張穎，石婷瑞，曹瑞，潘文秋，宋衛(wèi)寧，王利，聶小軍

ICARDA引進(jìn)-小麥苗期抗旱性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

張穎1，石婷瑞1，曹瑞1，潘文秋1，宋衛(wèi)寧1，王利2，聶小軍1

1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物抗逆與高效生產(chǎn)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/養(yǎng)分資源高效利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

【目的】干旱是限制小麥生產(chǎn)最主要的逆境因子之一。挖掘、鑒定優(yōu)異抗旱新種質(zhì)、克隆抗旱新基因，以期豐富我國(guó)小麥抗旱遺傳基礎(chǔ)，為小麥抗旱遺傳改良提供材料?！痉椒ā恳?98份從國(guó)際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心（ICARDA）引進(jìn)的抗旱種質(zhì)為材料，采用PEG-6000模擬干旱方法，通過調(diào)查苗期干旱和正常條件下的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個(gè)性狀，鑒定、評(píng)價(jià)其抗旱性，結(jié)合660K SNP芯片對(duì)其抗旱性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘抗旱性相關(guān)染色體區(qū)間及關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，結(jié)合干旱脅迫下根等多組織的表達(dá)量數(shù)據(jù)，篩選抗旱性相關(guān)基因，最后以強(qiáng)抗旱性品系IR214和干旱敏感品系IR36為材料，利用qRT-PCR方法對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，并分析關(guān)鍵候選基因的優(yōu)異單倍型?！窘Y(jié)果】干旱脅迫下，小麥的生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著抑制，各性狀表型均顯著低于正常對(duì)照，不同小麥品系間也表現(xiàn)出顯著差異，4個(gè)性狀在2種處理下均呈現(xiàn)正態(tài)分布，變異系數(shù)為0.363—0.760，多樣性指數(shù)為0.310—0.400；基于加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）綜合評(píng)價(jià)各個(gè)品種的抗旱性，發(fā)現(xiàn)品系IR214的值最大，為0.851，其次為IR92、IR213、IR235和IR218等，它們可作為新的優(yōu)異抗旱種質(zhì)；在此基礎(chǔ)上，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），共檢測(cè)到102個(gè)與4個(gè)性狀抗旱系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，表型變異解釋率范圍為1.07%—38.70%，其中，與地上部鮮重相關(guān)的位點(diǎn)60個(gè)、地下部鮮重相關(guān)位點(diǎn)1個(gè)、生物量相關(guān)位點(diǎn)36個(gè)以及根冠比相關(guān)位點(diǎn)5個(gè)；基于基因組注釋信息，篩選到31個(gè)抗旱相關(guān)基因，結(jié)合根等不同組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出4個(gè)抗旱候選基因，對(duì)差異表達(dá)的候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，鑒定到2個(gè)關(guān)鍵抗旱候選基因；最后，分析候選基因的單倍型效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)的AX-86174509位點(diǎn)，2種基因型在抗旱性狀上具有顯著差異，是潛在的功能位點(diǎn)?！窘Y(jié)論】共檢測(cè)到102個(gè)與苗期抗旱性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，篩選出和2個(gè)關(guān)鍵候選基因，的AX-86174509位點(diǎn)是潛在的抗旱性功能位點(diǎn)。

小麥；干旱脅迫；660K SNP芯片；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥（L.）是世界三大糧食作物之一，其種植面積約占全世界總耕作面積的17%，是全球近30%人口的主糧[1]。在我國(guó)，小麥也是最重要的糧食作物之一，常年種植面積約2 400萬hm2，年產(chǎn)量超過1億t[2]。小麥的持續(xù)增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)乃至全世界糧食安全有著舉足輕重的影響。隨著全球氣候變化，極端天氣日益頻發(fā)，水資源短缺、降雨不均、季節(jié)性干旱等問題日趨嚴(yán)峻。干旱已成為限制小麥生產(chǎn)最重要的逆境因子。干旱抑制小麥的生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致小麥株高減小、葉片失水、氣孔關(guān)閉、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度下降、葉面積減小，從而引起減產(chǎn)[3]。同時(shí)，干旱還會(huì)干擾小麥的生理和代謝過程，使其更容易受到病蟲害的侵害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因干旱而造成的小麥產(chǎn)量損失超過其他逆境和病蟲草害的總和[4]。苗期是小麥生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，通過影響器官形態(tài)建成來影響整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。干旱脅迫下，小麥幼苗的許多形態(tài)和生理特征發(fā)生改變，包括葉片變小、根長(zhǎng)縮短和滲透勢(shì)降低等[5]。同時(shí)，干旱也會(huì)影響小麥地上部與地下部生物量[6-7]。生物量一直是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)之一[8]。干旱脅迫下植物的根冠比會(huì)升高[9]，高根冠比的小麥可以吸收深層土壤水分，從而保證較高的蒸騰效率以適應(yīng)干旱脅迫[10]。因此，系統(tǒng)解析小麥苗期抗旱性的遺傳基礎(chǔ)，鑒定、發(fā)掘優(yōu)異苗期抗旱新基因，對(duì)小麥抗旱遺傳改良、保障糧食安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及諸多基因和多種機(jī)制的協(xié)同作用。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，通過群體分析，在全基因組水平上鑒定與性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記或基因的研究策略，為數(shù)量性狀基因挖掘和復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)解析提供了不可或缺的重要方法[11]。前人圍繞小麥苗期抗旱性的GWAS分析和遺傳基礎(chǔ)解析已開展了大量工作。Maulana等[12]以200個(gè)代表性的冬小麥品系組成的自然群體為材料，基于90K SNP芯片的全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定了12個(gè)穩(wěn)定的苗期抗旱性相關(guān)SNP位點(diǎn)，分別位于1B、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4B、5A、5B、6B和7B染色體。王博華等[13]利用90K SNP芯片對(duì)300份國(guó)內(nèi)外小麥品種（系）基于最長(zhǎng)根長(zhǎng)、根總長(zhǎng)、根表面積、根體積、根平均直徑、根尖數(shù)、根鮮重和根干重等8個(gè)性狀的苗期抗旱系數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定到41個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并篩選到11個(gè)與小麥抗旱性相關(guān)的候選基因。同時(shí)，基于GWAS分析等正向遺傳學(xué)分析，多個(gè)小麥抗旱關(guān)鍵基因也被鑒定和克隆，包括[14]、[15]、[16]等。【本研究切入點(diǎn)】盡管前人已對(duì)小麥抗旱性相關(guān)位點(diǎn)及其候選基因發(fā)掘開展了較多研究，但我國(guó)小麥遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，基因同質(zhì)化較高，迫切需要加強(qiáng)新抗旱種質(zhì)和基因的發(fā)掘和利用，以豐富我國(guó)小麥抗旱基因資源、擴(kuò)寬遺傳基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以引自國(guó)際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心的198份優(yōu)異抗旱小麥品種（系）為材料，利用PEG600模擬干旱方法，調(diào)查、統(tǒng)計(jì)其苗期地上部鮮重、地下部鮮重、生物量、根冠比等4個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)其抗旱性，篩選優(yōu)異抗旱種質(zhì)；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合660K SNP芯片進(jìn)行苗期抗旱性的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘新的小麥苗期抗旱性相關(guān)SNP位點(diǎn)，鑒定其候選基因，以期為小麥抗旱遺傳改良奠定材料基礎(chǔ)，為其分子設(shè)計(jì)育種提供有用標(biāo)記信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為198份小麥品種與育種中間材料組成的關(guān)聯(lián)分析群體，由西北農(nóng)林科技大學(xué)宋衛(wèi)寧教授從國(guó)際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心的種質(zhì)基因庫(kù)引進(jìn)，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物基因組學(xué)課題組保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及表型調(diào)查

2020年3月中旬，于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室進(jìn)行室內(nèi)水培試驗(yàn)，試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，首先，選取大小均勻一致、籽粒完整飽滿的種子30粒，用75%乙醇浸泡3 min，再用2%次氯酸鈉消毒3次，隨后用雙蒸水沖洗3—5次，洗去種子表面殘留的次氯酸鈉，將種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待其露白，長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)，選取大小長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至水培容器中，每個(gè)水培盆種24個(gè)品種，每個(gè)品種種植6株，設(shè)置對(duì)照組和處理組，3次生物學(xué)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每個(gè)容器加20 ml Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，利用氧氣泵通氣，每3天更換一次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí)，加入PEG6000進(jìn)行模擬干旱脅迫，在干旱處理時(shí)，濃度隨時(shí)間逐級(jí)遞加至最終濃度為19.2%，脅迫處理21 d后進(jìn)行表型調(diào)查。同時(shí)，以未添加PEG6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作對(duì)照處理。

表型調(diào)查指標(biāo)包括地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比，具體方法為收獲正常和干旱處理植株的地上部和地下部，采用分析天平稱量鮮重，生物量為地上部與地下部鮮重之和，根冠比為地下部鮮重與地上部鮮重的比值。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用Excel對(duì)地上部分鮮重、地下部分鮮重、生物量和根冠比的觀測(cè)值進(jìn)行整理，并計(jì)算每個(gè)材料的抗旱系數(shù)。利用隸屬函數(shù)法將每個(gè)指標(biāo)的抗旱系數(shù)轉(zhuǎn)換為隸屬函數(shù)值。為了確定每個(gè)指標(biāo)在計(jì)算抗旱系數(shù)中的權(quán)重，將每個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)與其他指標(biāo)的變異系數(shù)進(jìn)行比較，并計(jì)算其占比作為權(quán)重。最后，計(jì)算每個(gè)材料在各重復(fù)下的加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）[17]。

抗旱系數(shù)=干旱脅迫測(cè)定值/對(duì)照處理測(cè)定值

(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X為各供試材料基于鑒定指標(biāo)的抗旱系數(shù)，Xmax、Xmin分別為供試材料中X的最大值和最小值，(X)為各供試材料X的隸屬函數(shù)值，CV為各供試材料(X)的變異系數(shù)，W表示CV在總變異中所占比率。

1.4 基因型測(cè)序分型

從實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)中提取198份引進(jìn)材料的660K SNP芯片基因分型信息[18]。對(duì)獲得的198份材料的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，以缺失率（miss）＜0.2、最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05為標(biāo)準(zhǔn)過濾篩選，最終得到319 800個(gè)高質(zhì)量的SNP標(biāo)記位點(diǎn)用于后續(xù)分析。采用Power Marker V3.25軟件分析參試材料的遺傳多樣性和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，），=1-∑(P)2（P表示位點(diǎn)的第個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率）。利用Admixture 1.3.0軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置K=1—10，每個(gè)K值重復(fù)5次；利用PopLDdecay軟件計(jì)算其衰減距離（linkage disequilibrium，LD）。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于篩選獲得的高質(zhì)量SNP標(biāo)記，以198份小麥品種4個(gè)指標(biāo)計(jì)算的抗旱系數(shù)為表型，利用TASSEL v5.0軟件中的MLM混合線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，顯著關(guān)聯(lián)閾值估計(jì)為＜0.01/N，N為有效SNP個(gè)數(shù)，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性，利用R語言繪制關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的曼哈頓圖和Q-Q圖。

1.6 候選基因篩選

根據(jù)從Ensemble plants數(shù)據(jù)庫(kù)（http://plants.ensembl.org/index. html）下載基因注釋信息，結(jié)合LD區(qū)間，篩選候選基因。從SRA公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載中國(guó)春小麥干旱脅迫下根、葉、冠、孕穗期、開花、籽粒形成和花藥分化等多個(gè)組織和階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA369686），使用fastp v0.21.0去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，由HISAT2 v2.1.0將序列比對(duì)至中國(guó)春參考基因組（IWGSCv2.1），利用samtools v1.3.1進(jìn)行排序并構(gòu)建索引，由stringtie v2.1.4組裝轉(zhuǎn)錄本，并統(tǒng)計(jì)基因豐度表達(dá)，使用R包DESeq2 v1.31.0進(jìn)行差異基因分析，選取顯著差異表達(dá)的基因?yàn)樽魑锟购敌院蜻x基因（差異倍數(shù)＞2且＜0.05）。為驗(yàn)證關(guān)鍵候選基因，以抗旱性最強(qiáng)的IR214和干旱最敏感的IR36為材料，收集其在對(duì)照和20% PEG條件下分別處理0、6、12、24和48 h的葉片樣本，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，對(duì)關(guān)鍵候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)驗(yàn)證后的關(guān)鍵候選基因中與干旱耐受性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)將供試材料分為2類（僅選擇純合基因型），并使用檢驗(yàn)分析基因型對(duì)表型的效應(yīng)。使用R包ggplot2 v3.4.1繪制箱線圖。

2 結(jié)果

2.1 ICARDA小麥苗期抗旱性的鑒定

通過調(diào)查和比較198份引進(jìn)小麥種質(zhì)在PEG6000模擬干旱和正常對(duì)照條件下的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個(gè)性狀（圖1-A—D，附表1），發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會(huì)顯著抑制小麥的生長(zhǎng)發(fā)育、降低苗期生物量。正常條件下的地上部鮮重為0.216—3.029 g，而干旱脅迫下的地上部鮮重為0.187—2.495 g；正常和干旱脅迫下的地下部鮮重分別為0.118—1.368 g和0.116—1.114 g，正常和干旱脅迫下的生物量分別為0.389—4.397 g和0.303—3.608 g。與正常條件相比，干旱處理導(dǎo)致所有品系的根冠比增加，正常條件下的根冠比為0.271—0.917，而干旱脅迫下其變異范圍為0.357—1.512。各個(gè)性狀均表現(xiàn)出較大的變異，變異系數(shù)為0.363—0.760，表明該群體具有豐富的遺傳變異和遺傳多樣性。相關(guān)性分析表明，地上部鮮重與地下部鮮重、生物量存在較強(qiáng)的相關(guān)性，且表現(xiàn)為正相關(guān)，地上部鮮重與根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)，地下部鮮重與根冠比存在顯著正相關(guān)，生物量與根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)。其中，地上部鮮重與生物量相關(guān)性最高（=0.940）。使用地上部鮮重抗旱系數(shù)、地下部鮮重抗旱系數(shù)、生物量抗旱系數(shù)和根冠比抗旱系數(shù)的加權(quán)隸屬函數(shù)值（值）綜合評(píng)價(jià)各個(gè)品種的抗旱性，鑒定到5個(gè)優(yōu)異的強(qiáng)抗旱種質(zhì)，其中品系IR214的值最大，為0.851，其次為IR92、IR213、IR235和IR218等。

2.2 SNP多態(tài)性及分布

根據(jù)小麥660K SNP芯片的基因分型并進(jìn)行質(zhì)控，篩選出可供后續(xù)關(guān)聯(lián)分析用的高質(zhì)量位點(diǎn)319 800個(gè)，A、B和D亞基因組上的SNP數(shù)目分別為122 213（38.21%）、152 155（47.58%）和37 828（11.83%），其中，A、B亞基因組的多態(tài)性基本相同，但D亞基因組的多態(tài)性遠(yuǎn)低于A和B（表1）。21條染色體中，3B染色體上的SNP標(biāo)記數(shù)目最多（40 010個(gè)），4D染色體上的SNP標(biāo)記數(shù)目最少（1 954個(gè)）。3個(gè)染色體組的表現(xiàn)為A（0.374）＞B（0.368）＞D（0.354）。

2.3 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

基于SNP變異位點(diǎn)的群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在類群值K=9時(shí)，值最小，為0.506，表明參試材料可分成9個(gè)類群（圖2），其中，亞群3含有71個(gè)材料，是最大的類群，亞群4和亞群7材料個(gè)數(shù)最少，只有2個(gè)；亞群8和亞群9材料個(gè)數(shù)相近，分別有27和24個(gè)，而亞群5和亞群6分別含有13和15個(gè)。基于PopLDdecay，對(duì)198份小麥材料的LD衰減距離進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)A、B、D亞基因組的LD區(qū)間大小分別為4、5和3 Mb。

A—D：分別為正常條件與干旱脅迫下198份小麥的地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RSW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）性狀的頻率分布及比較；E：干旱脅迫對(duì)小麥品種（系）的抑制情況；F：地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個(gè)指標(biāo)的抗旱系數(shù)的加權(quán)隸屬函數(shù)值（D值）的頻率分布和相關(guān)性矩陣。***代表P＜0.001的極顯著差異。下同

A：群體分群K值的交叉驗(yàn)證；B：群體各樣品的親緣關(guān)系

表1 SNP標(biāo)記的分布、物理圖譜長(zhǎng)度以及其多態(tài)性

2.4 干旱脅迫下小麥苗期生物量全基因組關(guān)聯(lián)分析

通過對(duì)4個(gè)性狀指標(biāo)計(jì)算的抗旱系數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共定位到102個(gè)與苗期抗旱相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布于所有21條染色體上，表型變異解釋率（）范圍為1.07%—38.70%（表2和圖3）。與地上部鮮重顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有60個(gè)，主要分布于3B、5B、4A、7A等染色體，其中有10個(gè)位點(diǎn)分布在3B染色體，范圍為1.89%—34.66%；與地下部鮮重顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)僅有1個(gè)，為15.83%，位于4A染色體；與生物量顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記共36個(gè)，大部分分布在B亞基因組上（52.8%），其中在5B染色體上分布最多，有7個(gè)標(biāo)記，范圍為2.57%—13.78%；共有5個(gè)標(biāo)記與根冠比顯著關(guān)聯(lián)，其中，2個(gè)位于5B、3個(gè)位于7A，范圍為2.23%—10.59%。

2.5 抗旱性相關(guān)候選基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

根據(jù)上述鑒定的抗旱性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，結(jié)合亞基因組LD區(qū)間及中國(guó)春參考基因組注釋信息，共預(yù)測(cè)8 042個(gè)候選基因，其中，A亞基因組3 387個(gè)，B亞基因組3 229個(gè)，D亞基因組1 426個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有31個(gè)顯著位點(diǎn)位于基因內(nèi)部，包括8個(gè)與生物量相關(guān)的候選基因，20個(gè)與地上部鮮重相關(guān)的候選基因，這些基因可作為潛在的重要候選基因（表3）。功能注釋發(fā)現(xiàn)，它們主要參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白修飾、氧化還原、催化反應(yīng)等生物學(xué)過程。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中小麥干旱脅迫下的根、葉和莖稈的RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)31個(gè)重要候選基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)、、和等4個(gè)基因，在干旱處理下的根中相比于對(duì)照顯著差異表達(dá)（圖4-A），其中，和顯著下調(diào)表達(dá)，而和顯著上調(diào)表達(dá)。預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)含有1個(gè)Pyr_redox結(jié)構(gòu)域，含有SCAB等4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，僅含有Crr6結(jié)構(gòu)域，含有UPF0261和PEP_hydrolase 2個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖4-B），推測(cè)它們可能是參與調(diào)控小麥抗旱性的重要候選基因。

表2 苗期抗旱相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)及其表型貢獻(xiàn)率

SFW：地上部鮮重；RFW：地下部鮮重；BIO：生物量；RSR：根冠比。下同

SFW: Shoot fresh weight; RFW: Root fresh weight; BIO: biomass; RSR: Root-shoot ratio. The same as below

A：地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）曼哈頓圖；Un：未知染色體；B：地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）QQ圖

表3 抗旱性相關(guān)候選基因的預(yù)測(cè)

最后，對(duì)篩選到的4個(gè)抗旱性重要候選基因的表達(dá)特性進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在抗旱品系中表達(dá)量呈先降低再升高的趨勢(shì)，在干旱脅迫6 h時(shí)的表達(dá)量值最低、48 h時(shí)最高，而在敏感品系中，其表達(dá)呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在干旱脅迫6 h時(shí)表達(dá)量最高、48 h時(shí)的表達(dá)量最高（圖5-A）。同時(shí)，在干旱脅迫下也顯著差異表達(dá)，且在抗旱和旱敏感材料表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式（圖5-B），而其他2個(gè)候選基因在干旱脅迫差異不顯著，暗示和是抗旱性關(guān)鍵候選基因。

A：候選基因的表達(dá)量；DR：干旱處理?xiàng)l件下的根，CR：對(duì)照處理?xiàng)l件下的根，DL：干旱處理?xiàng)l件下的葉，CL：對(duì)照處理?xiàng)l件下的葉，DC：干旱處理?xiàng)l件下的莖干，CC：對(duì)照處理?xiàng)l件下的莖干。B：關(guān)鍵基因的蛋白結(jié)構(gòu)域

2.6 抗旱性關(guān)鍵候選基因的單倍型分析

通過對(duì)和2個(gè)關(guān)鍵候選基因的單倍型進(jìn)行分析（圖6）。發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在供試材料中均存在2種單倍型，但的2個(gè)單倍型在4個(gè)性狀的抗旱系數(shù)上均沒有顯著差異；而的AX-86174509位點(diǎn)2種基因型在生物量和地上部鮮重抗旱系數(shù)上存在顯著差異，其中，有112個(gè)材料的基因型為C，86個(gè)材料的基因型為A，其中A基因型抗旱性顯著高于C基因型，是抗旱性相關(guān)優(yōu)異等位變異。

圖5 基于qRT-PCR分析的抗旱性關(guān)鍵候選基因的表達(dá)模式分析

*代表P＜0.05的顯著差異

3 討論

3.1 小麥苗期抗旱性的鑒定

苗期是小麥生育期中形態(tài)和器官建成的關(guān)鍵階段，小麥苗期形態(tài)建成對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育后期起重要作用，并最終影響產(chǎn)量，所以苗期被認(rèn)為是干旱脅迫的關(guān)鍵階段[20]。干旱脅迫下，植株生物量、葉綠素含量、根冠比均受到了影響[21]。本研究中，198份小麥品系的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量含量與正常處理相比均呈下降趨勢(shì)，表明在PEG滲透脅迫下，小麥為吸收水分使水勢(shì)降低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)礁繙p少，進(jìn)而影響地上部分正常的生長(zhǎng)發(fā)育，出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻情況，此時(shí)生物量、地上部鮮重、地下部鮮重等下降。在干旱脅迫下，根冠比的干旱系數(shù)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，可能是在干旱環(huán)境中，植物面臨水分的限制和脅迫，為了增加水分吸收能力和減少水分蒸散。通過增加根冠比，植物可以增加根系的生長(zhǎng)和發(fā)育，提高水分吸收能力。根冠比的升高可以幫助植物在干旱條件下更有效地利用有限的水分資源，從而增強(qiáng)其抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)地上部鮮重與地下部鮮重、生物量顯著正相關(guān)，地上部鮮重與根冠比呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，地下部鮮重與根冠比呈顯著正相關(guān)，而生物量與根冠比呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，表明這些性狀之間可能發(fā)揮互促作用，對(duì)干旱脅迫下的小麥生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫誘導(dǎo)大豆幼苗對(duì)地上部分生物量的抑制作用增加，進(jìn)而導(dǎo)致根冠比增加，從而影響生理代謝過程，以抵抗或降低干旱脅迫造成的危害[22]。本研究通過正常和干旱脅迫條件下測(cè)定指標(biāo)的抗旱系數(shù)以及各個(gè)抗旱系數(shù)組成的加權(quán)隸屬函數(shù)值值來評(píng)價(jià)小麥對(duì)干旱的耐受性[23]，可反映不同材料的綜合耐性。本研究供試材料存在廣泛的表型變異，根據(jù)耐受性值，鑒定發(fā)掘了IR214、IR92、IR213、IR235和IR218共5個(gè)干旱耐受性強(qiáng)的小麥材料，為抗旱小麥遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新奠定了材料基礎(chǔ)。

3.2 小麥苗期抗旱性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

隨著高通量測(cè)序和基因芯片技術(shù)的快速發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析成為一種快速簡(jiǎn)便分析復(fù)雜性狀遺傳變異的方法，在動(dòng)植物中廣泛應(yīng)用[24]?；旌暇€性模型是全基因組關(guān)聯(lián)分析中降低假陽(yáng)性的最好方法之一[25]。本研究采用MLM混合線性模型對(duì)198份供試材料的小麥苗期各干旱性狀的抗旱系數(shù)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到102個(gè)與基于不同生物量性狀的抗旱系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，其中49個(gè)位點(diǎn)在B亞基因組，40個(gè)位點(diǎn)在A亞基因組，剩下的13個(gè)在D亞基因組，表明B亞基因組攜帶了較多的抗旱相關(guān)位點(diǎn)。VosS-Fels等[26]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了多個(gè)與小麥地上部和地下部生物量相關(guān)位點(diǎn)，其中在5B染色體鑒定到一個(gè)主效位點(diǎn)可顯著促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從而提高了根系生物量。BEYER等[27]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在1A、2A、3B、5B、6A和7B染色體上鑒定多個(gè)與小麥根系生物量顯著相關(guān)的位點(diǎn)。本研究鑒定發(fā)掘的多個(gè)位點(diǎn)與前人發(fā)掘的根系生物量位點(diǎn)相近，表明本結(jié)果的可靠性。此外，鑒定發(fā)掘的這些位點(diǎn)既與小麥根部生物量相關(guān)，同時(shí)也與小麥苗期抗旱性相關(guān)，它們可能通過控制小麥根系發(fā)育進(jìn)而參與對(duì)干旱的響應(yīng)[28]，這為進(jìn)一步挖掘和鑒定同時(shí)調(diào)控根系發(fā)育和抗旱性的多效性基因奠定了基礎(chǔ)。

3.3 抗旱候選基因的預(yù)測(cè)與篩選

本研究通過GWAS分析初步篩選到31個(gè)潛在的小麥抗旱性候選基因，基于表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選出、、和0等 4個(gè)重要候選基因。位于1A染色體，是一種二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD），是植物中重要的抗氧化酶之一。研究發(fā)現(xiàn)線粒體二氫硫辛酰胺脫氫酶是參與三羧酸循環(huán)、光呼吸和支鏈α酮酸降解的幾種多酶系統(tǒng)的組成部分，在擬南芥中過表達(dá)可以改善光合作用，進(jìn)而改善生物量的積累[29]。5B染色體上的是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，與細(xì)胞膜構(gòu)成相關(guān)，同時(shí)可參與調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)，含有與SCAB1相似的結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)氣孔閉合相關(guān)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1（stomatal closure-related actin binding protein1，SCAB1）與磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-monophosphate，PI3P）特異性結(jié)合，可以通過抑制SCAB1的寡聚化來參與調(diào)節(jié)擬南芥氣孔閉合[30]。在干旱條件下，植物通過調(diào)節(jié)氣孔的開閉來限制蒸騰作用，減少水分的流失，提高水分利用效率來增強(qiáng)抗旱性。位于7B染色體，具有催化酶活性，含有PEP_hydrolase蛋白，參與磷酸烯醇丙酮酸代謝途徑。在煙草中研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下煙葉中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶含量顯著增加，參與到了煙葉干旱應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)[31]。Caruso等[32]研究了干旱和高溫條件下小麥幼苗的蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)了12種上調(diào)和24種下調(diào)蛋白，它們主要參與糖酵解、活性氧去除、氨基酸合成和卡爾文循環(huán)。研究表明，抗旱性與小麥中蛋白質(zhì)的表達(dá)之間存在非常密切的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)含玉米CPEPC的轉(zhuǎn)基因小麥植株具有更高的抗旱性[33]。含有Crr6蛋白結(jié)構(gòu)域，前人研究發(fā)現(xiàn)Crr6蛋白在植物光合作用中起重要作用，通過影響在葉綠體中的組裝來影響植物的光合作用[34]。最后，基于qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果，證實(shí)和是抗旱性關(guān)鍵候選基因，且顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)AX-86174509的2種單倍型在生物量和地上部分鮮重兩個(gè)性狀的抗旱性上存在顯著差異，可能是與抗旱性狀相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)，這為進(jìn)一步深入探究不同基因型對(duì)抗旱性的影響及其潛在分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過苗期抗旱性鑒定，發(fā)掘了5個(gè)強(qiáng)抗旱種質(zhì)?；?60K SNP芯片的全基因關(guān)聯(lián)分析，獲得102個(gè)與抗旱性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，預(yù)測(cè)到31個(gè)重要候選基因，它們主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白修飾、氧化還原等過程，從而調(diào)節(jié)小麥的抗旱性。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析，篩選到和2個(gè)關(guān)鍵候選基因，其中，的2種單倍型在生物量和地上部分鮮重的抗旱系數(shù)上存在顯著差異，是抗旱性相關(guān)功能位點(diǎn)。

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Genome-wide association study of drought tolerance at seedling stage in ICARDA-introduced wheat

ZHANG Ying1, SHI TingRui1, CAO Rui1, PAN WenQiu1, SONG WeiNing1,WANG Li2, NIE XiaoJun1

1College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Nutrient Use and Management, Ji’nan 250100

【Objective】Drought is one of the most destructive environmental stresses limiting wheat production. The novel germplasm with excellent drought tolerance as well as their candidate loci were identified and characterized to enrich the genetic basis of drought tolerance and lay a material foundation for wheat genetic improvement in China. 【Method】In this study, the drought tolerance of 198 wheat accessions introduced from International Dry Area Agriculture Research (ICARDA) were investigated at seedling stage through hydroponic method with PEG6000 simulating drought. Drought tolerance index (DTI) was calculated using the shoot fresh weight, root fresh weight, total biomass and root-shoot ratio, respectively. Genome-wide association analysis was performed using 660K SNP array genotyping to obtain the SNP loci and chromosome regions associating with drought tolerance index. Combined with the expression patterns in root and other tissues, the potential candidate genes were identified, and then they were further verified by qRT-PCR approach with the most drought-tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials. Finally, the excellent haplotypes of key candidate genes were analyzed. 【Result】Compared to normal control condition, the growth and development of wheat were significantly impaired under drought treatment. There were also significant phenotypic variations among different accessions with all of the four traits displayed normal distribution. The coefficient of variation ranged from 0.363 to 0.760 with genetic diversity from 0.310 to 0.400. Using the weighted membership function value (value), the drought tolerance of these accessions was evaluated. Results showed that accession IR214 had the highestvalue with 0.851, followed by IR92, IR213, IR235, and IR218, which could be considered as the novel excellent drought-tolerance germplasm. Furthermore, through genome-wide association study (GWAS) analysis, a total of 102 loci were significantly associated with the DTI values based on these four traits, with the phenotypic variation explained value () from 1.07% to 38.70%, of which 60 loci were associated with above-ground fresh weight, 1 locus associated with underground fresh weight, 36 loci associated with biomass and the remaining 5 loci associated with root-shoot ratio. Then, 31 candidate genes were predicated based on genomic annotation information and LD block. Combined with the expression patterns of them in roots and other tissues, 4 candidates displaying differential expression between CK and drought conditions were obtained. Finally, the expression levels of these 4 candidates were further verified by qRT-PCR method with the most drought- tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials to obtain two key candidates associating with drought tolerance. Additionally, their haplotype effects were investigated. It was found that the different genotypes of AX-86174509 locus ingene showed significant differences in drought tolerance, which might be considered as a causal locus.【Conclusion】Totally, 102 loci and 2 key candidate genes (and) underlying drought tolerance at seedling stage were detected in ICARDA-introduced wheat, and AX-86174509 inwas a potential functional locus.

wheat; drought stress; 660K SNP array; genome-wide association analysis; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.004

2023-07-12；

2023-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（U22A20457）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1900190）

張穎，E-mail：yingz99040001@gmail.com。通信作者王利，E-mail：wangli2630000@hotmail.com。通信作者聶小軍，E-mail：small@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）