唐婷范 李雪松 盧夢(mèng)影 田玉紅 徐紫薇 程昊

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.031

引文格式：唐婷范，李雪松，盧夢(mèng)影，等.陳皮多糖提取工藝及其抗氧化活性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2024，49（5）：183-187，204.

TANG T F， LI X S， LU M Y， et al.Study on extraction technology and antioxidant activity of polysaccharides from tangerine peel[J].China Condiment，2024，49（5）：183-187，204.

摘要：該研究以廣陳皮為原料，利用超聲波輔助提取法提取陳皮多糖，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化陳皮多糖提取工藝并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，建立以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定廣陳皮多糖含量的定量分析方法。采用正交試驗(yàn)以多糖得率為指標(biāo)優(yōu)化工藝參數(shù)：料液比為1∶45（g/mL），提取時(shí)間為10 min，超聲功率為350 W，提取溫度為65 ℃，在此條件下，陳皮多糖得率高達(dá)40.06%。結(jié)果表明，廣陳皮多糖對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的最大清除率為85.19%，對(duì)羥基自由基（·OH）的最大清除率為63.42%。

關(guān)鍵詞：廣陳皮；多糖；提取工藝；抗氧化活性；清除率

中圖分類號(hào)：TS201.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）05-0183-05

Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of

Polysaccharides from Tangerine Peel

TANG Ting-fan， LI Xue-song， LU Meng-ying， TIAN Yu-hong， XU Zi-wei， CHENG Hao*

（Guangxi Liuzhou River Snails Rice Noodles Engineering Technology Research Center， Guangxi

Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources， College of Biological and Chemical

Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： In this study， with Citrus reticulata Blanco. as the raw material， the polysaccharides are extracted from tangerine peel by ultrasonic-assisted extraction method. Single factor test is used to optimize the extraction technology of polysaccharides from tangerine peel and study their antioxidant activities. A quantitative analytical method is established for the determination of polysaccharide content from tangerine peel by phenol-sulfuric acid method with glucose as the standard sample. The technology parameters are optimized by orthogonal test with the yield of polysaccharides as the index： the solid-liquid ratio is 1∶45 （g/mL）， the extraction time is 10 min， the ultrasonic power is 350 W and the extraction temperature is 65 ℃. Under these conditions， the yield of polysaccharides from tangerine peel could reach 40.06%. The results show that the maximum scavenging rate of polysaccharides to 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH·） and hydroxyl radical （·OH） is 85.19% and 63.42% respectively.

Key words： Citrus reticulata Blanco.; polysaccharides; extraction technology; antioxidant activity; scavenging rate

收稿日期：2023-10-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22268012）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2022GXNSFAA035490，2021GXNSFAA220067）

作者簡(jiǎn)介：唐婷范（1988—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化工。

*通信作者：程昊（1980—），男，副研究員，碩士，研究方向：應(yīng)用化學(xué)。

廣陳皮主要來(lái)源于蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑和四會(huì)柑的干燥成熟果皮，其中以新會(huì)陳皮最著名[1-2]，新鮮柑橘果皮自然陳化1年以上，可稱為“陳皮”[3]，其不僅有較高的藥用價(jià)值，而且是傳統(tǒng)香料和調(diào)味佳品[4]。廣陳皮主要由揮發(fā)油、黃酮類化合物、生物堿、多糖等功能成分組成[5-8]。陳皮多糖由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和木糖以及少量鼠李糖組成[9]。隨著陳皮貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果膠多糖中可溶性結(jié)合態(tài)酚酸的含量增加[10]。陳皮果糖具有抗病毒、抗衰老、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等藥理活性[11-14]。

目前最常用的提取多糖的方法是溶劑提取法[15-17]，但該法pH控制不好，易破壞糖苷鍵，使多糖的結(jié)構(gòu)受損，與溶劑提取法相比，超聲波提取法[18]具有工藝簡(jiǎn)單、提取快捷、精密度高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取廣陳皮多糖，考察了料液比、提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度對(duì)陳皮多糖得率的影響，對(duì)廣陳皮中多糖提取工藝及其抗氧化活性進(jìn)行初步研究，充分利用廣陳皮這種傳統(tǒng)香料，提高調(diào)味品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康效益。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

陳皮：購(gòu)于廣東省江門市新會(huì)區(qū)；濃硫酸、L（+）-抗壞血酸：西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖、苯酚、水楊酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司；硫酸亞鐵：廣東臺(tái)山市粵僑化工廠；DPPH·：Wako公司；過(guò)氧化氫：成都市科龍化工試劑廠，以上試劑均為分析純。

1.2? 儀器與設(shè)備

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器? 昆山市超聲儀器有限公司；FA124型電子分析天平、V2000型可見(jiàn)光分光光度計(jì)? 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋? 常州國(guó)華電器有限公司；DXF-200C/D密封性搖擺式粉碎機(jī)? 廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；BPG-9240A型精密鼓風(fēng)干燥箱? 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器? 上海亞榮生化儀器廠；SHB-ⅢS型循環(huán)水式多用真空泵? 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3? 方法

1.3.1? 陳皮的預(yù)處理

將新鮮的陳皮放在40 ℃的烘箱中烘干，經(jīng)粉碎過(guò)40目篩，置于干燥處備用。

1.3.2? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用移液管移取1.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其轉(zhuǎn)移到10.00 mL的容量瓶中，按順序加入1.00 mL超純水、1.00 mL 5%的苯酚溶液，輕輕搖勻以確保其充分混合。向容量瓶中加入5.00 mL濃硫酸，并徹底混合。將混合溶液靜置約10 min，再將容量瓶放入30 ℃的水浴鍋中，保溫20 min后，取出容量瓶，使用超純水定容至刻度線，最后將容量瓶放入冷水中冷卻至室溫。以超純水為參比，在400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定吸收波長(zhǎng)。分別精密吸取0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于5個(gè)10.0 mL容量瓶中，依次加入1.80，1.60，1.40，1.20，1.00 mL超純水，搖勻，用苯酚-硫酸法[19]顯色。采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。以葡萄糖溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

1.3.3? 多糖得率的測(cè)定

使用多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)計(jì)算多糖的得率來(lái)評(píng)估試驗(yàn)的效果。

多糖得率（%）=CVN1 000m×100%。

式中：C為粗提取液中多糖的濃度（mg/mL）；V為提取液的稀釋體積（mL）；N為提取液的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.4? 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1? 料液比

在超聲波提取試驗(yàn)中，固定以下試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行研究：提取時(shí)間為30 min，提取溫度為60 ℃，提取功率為300 W。通過(guò)改變料液比來(lái)確定其對(duì)提取效果的影響，選取了5個(gè)水平，分別是1∶45、1∶55、1∶65、1∶75、1∶85（g/mL），每個(gè)水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.4.2? 提取時(shí)間

在超聲波提取試驗(yàn)中，固定以下試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行研究：提取溫度為60 ℃，料液比為1∶55（g/mL），提取功率為300 W。通過(guò)改變提取時(shí)間來(lái)確定其對(duì)提取效果的影響，選取了5個(gè)水平，分別是10，20，30，40，50 min，每個(gè)水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.4.3? 超聲功率

在超聲波提取試驗(yàn)中，固定以下試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行研究：提取溫度為60 ℃，料液比為1∶55（g/mL），提取時(shí)間為20 min。通過(guò)改變超聲功率來(lái)確定其對(duì)提取效果的影響，選取了5個(gè)水平，分別是300，350，400，450，500 W，每個(gè)水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.4.4? 提取溫度

在超聲波提取試驗(yàn)中，固定以下試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行研究：料液比為1∶55（g/mL），提取時(shí)間為20 min，提取功率為350 W。通過(guò)改變提取溫度來(lái)確定其對(duì)提取效果的影響，選取了5個(gè)水平，分別是55，60，65，70，75 ℃，每個(gè)水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3.5? 陳皮多糖提取條件工藝優(yōu)化

研究以上4個(gè)因素對(duì)陳皮多糖得率的影響，并優(yōu)化提取條件，記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)。利用Origin 2022軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖和正交分析，以確定各因素的主效應(yīng)、交互效應(yīng)和誤差效應(yīng)。

1.3.6? 抗氧化作用

將陳皮多糖粗提液和維生素C配制成0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mg/mL 5種濃度梯度的樣品溶液，然后用移液管分別吸取2.00 mL不同濃度的陳皮多糖樣品溶液和維生素C溶液于試管中，編號(hào)后將2.00 mL 0.20×10-3 mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液與待測(cè)樣液混勻，在避光處反應(yīng)30 min。在517 nm波長(zhǎng)處采用分光光度計(jì)測(cè)定試液的吸光度，記為A1。用無(wú)水乙醇替換DPPH無(wú)水乙醇溶液，將測(cè)得的吸光度記為A2。取蒸餾水和0.20 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液各2.00 mL混勻，在避光處反應(yīng)30 min。測(cè)定該混合溶液的吸光度，記為A0。每個(gè)樣液進(jìn)行3次平行測(cè)定。以無(wú)水乙醇溶液作為空白對(duì)照組，用于校正試驗(yàn)中可能引起的背景干擾。

SDPPH·（%）=1－A1－A2A0×100%。

將陳皮多糖粗提液和維生素C分別配制成0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mg/mL 5種濃度梯度的樣品溶液，然后用移液管分別吸取1.00 mL不同濃度的陳皮多糖樣品溶液和維生素C溶液于10.00 mL容量瓶中，并進(jìn)行編號(hào)。分別加入1.00 mL 0.009 mmol/L的FeSO4溶液和1.00 mL 0.009 mmol/L的水楊酸溶液，混合均勻后加入1.00 mL 8.80 mmol/L的H2O2溶液，最后用超純水定容，在37 ℃條件下水浴保溫30 min。使用可見(jiàn)光分光光度計(jì)，設(shè)置波長(zhǎng)為526 nm，測(cè)得吸光度，記為A1。將H2O2溶液換成超純水，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟，測(cè)得吸光度，記為A2。將樣品溶液換成超純水，測(cè)得吸光度，記為A0。每個(gè)樣液進(jìn)行3次平行測(cè)定，取平均值。以超純水作為空白對(duì)照組，用于校正試驗(yàn)中可能引起的背景干擾。

S·OH（%）=1－A1－A2A0×100%。

配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別運(yùn)用Fenton法和DPPH法[21-23]，測(cè)定各試樣不同濃度時(shí)的A517 nm與A526 nm，并計(jì)算其對(duì)DPPH·和·OH的清除率。

2? 試驗(yàn)結(jié)果

2.1? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收光譜見(jiàn)圖1。

在最大吸收波長(zhǎng)（490 nm）處測(cè)量每個(gè)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

經(jīng)擬合計(jì)算，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=0.033 6X+0.162 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 9，在2～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，吸光度值與葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2? 單因素對(duì)陳皮多糖得率的影響

2.2.1? 料液比對(duì)陳皮多糖得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增大，陳皮多糖的得率呈現(xiàn)先增大后急劇減小的趨勢(shì)。由于溶液中存在某種驅(qū)動(dòng)力，當(dāng)料液比為1∶55（g/mL）時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。隨著料液比的增大，這種驅(qū)動(dòng)力迫使傳質(zhì)速率加快，多糖的浸出量增多。當(dāng)料液比增加到一定程度時(shí)，因?yàn)榱弦合嘀写嬗袧舛炔?，多糖浸出量不再增多反而減少，此時(shí)其他物質(zhì)的浸出量增多，導(dǎo)致多糖得率下降[24]?？紤]到溶劑的體積增加會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)的工作量，因此，選擇1∶55（g/mL）為最佳的料液比。

2.2.2? 提取時(shí)間對(duì)陳皮多糖得率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)陳皮多糖得率有較大影響，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率先升高后降低。當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。這是因?yàn)樵诙虝r(shí)間內(nèi)超聲波處理可以有效地將細(xì)胞破碎得非常小，從而促使多糖向細(xì)胞外擴(kuò)散，提高了提取物中多糖的含量。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波的剪切力和加工時(shí)間逐漸增加，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂降解，引起其他物質(zhì)溶出，可能包括一些非目標(biāo)成分，從而導(dǎo)致多糖得率下降。因此，對(duì)于提取過(guò)程中時(shí)間的控制，需要平衡破碎細(xì)胞和保護(hù)目標(biāo)多糖。過(guò)短的時(shí)間可能無(wú)法充分釋放多糖，而過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間可能導(dǎo)致多糖的損失和降解。將提取時(shí)間控制在20 min可實(shí)現(xiàn)最佳的多糖提取效果。

2.2.3? 超聲功率對(duì)陳皮多糖得率的影響

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，陳皮多糖的得率呈逐漸增加的趨勢(shì)，在350 W時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)超聲功率超過(guò)閾值（350 W）時(shí)，額外的功率可能過(guò)度破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，甚至引起熱效應(yīng)，導(dǎo)致多糖的損失和降解，進(jìn)而導(dǎo)致其他物質(zhì)的浸出量增加，從而使多糖得率下降。因此，合理控制超聲功率可實(shí)現(xiàn)多糖得率最大化。選擇超聲功率為350 W，不僅能有效破壞細(xì)胞壁，釋放多糖，而且能避免過(guò)高的功率對(duì)多糖的損害。

2.2.4? 提取溫度對(duì)陳皮多糖得率的影響

由圖6可知，隨著提取溫度的升高，陳皮多糖的得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在達(dá)到一定溫度（70 ℃）時(shí)，陳皮多糖的得率達(dá)到最大值。如果溫度過(guò)高，多糖的結(jié)構(gòu)和生理活性會(huì)受到一定的影響，溶劑的滲透性和溶解度將大大提高，其他物質(zhì)的浸出也將加快，同時(shí)多糖的結(jié)構(gòu)和組織也會(huì)遭到嚴(yán)重的破壞。當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃并且與超聲波同時(shí)作用時(shí)，陳皮多糖的性質(zhì)發(fā)生了變化。由于高溫會(huì)加快陳皮多糖分子內(nèi)部的熱運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致多糖鏈的斷裂和分解，這種熱不穩(wěn)定性是因?yàn)楦邷啬軌蚱茐亩嗵欠肿又g的鍵，使其失去整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。其次，超聲波的作用也會(huì)對(duì)多糖產(chǎn)生影響。超聲波產(chǎn)生的高頻振動(dòng)和劇烈渦流效應(yīng)會(huì)引起混合均勻性和溫度梯度的變化，從而加劇多糖的降解，這是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械能對(duì)多糖分子施加較大壓力，使其易于斷裂。這兩種作用的疊加導(dǎo)致了陳皮多糖的降解和提取得率的下降。隨著溫度的升高，在超聲波的作用下，多糖分子逐漸失去穩(wěn)定性，造成多糖鏈的斷裂和分解，從而減少了多糖的得率。因此，選擇70 ℃為最佳提取溫度。

2.3? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取時(shí)間、超聲功率和提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，并確定了最優(yōu)的相鄰兩組試驗(yàn)條件。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

通過(guò)分析表2中數(shù)據(jù)，可知不同因素對(duì)陳皮多糖得率的影響程度為料液比>超聲功率>提取時(shí)間>提取溫度。最佳的提取方案為A1B1C2D1，即料液比為1∶45（g/mL），提取時(shí)間為10 min，超聲功率為350 W，提取溫度為65 ℃。根據(jù)最佳工藝條件，測(cè)得多糖得率為40.06%，表明該試驗(yàn)條件使多糖得率達(dá)到最高。

2.4? 抗氧化作用試驗(yàn)結(jié)果

由圖7可知，陳皮多糖的濃度與其對(duì)DPPH·的清除率成正比。隨著陳皮多糖濃度的增加，DPPH·清除率也隨之增加。而維生素C與之不同，隨著維生素C濃度的增加，其對(duì)DPPH·的清除率一直呈平緩趨勢(shì)，無(wú)較大波動(dòng)。在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，維生素C表現(xiàn)出比陳皮多糖更高的清除率。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，陳皮多糖對(duì)DPPH·的清除率最高，為85.19%，而維生素C對(duì)DPPH·的清除率有所下降，這是因?yàn)樵谠囼?yàn)過(guò)程中操作不當(dāng)造成的誤差。在濃度為0.6 mg/mL時(shí)，維生素C表現(xiàn)出最佳的抗氧化活性，能夠有效地清除DPPH·，清除率為95%。維生素C對(duì)DPPH·的清除率高于陳皮多糖。

由圖8可知，陳皮多糖和維生素C的濃度與其對(duì)·OH的清除率成正比。在濃度增大的情況下，·OH清除率也隨之增大。在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，維生素C對(duì)·OH的清除率大于陳皮多糖。在濃度大于0.6 mg/mL后，維生素C對(duì)·OH的清除率逐漸趨于平緩，而陳皮多糖對(duì)·OH的清除率繼續(xù)增大。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，陳皮多糖對(duì)·OH的清除率達(dá)到63.42%，而維生素C對(duì)·OH的清除率達(dá)到99.72%。陳皮多糖對(duì)·OH的清除率一直小于維生素C。

3? 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲波提取法研究了料液比、提取時(shí)間、超聲功率和提取溫度對(duì)廣陳皮多糖提取工藝的影響，并初步討論了廣陳皮多糖的抗氧化活性。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)論：廣陳皮中含有具有抗氧化活性的多糖類成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳提取工藝條件下，多糖的得率為40.06%，說(shuō)明該方法具有較高的提取效率，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。在試驗(yàn)所選的濃度范圍內(nèi)，廣陳皮多糖提取液對(duì)羥基自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除率分別達(dá)到63.42%和85.19%。綜上所述，通過(guò)超聲波提取法提取廣陳皮多糖并評(píng)估其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)廣陳皮中含有多糖類抗氧化成分，并且具有較高的提取效率和一定的自由基清除作用，這為進(jìn)一步研究廣陳皮多糖在食品科學(xué)及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

廣陳皮中的多糖具有良好的抗氧化活性，但本試驗(yàn)對(duì)陳皮多糖的提取還未精細(xì)化，未來(lái)研究將對(duì)多糖進(jìn)一步分離純化，確定其種類和結(jié)構(gòu)性質(zhì)。在天然多糖研究領(lǐng)域，一些方面還未涉及，例如多糖的抑菌性研究、抗輻射研究等。廣陳皮對(duì)人體的毒副作用小，藥用價(jià)值高，具有重要的生物活性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景。通過(guò)利用陳皮多糖的抗氧化活性，可以開(kāi)發(fā)出更多高效的藥物和功能性食品，不僅能夠滿足人們對(duì)美味食品的需求，而且能提供額外的保健功效，促進(jìn)人體健康。

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