na數范圍在3～12，平均值為8.125，與金玲等[22]研究結果相似。I的數值范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。8個微衛(wèi)星位點都具有高水平的多態(tài)性(PIC>0.25)，而PIC、Ho、He能夠反映群體中個體的遺傳變異程度，其中PIC是衡量微衛(wèi)星多態(tài)性的一個指標，根據BOTSTEIN等[23]的方法界定衡量基因變異程度高低：當PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)位點；0.25

3.2 SSR位點在群體中的多態(tài)性

8個微衛(wèi)星位點在150個個體中的Na數在2～10之間變化，平均值為6.05，與甲殼動物Na較少的結論是一致的[24]。該結果與一些水生動物相似，如戴氏裸玉褶魚(Hypoptychusdybowskii)[25]和斑鱖(Sinipercascherzeri)[26]。在5個養(yǎng)殖群體中，平均Na及He分別為6.05和0.614，與BIAN等[27]關于紅螯螯蝦的結果相近。本實驗結果表明H0范圍在0.143～0.833，平均值為0.49，與澳洲野生紅螯螯蝦群體(H0：0.35～0.71)相比差距較小。而雜合度的高低在遺傳學中也代表著遺傳變異性的高低[28]，這也表明本研究采集的國內紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較豐富的遺傳多態(tài)性，而已有研究表明，國內養(yǎng)殖群體遺傳多樣性雖然保持著較高水平，但與澳洲野生紅螯螯蝦群體相比還是有些許下降[22]。

3.3 群體的遺傳分化與遺傳結構

Fis、AMOV、FCA和結構分析表明，大部分的變異來源于種群內部，只有小部分來源于種群間，這個結果和HE等[3]的研究相似。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大(0.107 7)。這些結果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，而種群內的差異很可能是因為人工選擇對于這些養(yǎng)殖群體的影響還不夠高[10]，或者是由于小規(guī)模養(yǎng)殖的遺傳漂變影響的結果。在本研究中有4個微衛(wèi)星位點偏離了哈迪溫伯格平衡，而在金玲等[22]的研究中10個位點有5個偏離了哈迪溫伯格平衡，這可能是存在無效等位基因從而導致雜合子缺失[29]。也可能是隨著紅螯螯蝦養(yǎng)殖發(fā)展，不可避免地會發(fā)生近交，而近親繁殖會使種群質量衰減、生產力下降[3]。

4 結論

本研究共鑒定8個多態(tài)多樣性良好的微衛(wèi)星位點。8個位點在150個樣本個體中共檢測出237個Na，平均為6.05，說明這些微衛(wèi)星位點可以用來檢測紅螯螯蝦的遺傳變異。Ho和He也保持著較高水平意味著所采集的國內紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較豐富的遺傳多態(tài)性。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大。這些結果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，表明這5個中國紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較高水平的遺傳多態(tài)性，雖然5個養(yǎng)殖群體都保持著較高的遺傳多態(tài)性，但結合過往研究，隨著累代養(yǎng)殖，紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體會不可避免發(fā)生近交，會對培育品種產生不良影響，也會導致國內紅螯螯蝦遺傳多樣性有下降的風險。而以上實驗數據可為后續(xù)定制科學合理的選育及保種的方法提供數據支持，這樣紅螯螯蝦產業(yè)才能夠持久健康發(fā)展。