劉 娟，袁林聰，楊劍虹，孔令富，李偉斌，白壽有，李進(jìn)榮，劉林江，尹馨玉，高 旭，王 婷，武祥偉

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 361021；2.玉溪市元江縣魚種技術(shù)推廣站，云南元江 653300；3.昆明水產(chǎn)科學(xué)研究所，昆明 650021)

鯉是鯉形目(Cypriniformes)鯉亞科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)魚類的總稱，具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、食性雜、生長快、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是亞洲、歐洲的重要淡水養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖年產(chǎn)量曾占全球淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的14%[1]。我國不僅養(yǎng)殖鯉的歷史超過2 000年，而且我國鯉種質(zhì)資源遠(yuǎn)較其他國家豐富，地方種多達(dá)23種，且云南分布的鯉屬魚類多達(dá)12種，是寶貴的鯉種質(zhì)資源基因庫[2-4]。元江鯉(Cyprinuscarpioyuankiang)主要分布于云南境內(nèi)的紅河水系，其生長快、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價(jià)值高，是云南鯉主養(yǎng)品種之一，已在云南多個(gè)地州進(jìn)行池塘與稻田養(yǎng)殖。元江鯉與荷包紅鯉(C.carpiovar.wuyuanensis)雜交育成建鯉(C.carpiovar.jian)[5]，成為全國養(yǎng)殖品種，為我國鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。

鯉云南地方種生境范圍狹窄，對原生境依賴性高；而本世紀(jì)以來云南引種、外來養(yǎng)殖品種逃逸等使得外來種在云南自然水體中肆意繁殖，不僅擠占了地方種的生境，還與地方種雜交導(dǎo)致基因漸滲與基因污染。上世紀(jì)80～90年代，多個(gè)云南基層漁業(yè)推廣與科研單位對云南特色土著魚類進(jìn)行了原種收集、人工繁殖、推廣養(yǎng)殖等，元江鯉即是其中一種[6]。但長期的人工保種，容易引起近親繁殖與種質(zhì)退化等問題[7，8]。本實(shí)驗(yàn)組前期以元江鯉保種群體為基礎(chǔ)群體，以體重為主要選育目標(biāo)，同時(shí)兼顧體型，連續(xù)進(jìn)行了3代群體選育，選育群體在生長速度、成活率等方面提升幅度達(dá)20%以上。為掌握元江鯉選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)變化趨勢，使后續(xù)育種策略制定和新品種的培育有科學(xué)依據(jù)，本研究首先使用元江鯉基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)了15個(gè)多態(tài)性高的微衛(wèi)星分子標(biāo)記(SSR)，以此為手段分析了元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代的遺傳多樣性水平與遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇與基因組DNA抽提

2018年從元江鯉保種群體中挑選體型標(biāo)準(zhǔn)、健康、體質(zhì)量大于2 kg的個(gè)體約500尾建立選育基礎(chǔ)群體，從中再選擇生長快、體型標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體100尾繁育F1代。采用群體選擇法，以生長為主要選育指標(biāo)兼顧體型，每一世代在5～6月齡與12～14月齡進(jìn)行兩次分選，選擇生長快、體型好、健壯無病的個(gè)體作為后備親本加以強(qiáng)化培育，并人工繁育下一代。每世代總選擇率為10%，至2022年獲得了3個(gè)連續(xù)世代群體(F1、F2、F3)。每個(gè)群體在性成熟后隨機(jī)選取30尾個(gè)體，剪取鰭條保存于95%乙醇中，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇法抽提基因組DNA[9]，經(jīng)核酸自動(dòng)分析儀檢測后稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)

使用GMATA 2.0程序[10]從元江鯉基因組重測序數(shù)據(jù)中查找SSR位點(diǎn)并設(shè)計(jì)PCR引物。根據(jù)多態(tài)性與擴(kuò)增效率隨機(jī)選取15個(gè)SSR位點(diǎn)用于基因型分析(表1)。

表1 元江鯉15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Tab.1 Information of 15 microsatellite loci of C.carpio yuankiang

1.3 PCR擴(kuò)增與電泳

PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中PCR mix(Takara，大連寶生物工程有限公司)7.7 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃或60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠方法電泳，電泳膠板經(jīng)固定、銀染、顯色[11]，統(tǒng)計(jì)SSR等位基因條帶數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用popgene32 v1.32軟件[12]分析3個(gè)群體的平均觀測等位基因數(shù)(Number of allele，Na)、平均有效等位基因數(shù)(Effective number of allele，Ne)、觀測雜合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity，He)、多態(tài)信息含量(Polymorphism information content，PIC)。使用FSTAT v2.9軟件[13]計(jì)算Nei′s遺傳距離(D)、近交系數(shù)(Fis)、群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)和哈代溫伯格平衡(HardyWeinberg equilibrium，HWE)的χ2檢驗(yàn)。根據(jù)Nei′s遺傳距離使用MEGA 10.1軟件包[14]構(gòu)建3個(gè)世代的UPGMA聚類樹。使用SPSS18.0軟件進(jìn)行生長數(shù)據(jù)分析，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)檢測選育群體與未選育群體間的生長差異；顯著水平均為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育世代生長性狀及群體遺傳多樣性

采用群體選育和選擇強(qiáng)度1.734進(jìn)行元江鯉選育，F(xiàn)1、F2與F3選育世代1齡個(gè)體平均體質(zhì)量分別為(1 749.85±191.57)、(1 953.54±179.72)、(2 264.75±164.83) g，顯著高于未選育群體平均體質(zhì)量(1 098.70±371.64) g，生長性狀的選育效果顯著。

15個(gè)SSR位點(diǎn)在3個(gè)連續(xù)選育世代群體共獲得116個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為7.73個(gè)/位點(diǎn)。隨著選育世代的增加，群體的遺傳多樣性逐漸降低。F1、F2、F3群體的平均多態(tài)信息含量分別為0.763 4、0.756 8、0.745 1，觀測雜合度分別為0.768 0、0.822 1、0.758 5，期望雜合度分別為0.804 3、0.800 2、0.728 3(表2)。Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗(yàn)顯示隨著選育世代的增加，偏離平衡的SSR位點(diǎn)數(shù)增多，F(xiàn)1、F2、F3群體極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)數(shù)分別為4、7、8個(gè)(表2)。

表2 元江鯉3個(gè)選育世代的遺傳多樣性及15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.2 Genetic diversity and Hardy-Weinberg equilibrium test of fifteen microsatellite loci in three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

2.2 SSR等位基因頻率變化

15個(gè)SSR位點(diǎn)在3個(gè)F1、F2、F3世代群體中檢測的等位基因頻率在0.0～0.7范圍內(nèi)；相比于F1與F2代，F(xiàn)3代中、高頻率(0.4～0.7)等位基因的比例增加(圖1)，包括YJL035、YJL040、YJL044、YJL045、YJL048、YJL065、YJL068、YJL072、YJL073、YJL075，表明人為選擇對群體產(chǎn)生了顯著影響。

圖1 元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代的15個(gè)SSR位點(diǎn)等位基因頻率分布圖Fig.1 Distribution of allele frequency of 15 SSR loci in three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)變化

F1與F2世代間Fst值為0.068 1，為中等分化(Fst<0.15)，而F2與F3世代間Fst值為0.023 0，為弱分化水平(Fst<0.05)，世代間遺傳分化逐代減小。3個(gè)群體的Fst均值為0.044 8(表3)，群體間的平均遺傳分化較小，大部分遺傳變異來自群體內(nèi)。3個(gè)群體的近交系數(shù)Fis平均值為-0.045 7，世代間雜合度小于個(gè)體間雜合度，遺傳變異程度減小。3個(gè)群體分別有6、10、9個(gè)SSR位點(diǎn)Fis值為負(fù)數(shù)(表4)，群體在這些位點(diǎn)上雜合度過剩，說明上述位點(diǎn)受到了選擇壓力，等位基因喪失速度加快。

表3 元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代間分化系數(shù)FstTab.3 Differentiation coefficient Fst of three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

表4 元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的F-分析Tab.4 F-statistics at 15 microsatellites for three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

2.4 世代間的遺傳相似性

元江鯉3個(gè)選育世代間的遺傳距離為0.080 6～0.169 1，世代間的遺傳距離減小，相似性增加，其中F2與F3世代間的遺傳距離最小為0.044 9，相似性最大為0.874 7(表5)。3個(gè)群體的UPGMA聚類樹顯示，F(xiàn)2與F3群體先聚為一支，最后與F1群體聚一支(圖2)，也表明世代間的遺傳相似性逐漸增加。

圖2 元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代基于Nei′s無偏遺傳距離的UPGMA聚類樹Fig.2 UPGMA dendrogram for three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

表5 元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代間的遺傳距離(對角線下方)和遺傳相似性Tab.5 Genetic distance(below diagonal) and genetic identity in three successive breeding generations of C.carpio yuankiang

3 討論

3.1 遺傳多樣性

生物的遺傳多樣性水平不僅決定環(huán)境適應(yīng)性，還決定群體的選育潛力[15，16]。長期多代選擇后群體常面臨稀有等位基因丟失、有害等位基因表達(dá)、經(jīng)濟(jì)性狀衰退等弊端，主要原因是群體遺傳多樣性降低。元江鯉連續(xù)三代選育后群體多態(tài)信息含量仍大于0.5，表明其仍具有較高水平的遺傳多樣性，該種情況與建鯉(C.carpiovar.jian)[17]、黃河鯉(C.carpiohaematopterus)[18]、黑龍江鯉(C.carpiohaematopterus)[19]、易捕鯉(C.carpiovar.yi)[20]、甌江彩鯉(C.carpiovar.color)[21]、華南鯉(C.carpiorubrofuscus)[22]等多個(gè)鯉魚選育群體的遺傳多樣性變化相似，元江鯉選育群體仍具有選育潛力。

觀測等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)反映群體遺傳變異的大小，兩者數(shù)值越接近表明群體中等位基因分布越均勻[23，24]。元江鯉連續(xù)3個(gè)選育世代的觀測等位基因數(shù)均大于有效等位基因數(shù)，表明等位基因分布不均，這是元江鯉經(jīng)歷多代定向選擇造成的。等位基因分布變化的程度可用觀測雜合度衡量，反映群體遺傳一致性的高低[25]。元江鯉3個(gè)連續(xù)選育世代的觀測雜合度低于元江鯉野生群體的觀測雜合度(0.776 5～0.803 7)[26]，與建鯉多個(gè)選育家系的觀測雜合度(0.725～0.883)[27]、華南鯉不同選育世代的觀測雜合度(0.713 5～0.794 3)相似[22]，大于黃河鯉選育群體的觀測雜合度(0.665)[28]。另一方面，與F1代相比F3代觀測雜合度僅減少了1.25%，顯著低于華南鯉與易捕鯉經(jīng)4代選育后觀測雜合度下降程度(11.23%與6.9%)[20，22]，并且元江鯉選育群體的多態(tài)信息含量也僅微弱減小，均表明元江鯉選育群體選育潛力較大。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳相似度

元江鯉F1～F3世代中極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)的SSR位點(diǎn)數(shù)逐代增加，選育群體的基因頻率發(fā)生了顯著改變，低頻(0.0～0.1)等位基因比例減少，中、高頻(0.1～0.7)等位基因比例增加，預(yù)示元江鯉選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。此外，元江鯉兩兩世代間的遺傳分化系數(shù)Fst值逐漸減小，F(xiàn)st平均值以及F2與F3代間的Fst值均小于0.05，并且小于華南鯉連續(xù)4代選育群體間的Fst值(0.081～0.051)，表明元江鯉選育世代間的遺傳分化水平逐代降低，定向選擇顯著提高了群體的遺傳相似度[29]。

魚類育種目標(biāo)之一是形成遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的群體，如“吉富”品系尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)經(jīng)9代選育后群體遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)分別為0.058 1～0.077 5和0.925 4～0.943 5[30]，華南鯉連續(xù)4代選育后群體遺傳距離為0.218 1～0.148 6，遺傳相似性為0.804 1～0.881 9[22]，元江鯉也具有相似的選育結(jié)果，經(jīng)過連續(xù)3代選育后群體遺傳距離逐漸減小、遺傳相似性逐漸增大，表明經(jīng)過3代選育后元江鯉群體遺傳結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，選擇效果顯著。