周金花,趙燕云,王 瑩,馬雙雙

(1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院,上海 200433;2. 上海市浦東新區(qū)光明中醫(yī)醫(yī)院,上海 201399;3. 鹽城市第三人民醫(yī)院,江蘇 鹽城 224005)

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一,約占所有癌癥病例的11.6%,也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1],其中吸煙、空氣污染、長(zhǎng)期接觸石棉、家族遺傳等是肺癌的主要危險(xiǎn)因素[2]。早期肺癌的臨床癥狀不典型且缺乏特異性診斷方法,大多數(shù)患者在就診時(shí)已是癌癥晚期,嚴(yán)重限制了治療手段的選擇且患者預(yù)后較差[3]。據(jù)報(bào)道,肺癌患者的5年生存率為10%～20%[4]。肺癌患者營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生率高,約40%的肺癌患者在入院時(shí)已確定有營(yíng)養(yǎng)不良[5],61.11%的患者在入院時(shí)已經(jīng)存在營(yíng)養(yǎng)不良的風(fēng)險(xiǎn)[6]。營(yíng)養(yǎng)狀況與肺癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān),因此開(kāi)發(fā)安全有效的腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)改善肺癌患者的預(yù)后具有重大意義。紫蘇是一種一年生唇形科草本植物,具有解表散寒、行氣寬中和安胎的作用[7]。紫蘇種子具有抗氧化、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性[8],紫蘇油是從紫蘇成熟種子中提取的一種高度不飽和的天然油脂,可以預(yù)防心血管疾病,抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究觀(guān)察了含紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)肺癌小鼠的營(yíng)養(yǎng)狀況、免疫功能和腫瘤生長(zhǎng)的影響,以明確該營(yíng)養(yǎng)制劑的作用,為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性裸鼠30只,3～5周齡,體重(20±2)g, 購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。小鼠在海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特殊病原體(SPF)的環(huán)境中飼養(yǎng),室內(nèi)溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度55%～65%,保持12∶12 h光/暗循環(huán),小鼠自由獲取飲水和食物。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得上海長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):CHEC2019-103)。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑 NCI-H460肺癌細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供)。含紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑(為西安力邦制藥有限公司依據(jù)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則設(shè)計(jì)的腫瘤全營(yíng)養(yǎng)配方食品,主要配料為玉米油、亞麻籽油、紫蘇油、中鏈甘油三酯、濃縮乳清蛋白粉、復(fù)合維生素、復(fù)合礦物質(zhì)),每100 g提供能量509 kcal(1 cal=4.184 J);普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑(安素,雅培,主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)),每100 g提供能量450 kcal。

1.3主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司);胰蛋白酶(上?；鶢栴D生物科技公司);碘化丙啶(上海碧云天生物公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物科技公司,貨號(hào)分別為A001-3-2,A003-1-1,A005-1-2);蘇木素、伊紅(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司);Fuji Dri-Chem 3500i全自動(dòng)生化分析儀(Fujifilm Ltd, Japan);CX41正置顯微鏡(OLYMPUS,Japan); 200目的細(xì)胞網(wǎng)篩(北京索萊寶科技有限公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 取NCI-H460肺癌細(xì)胞,使用胰酶消化后重懸于無(wú)血清的培養(yǎng)基中,制備成單細(xì)胞懸液(濃度1×107個(gè)/mL),在每只小鼠右前肢肩部皮下接種0.1 mL細(xì)胞懸液。飼養(yǎng)1周后待皮下腫瘤可觸及時(shí),將小鼠隨機(jī)分為模型組、普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組、紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組,每組10只。模型組小鼠自由進(jìn)食飲水;普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組給予普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑灌胃,紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組給予含紫蘇油的腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑灌胃,持續(xù)4周。根據(jù)先前的研究[10],普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組和紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組小鼠每天所需的能量為731.5 kJ/kg,分4次灌胃,不限飲水。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1小鼠體重 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每3 d測(cè)量1次小鼠體重,稱(chēng)重時(shí)間為8:00-10:00。

1.5.2血清營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和免疫指標(biāo)水平 末次灌胃后的次日,經(jīng)小鼠眼眶后靜脈叢采血0.5 mL,并通過(guò)吸入過(guò)量CO2對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。使用Fuji Dri-Chem 3500i 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)前白蛋白(PAB)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白E(IgE)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平。

1.5.3肝臟組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量 取小鼠肝臟組織,使用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿,按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。

1.5.4腫瘤體積和重量 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每3 d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量1次小鼠皮下腫瘤的大小,并計(jì)算腫瘤體積[腫瘤體積(mm3)=(長(zhǎng)×寬2)/2];實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分離皮下腫瘤,稱(chēng)重并拍照。

1.5.5腫瘤細(xì)胞周期 將200目的細(xì)胞網(wǎng)篩浸泡在含有RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板中,然后將腫瘤置于細(xì)胞網(wǎng)篩中,使用眼科剪將組織剪碎,用2.5 mL注射器活塞的軟頭以打圈的方式研磨組織直至無(wú)明顯組織塊為止。使用PBS沖洗網(wǎng)篩2～3次,并將制備的細(xì)胞懸液用細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾。收集細(xì)胞懸液,300×g離心5 min,將細(xì)胞重懸于Binding Buffer中(濃度1×106個(gè)/mL)。加入400 μL碘化丙啶溶液(濃度為50 μg/mL),在暗處對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min。終止染色后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的DNA含量,分析細(xì)胞在各周期所占百分比。

1.5.6腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況 取小鼠腫瘤組織,用10%福爾馬林溶液固定,梯度濃度乙醇(50%,70%,85%,95%直至純酒精)脫水,2次純二甲苯透明,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片。石蠟切片脫蠟再水化,蒸餾水漂洗,蘇木精染8 min,0.6%氨水反藍(lán),伊紅染液中復(fù)染3 min。切片用無(wú)水酒精脫水,再次使用二甲苯透明,滴加中性樹(shù)膠對(duì)已透明的切片進(jìn)行封片,正置顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1各組肺癌小鼠的體重比較 干預(yù)第15,18,21,24,27天,紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組小鼠體重明顯高于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組小鼠體重均明顯高于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 肺癌各組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重變化

2.2各組肺癌小鼠血清營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)水平比較 普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組血清PAB、TP、ALB、LDL-C水平均明顯高于模型組(P均<0.05), 紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組血清PAB、TP、ALB、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均明顯高于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肺癌各組小鼠血清營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)水平比較

2.3各組肺癌小鼠血清免疫指標(biāo)水平比較 紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組血清IgA、IgM、IgE、IL-2、IL-6、TNF-α水平均明顯高于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),血清TGF-β水平明顯低于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組各指標(biāo)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 肺癌各組小鼠血清免疫指標(biāo)水平比較

2.4各組肺癌小鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量比較 紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組SOD和GSH-Px含量明顯高于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05), MDA含量明顯低于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組SOD、GSH-Px、MDA含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 肺癌各組小鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)含量

2.5各組肺癌小鼠腫瘤體積比較 干預(yù)第9,12,15,18,21,24,27天,紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組小鼠皮下腫瘤體積均明顯小于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 肺癌各組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中腫瘤體積變化

2.6各組肺癌小鼠腫瘤重量比較 紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組小鼠腫瘤重量明顯低于模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組(P均<0.05),模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 肺癌各組小鼠腫瘤重量

2.7各組肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況與模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組相比,紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展受到抑制。見(jiàn)圖5。

圖5 肺癌各組小鼠腫瘤細(xì)胞周期情況

2.8各組肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況 模型組和普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組腫瘤組織呈實(shí)性片狀分布,細(xì)胞核大深染,胞漿豐富;紫蘇油腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)組細(xì)胞核濃縮固染,包漿呈淡紅色。見(jiàn)圖6。

圖6 肺癌各組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

紫蘇具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗過(guò)敏等廣泛的藥理活性,紫蘇葉提取物可以降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化[11];紫蘇葉醇提取物可以抑制結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞增殖、遷移和黏附[12];紫蘇油可以時(shí)間和濃度依賴(lài)性方式抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑是一種加入紫蘇油的高脂高能量低碳水化合物配方制劑,配方中補(bǔ)充了多種氨基酸,如亮氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、β-羥基-β-甲基丁酸鈣等,能夠促進(jìn)蛋白合成并抑制蛋白降解,所含的中鏈甘油三酯能夠快速給機(jī)體供能,紫蘇油中含有的α-亞麻酸具有增強(qiáng)免疫力的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)肺癌小鼠血清TC、TG、HDL-C水平影響不明顯,而紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可明顯提高肺癌小鼠血清TC、TG、HDL-C水平,說(shuō)明紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑主要是通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)代謝為機(jī)體提供更多的能量。在機(jī)體防御反應(yīng)中,IgM作為B細(xì)胞抗原受體的主要成分參與體液免疫;IgA作為黏膜局部抗感染免疫的主要抗體參與機(jī)體的早期防御;IgE作為介導(dǎo)因素參與變態(tài)反應(yīng);TGF-β作為一種免疫抑制因子可以誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,下調(diào)血清中TGF-β水平可以抑制肺癌小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)[14],抑制TGF-β的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)肺癌小鼠血清免疫指標(biāo)水平均沒(méi)有明顯影響,而紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可明顯提高肺癌小鼠血清IgA、IgM、IgE、IL-2、IL-6、TNF-α水平和降低TGF-β水平,表明紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可以改善肺癌小鼠的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)肺癌小鼠體重、腫瘤體積、瘤重及腫瘤組織中細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡影響不明顯,而紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可明顯增加肺癌小鼠的體重,縮小皮下腫瘤體積,減輕瘤重,并抑制腫瘤組織中細(xì)胞周期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示,紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可通過(guò)增加免疫球蛋白(IgA、IgM、IgE)水平和細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、TNF-α)的釋放提高機(jī)體的防御狀態(tài),同時(shí)通過(guò)減少TGF-β的釋放抑制肺癌細(xì)胞增殖,進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用。

氧化應(yīng)激損傷是癌癥的重要危險(xiǎn)因素之一,肝臟作為調(diào)控三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)、脂肪)代謝和抵御氧化應(yīng)激損傷的重要器官在癌癥治療過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。氧化氫酶(CAT)、GSH-Px、SOD是重要的抗氧化物質(zhì),而MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的重要產(chǎn)物是誘導(dǎo)氧化損傷的主要物質(zhì)之一[16]。有研究指出,氧化應(yīng)激與肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞功能密切相關(guān)[17],通過(guò)上調(diào)小鼠肝臟中CAT和GSH-Px的含量可以提高小鼠肝臟抗氧化應(yīng)激的能力,并起到保護(hù)肝臟的作用[18-19]。α-亞麻酸為紫蘇油中最主要的成分,含量高達(dá)61%,大劑量紫蘇油或α-亞麻酸可顯著增強(qiáng)小鼠腦組織中SOD活力,抑制MDA的表達(dá)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑可明顯上調(diào)肺癌小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px含量,明顯降低MDA含量,有助于肺癌小鼠抵御肝臟氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述,紫蘇油腫瘤專(zhuān)用型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑不僅可為肺癌小鼠提供高脂高能量營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)機(jī)體釋放免疫球蛋白及細(xì)胞因子,提高小鼠的防御狀態(tài),減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷,還可抑制腫瘤細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有一定抗癌作用。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。