丁文姣，葛晶晶，吳優(yōu)，虞雨娟，周峰，阮征＊

（1.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047）（2.蘇州登頂醫(yī)療科技有限公司，江蘇蘇州 215000）

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是以肝細(xì)胞中脂肪過(guò)度沉積為特征的一類(lèi)慢性綜合征，發(fā)病率達(dá)到25.2%[1]。其中，有24%的患者從單純性脂肪變性發(fā)展為炎性亞型的非酒精性脂肪肝炎（NASH）或肝硬化[2,3]。NAFLD 也會(huì)引起廣泛的病理影響，例如胰島素抵抗、肥胖、高血壓、糖尿病和心血管疾病等[4]。

NAFLD 與高熱量飲食、過(guò)量攝入脂肪、攝入添加型果糖等不良飲食習(xí)慣相關(guān)[5,6]，并且肝臟中脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和糖代謝紊亂是驅(qū)動(dòng)NAFLD發(fā)展的關(guān)鍵因素[7-9]。通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟代謝紊亂可能成為改善NAFLD 的重要途徑。初期的NAFLD 通常是良性和可逆的，尚未有藥物被明確批準(zhǔn)用于NAFLD 且干預(yù)藥物通常伴有副作用，非藥物措施（健康飲食和身體活動(dòng)）是行之有效的預(yù)防和治療的方法[10]。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的膳食補(bǔ)充劑或特醫(yī)食品將作為NAFLD 飲食干預(yù)的重要途徑。

多酚是富含于水果、蔬菜、堅(jiān)果和咖啡等食品中的一類(lèi)天然化合物，發(fā)現(xiàn)可以從糖代謝、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激修飾和炎癥控制作用調(diào)節(jié)NAFLD[11]。富含多酚的地中海飲食模式干預(yù)6 周后，患者肝臟脂肪變性程度降低38%[12]。葛根作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物，素有“北參南葛”的美譽(yù)。它富含葛根多酚（葛根素、大豆苷、葛根素木糖苷、毛蕊異黃酮等）活性成分，對(duì)保護(hù)心血管系統(tǒng)疾病、解酒護(hù)肝及降低血脂血糖有較好功效[13,14]。其中，葛根素是葛根的主要活性成分和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。之前的研究表明葛根素在抗炎和改善肝臟功能方面具有優(yōu)良的生物效益[15,16]，可通過(guò)降低肝脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激緩解酒精或CCl4誘導(dǎo)的肝損傷[17,18]，而葛根素對(duì)于不良飲食下的NAFLD 影響及作用尚不明確。

為進(jìn)一步研究葛根素緩解或修復(fù)不良飲食習(xí)慣（高熱量飲食、過(guò)量攝入脂肪、攝入添加型果糖）造成NAFLD 的影響及作用，本研究建立了高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD 模型，探究葛根素干預(yù)NAFLD肝臟代謝的效果，為多酚干預(yù)或緩解NAFLD 的機(jī)制研究提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性C57BL/6J 小鼠，7 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010），南昌大學(xué)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（贛）2021-0001；小鼠維持飼料及高脂飼料購(gòu)于江蘇協(xié)同生物科技有限公司。D-果糖，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司。葛根素（純度98%），西安晉恒化工有限公司提供。羅格列酮，北京索萊寶科技有限公司。蘇木精和伊紅（H&E）染料、多聚甲醛，武漢仟百度生物有限公司。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司。乙腈（LC-MS 級(jí)）、甲醇（LC-MS 級(jí)），德國(guó)默克集團(tuán)。甲酸（LC-MS 級(jí)），賽默飛世爾科技有限公司。異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司。無(wú)水乙醇、氨水、二甲苯和中性樹(shù)膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-Q-TOF/MS，美國(guó)Absciex 公司。Phenomenex XB-C18（5 μm，250×4.6 mm），美 國(guó)Kinetex 公 司。ECLIPSE Ci 正置光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Eppendorf 公司。5804R、5424R 型冷凍離心機(jī)，日本Nikon 公司。KZ-II 型高速組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司。RM2016型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司。組織攤片機(jī)，科迪儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立

經(jīng)過(guò)7 d 的適應(yīng)性喂養(yǎng)，將小鼠隨機(jī)分組（n=6）：對(duì)照組、高脂組（高糖高脂）、陽(yáng)性組（高糖高脂+羅格列酮20 mg/kg·bw）、葛根素組（高糖高脂+葛根素400 mg/kg·bw），進(jìn)行為期8 周的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。其中，對(duì)照組飼喂正常飼料、飲用純凈水；高脂組、陽(yáng)性組、葛根素組飼喂高脂飼料（供能比為60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)），并飲用30%（m/V）果糖溶液以建立非酒精性脂肪肝模型。依據(jù)傳統(tǒng)地中海人群總多酚攝入量統(tǒng)計(jì)為2 g/d[19]，標(biāo)準(zhǔn)成人體質(zhì)量為60 kg，基于體表面積折算法計(jì)算小鼠等效給藥劑量（換算系數(shù)12.3），則小鼠給藥劑量約為400 mg/kg·bw。依據(jù)地中海飲食習(xí)慣及先前的研究[12]，設(shè)計(jì)每天以該劑量的葛根素進(jìn)行灌胃，為期8 周；為了避免長(zhǎng)期給藥的明顯毒性，陽(yáng)性組小鼠僅第7～8 周以20 mg/kg 劑量[20]的羅格列酮灌胃，為期2 周。為保證實(shí)驗(yàn)的均一性，其他小鼠以同等體積的生理鹽水灌胃。

1.3.2 肝臟組織病理檢查

組織石蠟包埋切片：取出4 wt.%多聚甲醛固定的新鮮肝臟組織，在脫水機(jī)內(nèi)依次以梯度乙醇進(jìn)行脫水處理并用石蠟包埋，最后用病理切片機(jī)切割為4 μm 的組織切片。

H&E 染色分析：依次將石蠟切片放入二甲苯、無(wú)水乙醇、φ=95%、90%、80%、70% 乙醇進(jìn)行脫蠟處理，浸入蘇木素染液染切片3～8 min 再于φ=1%的鹽酸酒精孵化數(shù)秒，φ=0.6%氨水返藍(lán)數(shù)秒。隨后，將組織切片入伊紅染液進(jìn)行染色1～3 min。染色完成后，用乙醇洗脫，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察切片并進(jìn)行組織病理分析。

1.3.3 肝臟促炎因子測(cè)定

低溫稱(chēng)取50 mg 肝臟組織，加入9 倍體積的預(yù)冷生理鹽水勻漿，并在4 ℃離心（3 000g，10 min）得到上清，隨后按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)商業(yè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝臟中的TNF-α、IL-1β和IL-6 的濃度。

1.3.4 非靶向代謝組學(xué)分析

1.3.4.1 樣品前處理

在干冰上稱(chēng)取肝臟組織80 mg 左右，加入200 μL預(yù)冷的純化水和2 顆鋯珠，低溫研磨得到勻漿液后加入800 μL 甲醇/乙腈（1:1，V/V）提取。然后在冰水浴中超聲10 min，在-20 ℃孵育過(guò)夜，然后在4 ℃，12 000g條件下離心15 min。取200 μL 等分上清液進(jìn)行LC-MS分析。為確定分析體系的穩(wěn)定性，將每個(gè)組織樣品上清液20 μL 等份混合，以獲得質(zhì)控（QC）樣品，樣本分析前注入3 個(gè)空白和3 個(gè)QC 樣品來(lái)平衡系統(tǒng)。之后每6 個(gè)樣品注入QC 樣品，以確定分析流程的穩(wěn)定性。

1.3.4.2 UPLC-Q-TOF/MS 分析條件

色譜采集肝臟樣品信息所設(shè)置的運(yùn)行參數(shù)如下：柱溫40 ℃，流量1 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈；洗脫程序?yàn)?～3 min，2%流動(dòng)相B，3～26 min，95%流動(dòng)相B，26～29 min，95%流動(dòng)相B，29～30 min，2%流動(dòng)相B，30～40 min，2%流動(dòng)相B，正離子和負(fù)離子模式采用相同的洗脫程序。一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜在Q/TOF-MS 質(zhì)譜儀上進(jìn)行，采用電噴霧電離（ESI）。正負(fù)離子模式gas 1 和gas 2 為55 psi，簾式氣體為35 psi，離子源溫度550 ℃，正負(fù)離子源氣壓分別為5 000 V 和-4 500 V。TOF/MS 掃描m/z范圍是50～1 200 u，TOF/MS/MS 掃描m/z范圍是30～1 200 u。在IDA 中檢測(cè) MS/MS 數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集在SCIEX OS 2.0 軟件（AB SCIEX）控制。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)SPSS（版本24.0，美國(guó)IBM 公司）完成，并使用具有Duncan 檢驗(yàn)的單向ANOVA分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。使用GraphPad Prism 8.0 實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。代謝數(shù)據(jù)采集在SCIEX OS 2.0 軟件（AB SCIEX）控制。在IDA 中檢測(cè)MS/MS 數(shù)據(jù)通過(guò)SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行代謝物注釋并合并正負(fù)離子模式下的代謝物。在MetaboAnalyst 5.0（http://www.metaboanalyst.ca）上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用無(wú)監(jiān)督主成分分析（PCA）、監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）來(lái)識(shí)別所研究代謝物的差異，并篩選潛在的生物標(biāo)志物。特別地，應(yīng)用OPLS-DA對(duì)兩組代謝物的變化進(jìn)行建模，并使用最佳擬合模型評(píng)估所有代謝物的投影變量重要性（VIP）。設(shè)置VIP 值及P值篩選差異代謝物，在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB 驗(yàn)證之后基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)作代謝通路分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 NAFLD 小鼠體質(zhì)量及肝臟組織的變化

飼喂高脂肪高果糖飲食的小鼠發(fā)生脂肪變性和脂肪性肝炎，表現(xiàn)出與人類(lèi)NAFLD 相似的代謝特征、脂質(zhì)積累和組織學(xué)改變[21]。如圖1a 所示，在為期8 周的實(shí)驗(yàn)中，高脂組小鼠體質(zhì)量呈快速上升趨勢(shì)，由27.17 g 增加到了37.95 g。葛根素干預(yù)后體重下降至32.35 g，與陽(yáng)性組32.73 g 幾乎一致。經(jīng)H&E 染色后可見(jiàn)（圖1c），對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)清晰，排列規(guī)則，緊密均一，而高脂組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，表現(xiàn)為體積增大且胞質(zhì)透亮，多個(gè)肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯脂肪空泡，少量中性粒細(xì)胞聚集，這與Chyau 等[22]報(bào)道的NAFLD 經(jīng)典病變相一致。葛根素干預(yù)后組織損傷減輕，表現(xiàn)為肝細(xì)胞形態(tài)清晰，排列較緊密且脂肪空泡幾乎消失，未見(jiàn)炎性細(xì)胞聚集，表明小鼠的脂肪肝病理狀態(tài)得到改善。與高脂組相比。葛根素干預(yù)后小鼠肝指數(shù)下降了14.9%（圖1b）。上述結(jié)果提示，對(duì)NAFLD模型組小鼠使用葛根素干預(yù)后，可較好地降低體重和肝指數(shù)，減輕組織損傷，進(jìn)而預(yù)防肝脂肪變性和NAFLD 的發(fā)生。

圖1 葛根素對(duì)NAFLD小鼠體質(zhì)量和肝臟組織的影響Fig.1 Effects of puerarin on body weight and liver tissue of NAFLD mice

2.2 葛根素減輕NAFLD 小鼠肝臟炎癥

NAFLD 的進(jìn)展與全身炎癥和炎癥標(biāo)志物的水平呈正相關(guān)。大量研究表明，果糖、飽和脂肪酸可以作為促炎因子引起代謝功能障礙并促進(jìn)NAFLD發(fā)展NASH[23]。肝臟Kupffer 細(xì)胞被病原體相關(guān)模式分子（PAMP）和損傷相關(guān)模式分子（DAMP）激活誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，例如TNF-α、IL-6和IL-1β，從而活化T 細(xì)胞引發(fā)肝臟炎癥[24]。如圖2 所示，與對(duì)照組相比，NAFLD 模型小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β濃度分別升高了53.7%、48.5%、53.2%。相比于NAFLD 模型組，羅格列酮干預(yù)后濃度分別下降了88.6%、61.3%和64.5%。與陽(yáng)性藥效果相似，葛根素干預(yù)后其水平下降了62.9%、60.5%和61.0%。結(jié)果表明葛根素能夠抑制肝臟炎癥，在Zhou 等[11]的研究中也得出葛根素可以降低IL-18 和TNF-α調(diào)節(jié)炎癥以改善肝功能。

圖2 葛根素對(duì)小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響Fig.2 Effects of puerarin on the levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in liver of mice

2.3 葛根素對(duì)NAFLD 肝臟代謝物的影響

2.3.1 主成分分析（PCA）

本研究采用PCA 檢測(cè)各組樣本的內(nèi)在聚類(lèi)關(guān)系。在無(wú)監(jiān)督模式下（圖3），高脂組與對(duì)照組明顯分離，表明兩組的肝臟代謝物存在差異，小鼠NAFLD 的誘發(fā)顯著改變了肝臟的代謝物。葛根素和羅格列酮的干預(yù)促使其代謝物特征遠(yuǎn)離高脂組，并向?qū)φ战M靠近。結(jié)果說(shuō)明各組肝臟中的代謝物均有明顯差異。

圖3 PCA圖Fig.3 PCA diagram

圖4 OPLS-DA圖Fig.4 OPLS-DA diagram

2.3.2 正交偏最小二乘-判別檢驗(yàn)（OPLSDA）

對(duì)具有差異特征的不同組別分別進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA，Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis），以分析各組樣本間的差異。在監(jiān)督模式下，OPLS-DA 顯示高脂組與對(duì)照組（R2Y=0.922，Q2=0.889），M 組與HFD 組（R2Y=0.836，Q2=0.599），PUE 組與HFD組（R2Y=0.85，Q2=0.335）之間明顯分離。結(jié)果表示模型具有較好的可靠性和基本的預(yù)測(cè)能力，且每?jī)山M間的代謝物具有顯著差異。

2.4 篩選差異代謝物

通過(guò)變異倍數(shù)分析（FC Analysis）和T 檢驗(yàn)對(duì)組間的差異代謝物進(jìn)行篩選。設(shè)置FC 為1.2，P＜0.1，VIP 值＞1 篩選得到組間差異代謝物的種類(lèi)及變化情況，衡量各代謝物的差異貢獻(xiàn)度。其中，高脂組VS 對(duì)照組篩選得到25 種差異代謝物（表1），其中有9 種代謝物上調(diào)，16 種代謝物下調(diào)，涉及氨基酸代謝、糖代謝、脂質(zhì)代謝及膽汁酸代謝途徑。葛根素組VS 高脂組間篩選到21 種差異代謝物（表2），其中有17 種上調(diào)，4 種下調(diào)；涉及氨基酸代謝、糖代謝、維生素代謝及脂質(zhì)合成途徑；其中葛根素干預(yù)逆轉(zhuǎn)了高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD 中油酸、L-蛋氨酸、N-甲基煙酰胺、L-天冬酰胺、L-絲氨酸、氨基己二酸和D-核糖5-磷酸等7 種差異代謝物的水平變化。肝臟為機(jī)體提供糖原及脂質(zhì)的合成分解、蛋白質(zhì)合成、維生素儲(chǔ)存等合成代謝能力，葛根素可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些代謝物所在的代謝途徑以改善NAFLD。另外，與高脂組相比，陽(yáng)性組有28 種差異代謝物被篩選（表3），其中有9 種代謝物上調(diào)，19 種代謝物下調(diào)，涉及氨基酸、膽汁酸和糖代謝途徑。

表1 高脂組vs對(duì)照組差異代謝物種類(lèi)及變化Table 1 Types and changes of different metabolites in high-fat group VS control group

表2 葛根素組vs高脂組差異代謝物種類(lèi)及變化Table 2 Types and changes of different metabolites in puerarin group VS high-fat group

表3 陽(yáng)性組vs高脂組差異代謝物種類(lèi)及變化Table 3 Types and changes of different metabolites in positivegroup VS high-fat group

通過(guò)比較葛根素/高脂和羅格列酮/高脂的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)了10 種共同的差異代謝物，分別是：L-絲氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、氨基己二酸、甘氨酰-L-亮氨酸、鞘氨醇、N-甲基煙酰胺、D-核糖5-磷酸、尿苷、鳥(niǎo)苷。本研究中葛根素和羅格列酮干預(yù)后這些代謝物水平顯著提高。其中，絲氨酸可作為生物標(biāo)志物，過(guò)量利用氨基酸加劇肝內(nèi)脂肪的積累，其水平降低可用于早期檢測(cè)非酒精性脂肪肝和非侵入性評(píng)估其組織學(xué)嚴(yán)重程度[25]。另外，L-絲氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸通過(guò)參與氨基酸代謝對(duì)脂質(zhì)堆積及脂質(zhì)變性發(fā)揮作用[26-28]。代謝物鞘氨醇參與鞘脂降解，鞘脂水平改變干擾肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，包括肝臟脂質(zhì)磷脂、二酰基甘油和膽固醇水平變化[29,30]。盡管本研究報(bào)告了鞘氨醇在NAFLD模型中變化的研究，但只有很少的研究驗(yàn)證。在他們的研究中指出，肝臟脂質(zhì)代謝中脂肪酸（FA）和甘油三酯（TG）及膽汁酸（BA）通過(guò)代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方法鑒定，并可能用作非侵入性診斷測(cè)試的生物標(biāo)志物，在預(yù)測(cè)肝臟脂代謝方面具有更大的潛力[31]。

2.5 差異代謝物KEGG 功能注釋及代謝通路分析

對(duì)篩選出的肝臟差異代謝物進(jìn)行代謝通路的功能注釋及通路分析（Pathway Analysis），相比于對(duì)照組，高脂組篩選的25 種差異代謝物共參與20 條代謝通路（圖5）。與高脂組相比，葛根素組篩選得到21 種代謝物共參與16 條代謝途徑（圖6）；陽(yáng)性組篩選得到28 種代謝物，共參與了20 條代謝途徑（圖7）。

圖5 高脂組vs對(duì)照組差異代謝物富集主要KEGG通路Fig.5 Main KEGG pathway of differential metabolite enrichment in high fat group VS control group

圖6 葛根素組vs高脂組差異代謝物富集主要KEGG通路Fig.6 Main KEGG pathway of differential metabolite enrichment in puerarin group VS high fat group

圖7 陽(yáng)性組vs高脂組差異代謝物富集主要KEGG通路Fig.7 Main KEGG pathways for differentially enriching metabolites in positive group vs high fat group

肝臟代謝物涉及到多種氨基酸代謝通路，這些代謝物的升高或降低表明氨基酸代謝紊亂。在NAFLD 小鼠肝臟中L-蛋氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸水平顯著下降。研究表明L-蛋氨酸膳食通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子釋放和脂質(zhì)過(guò)氧化改善NASH 的肝臟病變[28]，并調(diào)節(jié)谷胱甘肽的生物合成[32]。谷胱甘肽作為功能性食品的原料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用[33]。L-絲氨酸過(guò)度降解為脂肪從頭合成提供前體物質(zhì)，可能與肝臟脂質(zhì)堆積有關(guān)。補(bǔ)充膳食L-絲氨酸可減少肝組織中的炎性細(xì)胞沉積[26]。因此，這些氨基酸代謝紊亂可引發(fā)脂質(zhì)代謝障礙和肝臟炎癥等促進(jìn)NAFLD 的發(fā)展。脂質(zhì)代謝障礙可引起苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成失調(diào)，這些代謝物對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)具有直接作用[27]。本研究中，葛根素提高了高糖高脂誘導(dǎo)NAFLD 中低水平的L-蛋氨酸、L-絲氨酸、L-天冬酰胺，調(diào)節(jié)了肝臟的半胱氨酸和蛋氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等氨基酸代謝途徑。結(jié)果提示葛根素可減輕氨基酸代謝紊亂預(yù)防NAFLD。在他們的研究中也發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充姜黃素可通過(guò)降低NAFLD 中高水平的生糖氨基酸和生酮氨基酸，改善小鼠肝臟代謝紊亂[34]。

肝臟中脂質(zhì)的合成代謝失調(diào)引發(fā)肝脂質(zhì)積聚，脂毒性已被證明會(huì)引發(fā)肝損傷、炎癥和胰島素抵抗[35]。NAFLD 小鼠中觀察到油酸水平提高，膽酸、營(yíng)養(yǎng)膽酸水平下降。油酸富集誘導(dǎo)肝細(xì)胞更大程度的脂質(zhì)代謝失調(diào)和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)NASH 的發(fā)生[36,37]。研究報(bào)道紅三葉草異黃酮具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以減少高糖高脂膳食導(dǎo)致的氧化損傷作用[38]。膽汁酸輔助鞘脂降解，兩者代謝失調(diào)與NAFLD 患者的脂質(zhì)累積有關(guān)[29]。葛根素干預(yù)后油酸水平下降為高脂組的0.7 倍，鞘氨醇水平提高1.47 倍。郭若涵等[39]報(bào)道了葛根素可以降低血清總脂肪酸含量，有效地糾正SD 大鼠紊亂的脂質(zhì)代謝。與他們的結(jié)果一致，本研究葛根素可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝途徑，抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積而緩解NAFLD。

高糖高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝細(xì)胞中的糖類(lèi)（棉籽糖、海藻糖、乳果糖）含量明顯升高，肝臟細(xì)胞的糖代謝發(fā)生紊亂。糖代謝途徑的中間產(chǎn)物D-核糖5-磷酸水平降低至對(duì)照組的0.71 倍，而葛根素干預(yù)后提高至高脂組的1.28 倍。D-核糖5-磷酸參與磷酸戊糖途徑（PPP）調(diào)控Treg 細(xì)胞激活和抑制功能[40]，提示葛根素激活PPP 途徑可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。另外，維生素作為酶輔因子促進(jìn)細(xì)胞能量合成，嘌呤及嘧啶代謝是決定功能表現(xiàn)的生物學(xué)過(guò)程[41,42]。葛根素調(diào)節(jié)了肝臟代謝途徑中的維生素代謝（13-順式視黃酸、維甲酸、N-甲基煙酰胺）及嘌呤嘧啶代謝（腺嘌呤、鳥(niǎo)苷及尿苷）等途徑，而這些物質(zhì)的代謝是維護(hù)人體免疫調(diào)節(jié)、葡萄糖和脂質(zhì)代謝重要生物途徑[43]。

3 結(jié)論

葛根素對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型小鼠具有明顯的保護(hù)作用。肝臟代謝組學(xué)揭示了葛根素調(diào)整了高脂高糖誘導(dǎo)NAFLD 的肝臟代謝，主要通過(guò)恢復(fù)氨基酸代謝途徑紊亂；下調(diào)油酸水平，促進(jìn)鞘脂降解，改善肝臟脂質(zhì)代謝。同時(shí)，葛根素調(diào)節(jié)D-核糖5-磷酸、視黃酸、維甲酸、N-甲基煙酰胺、腺嘌呤、鳥(niǎo)苷及尿苷的代謝水平，它們分別參與磷酸戊糖代謝、維生素、嘌呤及嘧啶代謝途徑。另外，葛根素緩解了NAFLD 小鼠肝臟組織損傷，抑制肝臟組織的炎癥。研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)膳食補(bǔ)充劑預(yù)防NAFLD 提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。