楊瑞霞 何亞州 郭雨西 唐孝 張安東

基金項目?廣西壯族自治區(qū)教育廳廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（No.2020KY07018）；廣西中醫(yī)藥大學校級課題（No.019MS038）

作者單位?廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院（南寧 ?530201）

通訊作者?何亞州，E-mail：hezhouzhou888@foxmail.com

引用信息?楊瑞霞，何亞州，郭雨西，等.溫陽貼貼敷涌泉穴對慢性心力衰竭病人血清UCP2、外泌體及外泌體內(nèi)miR-320水平的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（7）：1287-1291.

摘要?目的：探討溫陽貼貼敷涌泉穴對慢性心力衰竭（CHF）病人解偶聯(lián)蛋白-2（UCP2）、血清外泌體及外泌體內(nèi)miR-320水平的影響，挖掘其作用機制。方法：選取60例CHF病人，隨機分為對照組、電針組、穴位貼敷組，每組20例。對照組以西藥治療，電針組、穴位貼敷組分別在西藥治療的基礎(chǔ)上加用電針、溫陽貼刺激涌泉穴。試劑盒法提取血清外泌體，免疫印跡（Western Blot）法檢測CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白表達， 納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測徑粒大小。使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測病人血清中UCP2、氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）表達水平及外泌體分泌量，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測外泌體內(nèi)miR-320水平。對NT-proBNP、UCP2、外泌體分泌量、miR-320進行相關(guān)性分析。結(jié)果：CD63、CD81、TSG101、Alix蛋白陽性表達，NTA徑粒分析顯示符合外泌體徑粒大小。穴位貼敷組NT-proBNP、UCP2、miR-320表達水平高于電針組與對照組（P＜0.05）；穴位貼敷組外泌體分泌量高于電針組與對照組（P＜0.05）。NT-proBNP與UCP2、miR-320呈正相關(guān)（P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關(guān)（P＜0.01）；UCP2與miR-320呈正相關(guān)（P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關(guān)（P＜0.01）；外泌體分泌量與miR-320呈負相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論：溫陽貼的治療CHF的機制可能與外泌體、miR-320的調(diào)控以及UCP2介導(dǎo)的心肌能量代謝相關(guān)。

關(guān)鍵詞?慢性心力衰竭；溫陽貼；涌泉穴；解偶聯(lián)蛋白-2；外泌體；miR-320

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.023

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是臨床上多種心血管疾病的最終轉(zhuǎn)歸，隨著時代的發(fā)展、科技的進步，臨床中對CHF的治療手段不斷得到豐富，但其居高不下的發(fā)病率及再住院率給個人及社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔，也給病人及家屬帶來了極大的精神壓力，為此迫切需要探尋一種新的治療模式，以期降低CHF病人發(fā)病率，改善病人生活質(zhì)量［1］。CHF在中醫(yī)學中屬“水腫”“喘證”等范疇，病機多為機體陰陽失調(diào)，心陽不振致水飲凌心，痰結(jié)、血瘀、水飲為標，素體陽虛為根本，治療上多予溫補心陽、利水養(yǎng)心為法。在現(xiàn)有的治療模式中，主要有西藥結(jié)合中藥湯劑、針灸、穴位貼敷等治療方法，其中，穴位貼敷法以其良好的療效及簡便的操作在CHF的中西醫(yī)結(jié)合臨床診療中占據(jù)重要的位置。本課題組前期研究表明，CHF病人miR-320水平明顯升高，且這些microRNA主要來源于外泌體中，miR-320水平的上調(diào)，加重了心肌纖維化，影響了CHF的發(fā)展過程［2］。同時，本課題組通過前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，使用溫陽貼貼敷涌泉穴，能有效改善病人癥狀及心功能情況，但潛在機制尚不明確，故本研究以溫陽貼貼敷CHF病人側(cè)涌泉穴，探討其對CHF病人解偶聯(lián)蛋白-2（uncoupling protein 2，UCP2）、血清外泌體及外泌體內(nèi)含miR-320水平的影響，進一步分析溫陽貼對CHF的作用及治療機制。

1?資料與方法

1.1?臨床資料

參照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［1］及《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》中的診斷標準，選取2020年6月—12月在我院住院治療的CHF（陽虛型）病人60例，隨機分為對照組、電針組與穴位貼敷組，各20例。本研究經(jīng)廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審核批準，同時已詳細告知病人本研究的研究目的、方法及相關(guān)事項，病人表示同意，并簽署臨床科研項目受試者知情同意書。

1.2?治療方法

對照組：依照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》［1］，在一般治療基礎(chǔ)上，給予CHF常規(guī)西藥治療，不使用任何中壯藥、中成藥、中藥針劑等中壯醫(yī)治療措施。電針組：在對照組治療的基礎(chǔ)上加用電針刺激雙側(cè)涌泉穴。操作如下：病人取仰臥位，常規(guī)消毒雙足底皮膚后將理療電極片貼敷于涌泉穴，連接電針儀并調(diào)節(jié)刺激強度至病人能耐受為度，治療時間為30 min，每日1次，每周5次。穴位貼敷組：在對照組治療基礎(chǔ)上加用溫陽貼貼敷雙側(cè)涌泉穴，操作如下：以等量的黃芪、艾草、肉桂藥粉以姜汁調(diào)和成糊狀，取適量攤于無菌敷貼內(nèi)側(cè)面，常規(guī)消毒病人雙足底皮膚后，貼敷于病人雙側(cè)涌泉穴，每晚睡前敷1次，每次8 h。療程均為4周。

1.3?實驗室指標檢測

1）血清樣本制備：待各組病人療程結(jié)束后抽取病人靜脈血5 mL，4 ℃條件下靜置2 h后，3 500 r/min低溫離心15 min分離血清，轉(zhuǎn)移至儲存管備用。2）試劑盒法提取血清外泌體：取血清3 mL，經(jīng)0.8 μm針頭過濾器過濾除去細胞碎片，轉(zhuǎn)移至新儲存管中。使用Qiagen外泌體提取試劑盒提取外泌體，相關(guān)操作按說明書進行。 3）外泌體鑒定：使用免疫印跡（Western Blot）法檢測外泌體特異性蛋白 CD63、CD81、TSG101、Alix。 提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉120 min，一抗孵育（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。 二 抗（1∶2 000）孵育120 min，TBST洗滌5次，顯影、分析。外泌體樣本經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋后使用納米顆粒追蹤分析（NTA）進行徑粒分析。4）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、UCP2及外泌體分泌水平：按照試劑盒說明書的方法進行操作。5）實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測外泌體內(nèi)miR-320水平：提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴增，miR-320引物序列為GCTGGGTTGAGAGGGCGA，以U6為外參，外參序列為CTCGCTTCGGCAGCACA，應(yīng)用2－△Ct法計算miR-320的相對表達量，△Ct＝ CtmiR-320－CtmiR-U6。

1.4?主要儀器及試劑

試劑：ExoEasy Maxi Kit（Qiagen，76064）；miRNA提取試劑盒（Qiagen，217004）；

Western Blot一抗：Anti-TSG101、Anti-CD63、Anti-CD81、Anti-Alix（Abcam，ab125011、ab134045、ab155760、ab76608）；Anti-GAPDH（北京中杉金橋，TA-08）；山羊抗兔的二抗（北京博奧森，ZB2301）；UCP2 ELISA試劑盒（北京方程生物科技有限公司）；外泌體ELISA定量試劑盒（EXO-ELIS）；miRcute miRNA isolation Kit（天根生物科技有限公司，DP501）。

儀器：離心機（Centrifuge 5415D，Eppendorf）；生物分光光度計（BioPhotometer，Eppendorf）；熒光定量PCR儀（CFX Connect，TM BIO-RAD）；電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一公司生產(chǎn)）；半干轉(zhuǎn)膜儀（WSE-4040、AE6675L，ATTO）；恒溫水浴槽（HHS-8金壇醫(yī)療）；酶標儀（Thermo，美國）；納米顆粒跟蹤分析儀（ZetaView，德國Particle Metrix）。

1.5?統(tǒng)計學處理

采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)?果

2.1?外泌體鑒定

本研究使用Western Blot分別鑒定了所獲樣本中外泌體表面的標志性蛋白CD63、CD81、TSG101、Alix，結(jié)果均呈陽性。使用NTA徑粒分析樣本顆粒徑粒分布情況，結(jié)果顯示所獲樣本顆粒大小在80～200 nm之間，符合外泌體徑粒大小。詳見圖1、圖2。

2.2?3組治療后NT-proBNP、UCP2、外泌體定量、miR-320水平比較

穴位貼敷組治療后NT-proBNP表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。穴位貼敷組治療后UCP2表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。穴位貼敷組治療后外泌體分泌量高于電針組與對照組（P＜0.05），電針組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。穴位貼敷組治療后miR-320表達水平低于電針組與對照組（P＜0.05），電針組低于對照組（P＜0.05）。詳見表1。

2.3?NT-proBNP、UCP2、外泌體定量、miR-320水平的相關(guān)性

NT-proBNP與UCP2、miR-320呈正相關(guān)（r＝0.67，P＜0.01；r＝0.70，P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關(guān)（r＝－0.61，P＜0.01）；UCP2與miR-320呈正相關(guān)（r＝0.40，P＜0.01），與外泌體分泌量呈負相關(guān)（r＝－0.37，P＜0.01）；外泌體分泌量與miR-320呈負相關(guān)（r＝－0.69，P＜0.01）。詳見圖3。

3?討?論

解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCP）是線粒體內(nèi)膜上的內(nèi)膜蛋白，其可以在生物學過程中將氧化及磷酸化進程脫偶聯(lián)，減少三磷酸腺苷（ATP）的正常生成［3］。研究顯示，在哺乳動物中，UCP具有6種亞型（UCP1-6），而UCP2在心臟、腎臟、肝臟及骨骼肌等器官組織中廣泛表達［4］。UCP2基因位于人類第11號染色體上，基因長度為8.4 kb，有8個外顯子編碼309個氨基酸和6個跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)其參與機體多種生理及病理過程，UCP2影響心肌細胞中的能量代謝過程可能是調(diào)控CHF的潛在作用機制［5］。

心肌細胞中含有大量的線粒體，正常情況下線粒體為心肌細胞提供必須的能量，而當心肌細胞處在病理狀態(tài)時，大量的線粒體隨之發(fā)生功能障礙［6］，最終導(dǎo)致心肌能量代謝紊亂。研究證實，當心力衰竭發(fā)生時，心肌細胞中ATP含量會明顯下降，而UCP2及脂肪酸濃度明顯上升［7］，心肌細胞的ATP需求得不到滿足成為心力衰竭時心肌細胞能量代謝障礙的中心矛盾。然而，UCP2水平上升使氧化及磷酸化過程脫偶聯(lián)，降低線粒體膜電位，同時促進無氧糖酵解，繼續(xù)增加脂肪酸含量，形成惡性循環(huán)，進一步使ATP合成減少，甚至發(fā)生酸中毒，加重心力衰竭程度［8］，UCP2參與了CHF的發(fā)生、發(fā)展過程。

miRNAs及外泌體目前已被發(fā)現(xiàn)在多種生物學過程中起關(guān)鍵作用，如氧化應(yīng)激、細胞生成、凋亡、自噬、免疫調(diào)控等［9-12］，而其對CHF的調(diào)控作用也正逐步被挖掘。研究表明，發(fā)生心力衰竭時，機體分泌的外泌體中的miRNAs將會出現(xiàn)差異性表達，而這些差異性表達的miRNA或許會參與疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，如促進心肌纖維化、心臟結(jié)構(gòu)重塑、增強或抑制心肌細胞的凋亡等［13-16］。其中，心肌纖維化是貫穿于CHF發(fā)病過程的重要因素，是CHF防治的重要靶點之一。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)來源于外泌體的miR-320可通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調(diào)控心肌纖維化，且miR-320水平與心肌纖維化嚴重程度呈正相關(guān)，因此，推測miR-320可以通過調(diào)控心肌纖維化影響CHF的發(fā)生、發(fā)展。本研究在西藥治療的基礎(chǔ)上加用溫陽貼貼敷涌泉穴，觀察其對CHF病人NT-proBNP、UPC2、miR-320表達水平及外泌體定量的影響，并分析了各指標之間的相關(guān)性，結(jié)果表明外泌體分泌量可能與CHF的嚴重程度呈負相關(guān)，結(jié)合前期研究，推測在病理狀態(tài)下，血清中外泌體大量進入細胞內(nèi)，使心肌細胞中miR-320上調(diào)，同時影響UPC2介導(dǎo)的心肌能量代謝過程，從而引起心肌纖維化的發(fā)生，進而導(dǎo)致CHF。

心力衰竭歸屬于中醫(yī)學“水腫”“喘證”等范疇，屬本虛標實之證，病因以“水”“虛”“瘀”為主，病機多以心陽、心氣虛衰，至水飲內(nèi)停、凌心，治則多以溫陽利水、益氣活血為法［17］。心陽不足為心衰的主要因素，故溫陽法成為心衰病的重要治則之一。心為君主之官，主血脈，屬火，為陽中之陽，而腎臟主水及納氣，屬水，為人體陰陽之根本，與心衰病的關(guān)系尤為密切。心為君火，腎為相火，君火在上，如明照當空，相火在下，系陽氣之根。心在上，腎在下，上位者降為和，下位者，升為順，心之陰陽須降于腎，充養(yǎng)腎陰、腎陽；腎之陰陽需上升至心，以溫養(yǎng)心之陰陽。兩臟陰陽之間上下交通，相互依存，才能維持陰陽動態(tài)平衡，即水火既濟，心腎相交，如《慎齋遺書》有云：“心腎相交，全憑升降……升降者水火?！卑l(fā)生心衰時，則為心腎陽氣互資障礙，陰陽紊亂［18］，因此，心衰病雖病位在心，但治療中對腎陽的溫補不可忽視。

穴位貼敷治療是中醫(yī)外治法中的重要組成部分，其通過藥物貼敷特定穴位，讓藥性緩緩釋放，通過經(jīng)絡(luò)疏通氣血、調(diào)理陰陽從而達到治療疾病的作用［19］。研究表明，穴位貼敷療法在多種心血管疾病的治療中有著較好的療效［20-22］。溫陽貼由肉桂、黃芪、艾草組成，肉桂其性大熱，味辛、甘，歸腎、脾、心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效。黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾、肝、腎經(jīng)，具有益氣固表、升陽舉陷之功，是補氣佳品。艾草味苦、辛，性溫，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有溫經(jīng)驅(qū)寒之功效，佐以姜汁調(diào)和意在增強溫通之效。涌泉穴歸屬足少陰腎經(jīng)，是本經(jīng)脈氣所出之井穴，“井”者視為萬物始生也，故以溫陽貼貼敷雙側(cè)涌泉穴，旨在徐徐資腎陽，使腎經(jīng)之氣如涌泉濤濤，上達臟腑，溫通散寒。本課題組在前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)溫陽貼貼敷涌泉穴可有效改善CHF病人的心功能，但相關(guān)機制并不明確，本研究結(jié)果表明，或許與外泌體、miR-320的調(diào)控機制以及UCP2介導(dǎo)的心肌能量代謝機制相關(guān)，有望進一步的深入研究以挖掘CHF防治的新靶點。

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（收稿日期：2022-08-24）

（本文編輯王麗）