尹朝春，李環(huán)通，許澤文，陳丹妮，王賽男，肖蘇堯＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）（2.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院食品工程系，廣東茂名 525024）（3.華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司，廣東深圳 518055）

藍(lán)莓花色苷（Blueberry Anthocyanin，BBA）具有包括抗氧化、降脂、降血糖、抗炎、促進(jìn)益生菌增殖、抗腫瘤、保護(hù)視網(wǎng)膜等多種生物活性，在保健食品開發(fā)、化妝品行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。然而，花色苷是一類極不穩(wěn)定的物質(zhì)，對(duì)pH、溫度、光照較為敏感[2]，易受到氧化劑、酶、金屬離子等因素的破壞，而且，花色苷的親水性極強(qiáng)，在胃腸道的吸收低，從而導(dǎo)致其在機(jī)體的生物利用度降低。為了提高花色苷的穩(wěn)定性，目前的研究采用了多種方法，例如分子改性、添加輔色物質(zhì)、微膠囊化、生物大分子復(fù)合等[3]。

生物大分子復(fù)合是指花色苷與蛋白質(zhì)、多糖等大分子發(fā)生相互絡(luò)合，形成復(fù)合物，提高花色苷的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)、多糖、多肽等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，利用帶相反電荷的聚電解質(zhì)之間的靜電作用，可以在溶液中締合形成具有三維大分子結(jié)構(gòu)的復(fù)合聚電解質(zhì)（Polyelectrolyte Complex，PEC），聚電解質(zhì)復(fù)合物因其無毒且具有良好的耐受性而受到廣泛關(guān)注[4]，大量研究表明聚電解質(zhì)復(fù)合物能夠達(dá)到提升花色苷的穩(wěn)定性，并且能夠?qū)崿F(xiàn)靶向緩釋[5]。

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolation，SPI）營(yíng)養(yǎng)豐富、安全無毒，已廣泛用于食品工業(yè)中，是潛在的聚陽(yáng)離子材料。SPI 在等電點(diǎn)以下帶正電，能夠與陰離子聚電解質(zhì)相互作用。阿拉伯樹膠（Arabic Gum，AG）是一種帶負(fù)電的無毒的生物大分子，主要作為聚電解質(zhì)復(fù)合物壁材[8]。本文在上述參考文獻(xiàn)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)上，通過SPI 和AG 以靜電自組裝的方式負(fù)載藍(lán)莓花色苷，旨在通過聚電解質(zhì)體系來提升藍(lán)莓花色苷穩(wěn)定性，并且研究探討復(fù)合物作用于經(jīng)油酸誘導(dǎo)的HepG2 脂質(zhì)模型的降脂作用，為聚電解質(zhì)復(fù)合物提高天然活性物功能活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓花色苷由本實(shí)驗(yàn)室提取[9]。

人肝癌細(xì)胞株HepG2 購(gòu)買于生工生物工程（上海）股份有限公司。

大豆分離蛋白（SPI）、阿拉伯樹膠粉（AG）、噻唑藍(lán)（MTT）、油紅O 試劑盒、油酸，上海源葉生物科技有限公司；PBS、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、鏈霉素青霉素，美國(guó)Gibco 公司；BCA、TG、TC、SOD、MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Enspire2300 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)PE 公司；Sentinel Gold 生物安全柜、CCL-170B-8 二氧化碳培養(yǎng)箱，新加坡藝思高科技有限公司；BDS 200 倒置顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；JY 92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5415 R 通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；EVO MA 15 掃描式電子顯微鏡，ZEISS 公司；Vertex 70 傅立葉變換紅外光譜儀，布魯克公司；Mastersizer 3000 激光粒度分析儀、Zatasizer Nano ZS 90 納米粒度及ZETA 電位分析儀，英國(guó)Malvern 公司；LS-50HG 立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的制備

本文通過研究超聲功率、壁芯質(zhì)量比（SPI:BBA）、壁材質(zhì)量比（SPI:AG）、包埋時(shí)間等4 個(gè)因素來篩選出最適聚電解質(zhì)制備工藝。配制一定質(zhì)量濃度的預(yù)熱處理SPI 溶液和AG 溶液，將體系調(diào)到pH 值3.0。將10 mL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL的預(yù)熱處理后SPI 溶液置于燒杯中，調(diào)整變幅桿高度直至深入液面以下，加入BBA，不同功率下進(jìn)行20 min 的超聲波處理，總處理時(shí)長(zhǎng)為20 min（超聲設(shè)置為工作時(shí)間3 s，間歇時(shí)間3 s，超聲破碎儀總功率為900 W）。取出燒杯，在700 r/min 條件下磁力攪拌，逐滴加入不同體積的質(zhì)量濃度為10 mg/mL的AG 溶液，繼續(xù)攪拌一定時(shí)間制備得到SPI/AGBBA 復(fù)合物（下文簡(jiǎn)稱復(fù)合物）。

1.3.2 包埋率測(cè)定

吸取適量制備好的復(fù)合物裝入超濾離心管中，相對(duì)離心力15 000×g，4 ℃條件下離心20 min，取下清液采用pH 示差法測(cè)花色苷含量。

式中：

X——包埋率，%；

w1——總投入花色苷質(zhì)量，mg；

w2——離心后下清液中花色苷質(zhì)量，mg。

1.3.3 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的表征

1.3.3.1 平均粒徑、ζ-電位測(cè)定

利用納米粒徑及Zeta 電位分析儀，將樣品液稀釋到合適倍數(shù)后，取適量加入樣品池中，用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定復(fù)合物的平均粒徑和多分散系數(shù)。通過電位池測(cè)定樣品通電后的電泳遷移率，計(jì)算聚電解質(zhì)復(fù)合物的表面ζ-電位。室溫25 ℃，各樣品平行測(cè)定3 次。

1.3.3.2 BBA 的熒光淬滅特性

稱取1.00 g 大豆分離蛋白粉末于燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，水浴磁力攪拌80 ℃、30 min 至完全溶解，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的預(yù)熱處理的大豆分離蛋白溶液，使用鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液將體系調(diào)到pH 值3.0。用pH 值3.0 的蒸餾水將大豆分離蛋白溶液稀釋成0.5 mg/mL 的工作液，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度梯度為0、0.25、0.5、1、2 和4 μg/mL 的花色苷工作液。將SPI 工作液與各質(zhì)量濃度的花色苷工作液按體積比1:1 的比例混合，震蕩混合后置于室溫孵育30 min，以蒸餾水為空白，記錄并扣除響應(yīng)化合物的熒光值。使用激發(fā)光譜，熒光激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍設(shè)置為300～450 nm，激發(fā)及發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm。

1.3.3.3 掃描電鏡

使用鎢光掃描電子顯微鏡微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)觀察，表面鍍金后用掃描電鏡觀察微膠囊的外觀形態(tài)。

1.3.3.4 傅里葉紅外

采用傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)SPI/AG/BBA聚電解質(zhì)復(fù)合物冷凍干燥樣品進(jìn)行分析。取樣品與KBr 經(jīng)過研缽研細(xì)后用壓片機(jī)制得透明樣品薄片，以空白KBr 薄片來調(diào)整基線水平并對(duì)差異化光譜進(jìn)行歸一化處理，以空氣為參比，測(cè)定波段為4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)設(shè)置為16 次。

1.3.4 體外模擬緩釋

在體外模擬胃液和模擬腸液中觀察花色苷的釋放，分別將相同質(zhì)量濃度花色苷的游離花色苷和SPI/AG-BBA 復(fù)合物裝入已活化好的3.5 ku 纖維素透析袋中置于燒杯，向燒杯中加入足量的pH 值1.2的0.2% NaCl 模擬胃液和pH 值6.8 的50 mmol/L 的PBS，于37 ℃下恒溫磁力攪拌。在0、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 時(shí)取樣測(cè)定花色苷含量，每次取樣后向燒杯中補(bǔ)充同等體積的模擬胃液和模擬腸液[10]。

式中：

C——花色苷釋放率，%；

wt——t時(shí)刻花色苷累計(jì)釋放量，mg；

w0——花色苷初始質(zhì)量，mg。

1.3.5 SPI/AG-BBA 復(fù)合物體外降脂活性

1.3.5.1 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)參考劉暢等[11]的方法，HepG2 細(xì)胞用含φ=10%胎牛血清、φ=1%青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱。

1.3.5.2 復(fù)合物的細(xì)胞毒性測(cè)定

將密度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔200 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出96 孔板，吸去舊的培養(yǎng)基，PBS 清洗。試驗(yàn)組每孔加入200 μL 含有不同質(zhì)量濃度花色苷樣品和油酸造模劑的完全培養(yǎng)基，設(shè)置空白組，每組6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，吸去舊的培養(yǎng)基，PBS 清洗，每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出舊培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩孵育10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。按照公式3 計(jì)算存活率。

式中：

B——為細(xì)胞存活率，%；

A試驗(yàn)——為試驗(yàn)組的吸光度；

A對(duì)照——為對(duì)照組的吸光度。

1.3.5.3 油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積累模型的建立及鑒定

將密度為每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞懸液接種到12孔板中，每孔1 mL，常規(guī)培養(yǎng)24 h。油酸造模劑的制備參照劉暢等[11]的方法，配油酸濃度為10 mmol/L的造模劑溶液，0.22 μm 濾膜過濾除菌，冷凍備用，用完全培養(yǎng)基將造模劑稀釋成0、200、400、600 μmol/L。取出12孔板吸取舊的培養(yǎng)基，PBS清洗。加入1 mL 不同濃度的油酸造模劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.5.4 復(fù)合物對(duì)脂質(zhì)HepG2 細(xì)胞模型的降脂效果檢測(cè)

將密度為每毫升2×105個(gè)的細(xì)胞懸液接種到6孔板中，每孔2 mL，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%～90%時(shí)，使用200 μmol/L 的油酸誘導(dǎo)，設(shè)置對(duì)照組。24 h 后吸棄舊的培養(yǎng)液，PBS 清洗，對(duì)照組和模型組加入完全培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入15 μg/mL 多烯磷脂酰膽堿（Polyene Phosphatidyl Choline，PPC），實(shí)驗(yàn)組分別加入花色苷質(zhì)量濃度為10、30、50 μg/mL的BBA 溶液和SPI/AG-BBA 溶液，每孔培養(yǎng)基為2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48 和60 h。待細(xì)胞給藥處理結(jié)束后，吸棄6 孔板中的培養(yǎng)基，PBS 洗滌后收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，冰浴狀態(tài)下進(jìn)行超聲破碎處理。根據(jù)試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞樣液中的總蛋白、TG、TC、SOD、MDA 的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均設(shè)置3 個(gè)平行，處理后的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2022 軟件作圖，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示存在顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的制備和優(yōu)化

2.1.1 超聲功率對(duì)復(fù)合物形成的影響

超聲功率對(duì)復(fù)合物形成的影響結(jié)果如圖1 所示，在0～180 W 的范圍內(nèi)增加，SPI/AG-BBA 的包埋率隨著功率的提高而提高，180 W 時(shí)達(dá)到最高包埋率為65.36%，但是隨著超聲功率進(jìn)一步提高，復(fù)合物的包埋率逐漸降低，從功率225 W 時(shí)的61.90%降低到了270 W 時(shí)的56.20%。分析可能的原因，在于超聲處理后的大豆分離蛋白球狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生變化，使親水區(qū)域更多地暴露[12]，有利于蛋白質(zhì)與花色苷的結(jié)合。但是，當(dāng)超聲功率過高時(shí)，空化效應(yīng)迫使SPI/BBA 進(jìn)入高溫狀態(tài)，破壞了單個(gè)組分的分子結(jié)構(gòu)或復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，使花色苷泄漏，包埋率降低。超聲處理還能夠顯著減小蛋白的粒徑，隨著功率增大，復(fù)合物的粒徑逐漸減小，180 W 功率條件下，平均粒徑從3.81 μm 降低至2.54 μm，270 W時(shí)降為1.79 μm。ζ-電位則不受超聲功率的影響，基本穩(wěn)定在19 mV 左右。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合物選擇超聲功率為180 W。

圖1 超聲功率對(duì)復(fù)合物包埋率、平均粒徑、ζ-電位的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on embedding rate,mean particle size and Zeta-potential of complex

2.1.2 壁芯質(zhì)量比對(duì)復(fù)合物形成的影響

由圖2可知，SPI:BBA 比例從5:1～20:1 范圍內(nèi)，包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，由開始時(shí)的58.62%上升至10:1 時(shí)的65.10%，之后包埋率開始出現(xiàn)略微下降。隨著SPI 比例增加，包埋率逐漸上升，壁材的結(jié)合位點(diǎn)增加，擁有更多的結(jié)合機(jī)會(huì)讓包埋率得到提升[13]。繼續(xù)增大SPI 的量，復(fù)合物的包埋率開始下降，這可能是因?yàn)楸诓娜榛€(wěn)定性減弱導(dǎo)致的[14]，復(fù)合物的外殼形成不均勻?？赡艿脑蛟谟?，較大量花色苷的存在會(huì)與SPI 發(fā)生充分結(jié)合，此時(shí)花色苷是過量的，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)較大變化，這可能不利于接下來與AG 的結(jié)合，因?yàn)檫@種結(jié)合不僅僅是電荷在起作用，還有蛋白和多糖基團(tuán)上的結(jié)合，花色苷占據(jù)較多位置使得AG 與SPI 的結(jié)合過程受到擠壓[15]。由于體系中陰陽(yáng)離子聚電解質(zhì)比較穩(wěn)定，在加入不同質(zhì)量花色苷后復(fù)合物的ζ-電位變化有略微下降，在5:1 時(shí)電位為19.31 mV，到20:1 時(shí)電位為18.80 mV，但是整體不明顯，說明在此范圍內(nèi)的花色苷添加量對(duì)體系ζ-電位沒有影響。隨著花色苷添加量的減小，粒徑逐漸增大。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合物選擇壁芯質(zhì)量比（SPI:BBA）為10:1。

圖2 不同壁芯比對(duì)復(fù)合物包埋率、平均粒徑、ζ-電位的影響Fig.2 Effects of different wall-core ratio on embedding rate,average particle size and Zeta-potential of complex

2.1.3 壁材比對(duì)復(fù)合物形成的影響

由圖3 可知，在壁材比（SPI:AG）10:2～10:6范圍內(nèi)，包埋率隨著壁材比的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。壁材比為10:2 時(shí)包埋率最低為46.20%，當(dāng)壁芯比為10:4 時(shí)包埋率達(dá)到64.10%，隨著壁材比繼續(xù)增加，包埋率增速放緩，10:6 時(shí)為67.00%。隨著AG 質(zhì)量增加，與SPI 有效結(jié)合，形成較多較密集的復(fù)合物。SPI:AG 為10:2 時(shí)ζ-電位處于最高水平，達(dá)到了28.70 mV，此時(shí)的復(fù)合物體系中正電荷占據(jù)主導(dǎo)，整體比較穩(wěn)定，不容易發(fā)生沉降現(xiàn)象。在Lan 等[16]的研究中提到兩種相反電荷聚電解質(zhì)的比例影響著復(fù)合物在水體系中的形態(tài)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在陽(yáng)離子聚電解質(zhì)占據(jù)主導(dǎo)時(shí)體系呈溶液狀態(tài)，隨著陰離子聚電解質(zhì)的增加，體系會(huì)經(jīng)過聚電解質(zhì)小球、顆粒狀沉淀和絮凝沉淀等過程，后兩者都不是理想狀態(tài)。隨著AG 質(zhì)量的逐漸增加，體系的粒徑開始逐漸變大，粒徑在10:4 時(shí)2.53 μm，10:6 時(shí)粒徑增加到8.06 μm，大顆粒的復(fù)合物形狀不規(guī)則并且分布不集中，由于重力作用會(huì)快速沉淀在燒杯底部。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合物選擇壁材比（SPI:AG）為10:4。

2.1.4 包埋時(shí)間對(duì)復(fù)合物形成的影響

從圖4 中可以看出，在包埋時(shí)間0.5～2.0 h 范圍內(nèi)隨著時(shí)間增加出現(xiàn)包埋率先增加后減小的現(xiàn)象，0.5 h 此時(shí)的包埋率為57.60%，包埋時(shí)間延長(zhǎng)到1.0 h時(shí)包埋率為66.05%，有明顯的上升，隨著包埋時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，包埋率出現(xiàn)明顯下降。時(shí)間增加而出現(xiàn)的包埋率下降的原因可能是復(fù)合物中的花色苷在經(jīng)過機(jī)械作用的情況下開始發(fā)生泄漏，這種現(xiàn)象與復(fù)合物本身的緩釋作用相關(guān)[17]。不同包埋時(shí)間下，復(fù)合物的ζ-電位變化趨勢(shì)不明顯，并且穩(wěn)定。隨著包埋時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑逐漸減小。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備復(fù)合物選擇包埋時(shí)間為1 h。

圖4 不同包埋時(shí)間對(duì)復(fù)合物包埋率、平均粒徑、ζ-電位的影響Fig.4 Effect of different embedding time on embedding rate,average particle size and Zeta-potential of complex

2.2 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的表征

2.2.1 BBA 對(duì)大豆分離蛋白的熒光淬滅特性

大豆分離蛋白的內(nèi)源熒光主要來自于結(jié)構(gòu)中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基團(tuán)，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm 時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光光譜取決于色氨酸殘基[21]。圖5 為大豆分離蛋白的熒光淬滅圖譜，由圖可知，花色苷質(zhì)量濃度增加，大豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸降低，最大激發(fā)峰逐漸變小。BBA 質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL 和4.0 μg/mL 時(shí)，最大熒光強(qiáng)度分別下降了63.67%和83.44%，熒光強(qiáng)度下降可能是由于發(fā)生了靜態(tài)淬滅[21]，說明大豆分離蛋白與花色苷之間產(chǎn)生了一定的相互作用；當(dāng)BBA 質(zhì)量濃度為4.0 μg/mL 時(shí)，最大激發(fā)波長(zhǎng)由327 nm 變成314 nm，發(fā)生藍(lán)移，這說明大豆分離蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，花色苷的加入改變了蛋白分子內(nèi)部氨基酸殘基微環(huán)境的極性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散舒展，使得更多疏水基團(tuán)和色氨酸暴露，非極性增強(qiáng)[21]。綜上所述，BBA 與SPI 緊密結(jié)合，形成了SPI-BBA 復(fù)合物。

圖5 不同質(zhì)量濃度BBA對(duì)大豆分離蛋白熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of different concentrations of BBA on the fluorescence intensity of soybean protein isolates

2.2.2 傅立葉變換紅外光譜

對(duì)制備的SPI/AG-BBA 復(fù)合物進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，結(jié)果如圖6 所示。在經(jīng)過花色苷復(fù)合之后，大豆分離蛋白的氨基和羧基帶分別從3 407.33、2 972.86 和2 932.98 cm-1遷移到3 405.22、2 961.86和2 931.14 cm-1。蛋白質(zhì)的主要特征譜帶由酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 560～1 520 cm-1）、酰胺Ⅲ帶（1 240～1 430 cm-1）三個(gè)強(qiáng)譜峰帶組成[21]，隨著花色苷的加入，酰胺I 帶從1 641.05 cm-1遷移到了1 645.26 cm-1出現(xiàn)了略微藍(lán)移；酰胺II 帶發(fā)生較大紅移，從1 544.76 cm-1遷移到1 539.78 cm-1。這可能是由于O-H 鍵和分子間氫鍵伸縮震動(dòng)引起的，表明SPI/AG 與BBA 之間存在氫鍵作用[21]。紅外光譜的變化說明了花色苷引起了大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，花色苷與SPI/AG 主要通過氫鍵結(jié)合，形成SPI/AG-BBA 復(fù)合物。

圖6 SPI/AG及SPI/AG-BBA傅立葉變換紅外光譜圖Fig.6 SPI/AG and SPI/AG-BBA Fourier transform infrared spectra

2.2.3 復(fù)合物掃描電鏡檢測(cè)

對(duì)SPI/AG-BBA 復(fù)合物進(jìn)行了掃描電鏡檢測(cè)，由圖7 可以看出，SPI/AG-BBA 是粒徑為2 μm 左右的不規(guī)則球形，形成由數(shù)個(gè)或數(shù)十個(gè)團(tuán)聚在一起的球團(tuán)。

圖7 SPI/AG-BBA掃描電鏡圖Fig.7 SPI/AG-BBA scanning electron microscope image

2.3 SPI/AG-BBA 復(fù)合物體外模擬釋放

為了檢測(cè)復(fù)合物的緩釋效果，對(duì)SPI/AGBBA 復(fù)合物在體外模擬胃液（pH 值1.2）和腸液（pH 值6.8）中的釋放過程進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，在pH 值1.2 的模擬胃液環(huán)境中，復(fù)合物在2 h 時(shí)71.05%，隨后釋放速度放慢，4 h 時(shí)釋放率為79.20%，而游離花色苷在2 h 和4 h 的釋放率分別為87.80%和97.51%，幾乎完全釋放，比較而言，復(fù)合物具備一定的緩釋效果。在pH 值6.8 的模擬腸液環(huán)境中，在監(jiān)測(cè)區(qū)間內(nèi)釋放率開始逐漸下降。在pH 值6.8 條件下復(fù)合物的釋放率峰值發(fā)生在6 h 時(shí)，為66.40%，與pH 值1.2 環(huán)境下峰值相比有明顯降低。而游離BBA 同樣具有快速釋放的特點(diǎn)，在前兩個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到花色苷釋放率的明顯躍升，在2 h 時(shí)達(dá)到了87.80%，隨后釋放率緩慢升至92.51%，4 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。

圖8 SPI/AG-BBA復(fù)合物在體外模擬條件下的釋放情況Fig.8 Release of SPI/AG-BBA complex under simulated conditions in vitro

由上述結(jié)果來看，在pH 值6.8 的模擬腸液環(huán)境中復(fù)合物具有更佳的緩釋效果，可能的原因是在pH 值6.8 的環(huán)境下復(fù)合物的電荷下降，溶脹度降低，結(jié)構(gòu)變得致密[23]，花色苷的釋放進(jìn)一步受阻；另一方面，花色苷的釋放程度不及降解程度，所以在釋放率上表現(xiàn)為緩慢下降，這與現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果相近[24]。總體來看，經(jīng)過復(fù)合物負(fù)載后的花色苷在模擬胃腸液狀態(tài)中表現(xiàn)出了優(yōu)良的緩釋效果。

2.4 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的降脂活性測(cè)定

2.4.1 SPI/AG-BBA 復(fù)合物的細(xì)胞安全濃度檢測(cè)

為了確定SPI/AG-BBA 復(fù)合物對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞的安全作用濃度，試驗(yàn)選取質(zhì)量濃度為0～100 μg/L的BBA 及復(fù)合物作用于細(xì)胞24 h，用MTT 法測(cè)定細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖9 所示，在SPI/AG-BBA復(fù)合物中花色苷折合質(zhì)量濃度為10～50 μg/L 時(shí)，細(xì)胞存活率無明顯影響，表明在50 μg/mL 質(zhì)量濃度以內(nèi)對(duì)細(xì)胞無毒副作用；質(zhì)量濃度為75 μg/L 時(shí)，細(xì)胞存活率下降至90.05%，而對(duì)應(yīng)的游離花色苷組細(xì)胞存活率降低至75.51%，由此，選擇0～50 μg/L 的花色苷作為HepG2 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍。

圖9 BBA及SPI/AG-BBA復(fù)合物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.9 Effects of BBA and SPI/AG-BBA complex on survival rate of HepG2 cells

從圖中還可發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物在低質(zhì)量濃度時(shí)（10～20 μg/L）表現(xiàn)出了顯著的細(xì)胞促生長(zhǎng)作用，這可能是由于復(fù)合物中的大豆分離蛋白有一定的促生長(zhǎng)作用。在75 μg/mL 時(shí)SPI/AG-BBA 復(fù)合物的細(xì)胞存活率為89.32%，相對(duì)游離BBA 組的高出了16.35%，表明SPI/AG-BBA 復(fù)合物細(xì)胞毒性更低。

2.4.2 HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型的建立

為了確定油酸造模劑對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞的安全作用濃度，試驗(yàn)選取不同濃度的油酸造模，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖10 所示，當(dāng)濃度在200～800 μmol/L 范圍內(nèi)，與空白組相比細(xì)胞存活率無顯著性差異，屬于安全濃度范圍，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用200 μmol/L 油酸濃度為造模濃度。

圖10 油酸造模劑對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.10 Effect of oleic acid moulding agent on survival rate of HepG2 cells

2.4.3 SPI/AG-BBA 對(duì)細(xì)胞模型中TG、TC含量的影響

將復(fù)合物作用于模型細(xì)胞中，通過檢測(cè)細(xì)胞中TG、TC 含量來評(píng)價(jià)其降脂效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11，經(jīng)過油酸誘導(dǎo)24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的TG、TC 含量顯著高于空白組，建模成功；給藥培養(yǎng)48 h 后，當(dāng)BBA質(zhì)量濃度10 μg/mL 時(shí)，與模型組相比，BBA 及SPI/AG-BBA 組的TC 含量無顯著性差異，在BBA質(zhì)量濃度30～50 μg/mL 下，BBA 組及SPI/AG-BBA組的TG、TC含量顯著低于模型組，且存在劑量依賴。當(dāng)BBA 質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，復(fù)合物組的TG、TC 含量分別為0.21 mmol/g prot、0.19 mmol/g prot，與模型組相比，復(fù)合物組的TG、TC 分別下降了41.18%、42.12%，與游離BBA 組相比，復(fù)合物組的TG、TC 分別下降了14.21%、9.70%。劉暢等[11]的研究也發(fā)現(xiàn)200 μg/mL 的紅樹莓花色苷提取物能使肝癌細(xì)胞內(nèi)TG 含量降低37.23%，具有清除細(xì)胞脂肪堆積的能力。我們還檢測(cè)了游離BBA 及其復(fù)合物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞TG 和TC 含量的影響，結(jié)果如圖12 所示，在作用時(shí)間12～60 h 范圍內(nèi)，24 h 前，游離BBA 組和復(fù)合物組TG 和TC 含量無顯著性差異，36～60 h，復(fù)合物組的TG、TC 含量呈下降趨勢(shì)，且顯著低于游離BBA 組，這可能是復(fù)合物組中BBA 緩慢釋放出來，BBA 沒有過早被破壞，持續(xù)作用細(xì)胞，而游離BBA 組則發(fā)生較快降解，與前人的發(fā)現(xiàn)一致[25]。綜上所述，經(jīng)過復(fù)合物負(fù)載的花色苷在降脂活性上有一定提高，且作用效果隨作用時(shí)間的增加而提高。

圖11 BBA及SPI/AG-BBA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞中TG、TC含量的影響Fig.11 Effects of BBA and SPI/AG-BBA complex on TG and TC content in cells

圖12 不同藥物作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞中TG、TC含量的影響Fig.12 Effects of different drug duration on the content of TG and TC in cells

2.4.4 SPI/AG-BBA 對(duì)細(xì)胞模型中SOD、MDA 含量的影響

檢測(cè)了細(xì)胞中SOD 酶活力和MDA 的含量，結(jié)果如圖13 所示，空白組細(xì)胞酶活力最強(qiáng)，而油酸誘導(dǎo)之后的細(xì)胞，由于胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致酶活力下降。酶活力的提升與BBA 濃度呈正相關(guān)，BBA 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，BBA 組及復(fù)合物組的SOD 酶活分別提升了26.92%、38.23%，MDA 含量下降了14.13%、14.31%。當(dāng)BBA 質(zhì)量濃度增加達(dá)到50 μg/mL 時(shí)，復(fù)合物組的MDA 含量為10.58 nmol/mg prot，比模型組下降了34.15%，比游離BBA 組下降了17.12%；SOD 酶活力為25.25 U/mg prot，比模型組提高了63.99%，比游離BBA 組提高了9.54%。我們還檢測(cè)游離BBA 及其復(fù)合物不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞SOD 酶活力及MDA含量的影響，結(jié)果如圖14 所示，復(fù)合物組在作用時(shí)間12～60 h 范圍內(nèi)，SOD 含量出現(xiàn)上升趨勢(shì)、MDA 含量出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，而游離BBA 組在這兩項(xiàng)指標(biāo)的表現(xiàn)上比較平穩(wěn)，沒有明顯變化。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合物組與游離BBA 組差距逐漸增大，作用時(shí)間為24 h 時(shí)，復(fù)合物組的SOD、MDA 指標(biāo)與游離BBA 組相比無顯著性差異，當(dāng)作用時(shí)間增加到60 h 時(shí)，復(fù)合物組的MDA比游離BBA 組降低了12.68%，SOD 酶活力比游離BBA 組提高了6.75%，具有顯著性差異。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)花色苷能夠通過激活SOD 抗氧化物酶系統(tǒng)有效保護(hù)肝臟，攝入花色苷可以間接或者直接地清除體內(nèi)的活性氧和自由基，從而改善機(jī)體的血脂異常，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。總體來說，游離BBA 和復(fù)合物均可通過提高SOD 酶活性，提升抗氧化酶系統(tǒng)，從而改善血脂水平，且復(fù)合物的效果強(qiáng)于游離BBA。

圖13 BBA及SPI/AG-BBA復(fù)合物對(duì)細(xì)胞中SOD酶活力和MDA含量的影響Fig.13 Effects of BBA and SPI/AG-BBA complex on SOD activity and MDA content in cells

圖14 不同藥物作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞中SOD酶活力和MDA含量的影響Fig.14 Effects of different drug duration on SOD activity and MDA content in cells

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了大豆分離蛋白/阿拉伯膠-花色苷體系的聚電解質(zhì)復(fù)合物，確定超聲功率180 W、壁材質(zhì)量比為10:4、壁芯質(zhì)量比為10:1、包埋時(shí)間為1.0 h，得到包埋率為66.02%，ζ-電位為19.03 mV，平均粒徑為2.53 μm 的不規(guī)則球狀物，提高了花色苷穩(wěn)定性，并且具有良好的體外緩釋效果。最后，對(duì)比了游離BBA 和SPI/AG-BBA 復(fù)合物的體外降脂活性，發(fā)現(xiàn)SPI/AG-BBA 復(fù)合物的降脂活性優(yōu)于游離BBA，作用48 h 后，SPI/AG-BBA 復(fù)合物組的TG、TC 含量為0.21 mmol/g prot、0.19 mmol/g prot，比游離BBA 組下降了9.70%，14.21%，具有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)比了游離BBA 和SPI/AG-BBA復(fù)合物對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積累模型的降脂作用，為后續(xù)提高活性物穩(wěn)定性和降脂方面的研究提供理論依據(jù)。