張前熙，王 超，嚴(yán)鴻林，肖 熠

（1.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院，四川自貢 643000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川成都 611130；3.西南科技大學(xué)，四川綿陽(yáng) 621010）

脂質(zhì)是機(jī)體能量?jī)?chǔ)存和供應(yīng)的重要載體，也是生物膜的重要組成部分，一旦出現(xiàn)脂肪代謝異常，會(huì)引發(fā)多種疾病。在畜牧生產(chǎn)中，骨骼肌脂質(zhì)代謝與動(dòng)物健康、生產(chǎn)性能和產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)，研究脂肪代謝具有重要意義。黃芩（ScutellariaL.）是多年生唇形科草本植物黃芩根莖提取干燥得到的淡黃色粉末，其根部富含黃芩素等多種有益成分，主要成分包括黃酮類化合物、氨基酸、微量元素等（馬垚嘉等，2023）。這些化合物具有抗氧化、抗菌、消炎及免疫調(diào)節(jié)作用（楊婧興等，2022）。目前，黃芩針對(duì)肥胖的治療效果尚不完全明確，前者在脂質(zhì)代謝中的功能還有待揭示。已有證據(jù)表明，作為和脂質(zhì)代謝關(guān)系最密切的信號(hào)通路之一，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路可能受黃酮類化合物激活，暗示其可能是黃芩根提取物在脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)制之一（Foretz等，2018）。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）在AMPK的激活中具有重要角色，前者是AMPK 的上游分子，其作用機(jī)制是激活A(yù)MPK-PPARγ 軸，促進(jìn)脂肪酸氧化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)（Joachim 和Kumar，2010）。因此，本研究首先驗(yàn)證黃芩根提取物處理對(duì)肥胖大鼠的作用，進(jìn)而從APN-AMPK-PPARγ軸入手，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選用24 只6 周齡SPF 雄性SD 大鼠[ 成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-030]，初始體重（200±10）g。全期自由采食和飲水，墊料為消毒玉米芯。預(yù)飼期飼喂普通飼料，試驗(yàn)開始前根據(jù)體重相近原則隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組（CTL）飼喂普通飼料，高脂組（F-CTL）飼喂高脂飼料（基礎(chǔ)飼料78.39%+ 膽固醇10%+ 豬油10%+ 蛋黃粉10%+丙硫氧嘧啶0.61%）。黃芩提取物處理組（TRT）和高脂處理組（F-TRT）分別在CTL 和F-CTL 組基礎(chǔ)上每天用10 g/kg 黃芩根提取物懸液灌胃。同時(shí)，CTL 和F-CTL 組用等量生理鹽水灌胃。灌胃1 mL/ 次，3 次/d。試驗(yàn)為期10 周。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和檢測(cè) 每周對(duì)大鼠進(jìn)行稱重；每?jī)芍苡檬笪察o脈無(wú)創(chuàng)檢測(cè)儀（PowerLab，NIBP System）測(cè)量大鼠尾靜脈血壓，并對(duì)大鼠進(jìn)行下頜穿刺采血，采用血清中的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中血糖和胰島素水平，抗體購(gòu)于某公司。試驗(yàn)結(jié)束后稱重、采血，之后用CO2處死大鼠，采集背闊?。↙atissimus dorsi）、腓腸?。╣astrocnemius muscle），測(cè)量脂聯(lián)素、PPARγ、AMPK 水平和mRNA 表達(dá)量，同時(shí)采用索氏脂肪提取器對(duì)大鼠全身脂肪進(jìn)行提取，計(jì)算體脂率。制備血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和游離脂肪酸水平。

1.2.2 藥材與主要試劑 黃芩提取物（黃芩苷含量85%），西安通江生物科技公司；PCR 引物（表1，Invitrogen）、Real-time PCR 試劑盒（TransGen Biotec，中國(guó)，AQ131-01）、TRIZOL（TransGen Biotec，中國(guó)，AQ131-01）、RNA 溶解液（TransGen Biotec，中國(guó)，H10323）、Elisa 和Western blot 抗體（Invitrogen）、PMSF（上海碧云天，ST505）、Tris-base（Biosharp，BS083）、SDS（Biosharp，BS088）、蛋白marker（Tanon，180-6003）、PVDF膜（0.45μm）（Millipore，IPVH00010）。

表1 RT-PCR 方法檢測(cè)PPARγ、APN、AMPK mRNA 表達(dá)

1.2.3 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)（日立，7600）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI 7500）、電泳儀（Tanon，EPS300）、酶 標(biāo) 儀（Thermo，muLISKA NMK3）、4℃離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5415R）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Graphpad 8.0 軟件進(jìn)行整理，采用單因素方差分析和相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)圖誤差線表示SD 值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和生理生化指標(biāo)變化情況 由圖1A 可知，高脂日糧組（F-CTL、F-TRT）大鼠增重明顯高于普通日糧組（CTL、TRT），表明肥胖模型誘導(dǎo)成功。對(duì)于普通日糧組，黃芩提取物處理并不會(huì)影響大鼠體重。但在高脂日糧誘導(dǎo)的肥胖情況下，黃芩提取物可顯著降低大鼠體重（W8-W10）。相似的，如圖1B-D 所示，黃芩提取物可緩解由高脂日糧誘導(dǎo)的血壓、血糖和胰島素升高。

圖1 大鼠體重、血壓、血糖以及胰島素水平變化

2.2 大鼠體脂及脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)變化情況采食普通日糧情況下，黃芩提取物處理組對(duì)大鼠脂肪沉積，血清三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、游離脂肪酸等脂質(zhì)代謝指標(biāo)均無(wú)顯著影響。但在肥胖模型下，如圖2A-B 所示，黃芩提取物組可顯著降低大鼠體脂率、背闊肌肌肉脂肪占比，對(duì)大鼠腓腸肌肌內(nèi)脂肪沉積無(wú)影響（數(shù)據(jù)未展示）。同時(shí)，在肥胖模型下，黃芩提取物可顯著降低大鼠血清三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和游離脂肪酸水平（表2）。

圖2 大鼠體脂率、骨骼肌脂肪含量、脂聯(lián)素、AMPK 和PPARγ 水平及表達(dá)

表2 大鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 大鼠骨骼肌脂肪沉積關(guān)鍵蛋白水平比較采食高脂日糧條件下，黃芩提取物處理能顯著提高大鼠背闊肌中脂聯(lián)素水平（圖2C）及其mRNA表達(dá)水平（圖2D）。此外，黃芩提取物組顯著提升肥胖大鼠背闊肌中AMPK 和PPARγ 和mRNA表達(dá)水平，而采食普通日糧的大鼠骨骼肌脂聯(lián)素、PPARγ 和AMPK 表達(dá)水平不受黃芩提取物影響（圖2E-F）。同樣，Western blot 檢測(cè)結(jié)果同樣表明黃芩提取物可提升肥胖大鼠脂聯(lián)素、PPARγ和磷酸化AMPK 蛋白在骨骼肌中的含量（圖2G）。

3 討論及結(jié)論

本研究揭示了黃芩根提取物可有效降低高脂日糧誘導(dǎo)的肥胖，有效降低肥胖型高血壓大鼠血脂和低密度脂蛋白膽固醇，并伴隨大鼠脂肪組織中PPARγ、APN、AMPK 信號(hào)通路的激活。已有研究表明，PPARγ-AMPK 信號(hào)通路在脂肪代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Sankaran 等，2019）。PPARγ信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和代謝影響脂肪的積累和分解。PPARγ 激活可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸合成，從而增加脂肪積累。反之，PPARγ 抑制劑可負(fù)調(diào)控這一過程，從而減少脂肪積累（Anavi 等，2012）。此外，PPARγ 激活還可抑制脂肪細(xì)胞的脂肪酸氧化和脂肪酸分解（Brown 等，2013）。結(jié)合本研究結(jié)果，黃芩根提取物可能通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路進(jìn)而抑制PPARγ，減緩脂肪合成途徑，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分解和代謝，這可能是黃芩根提取物降低肥胖大鼠體重的主要作用機(jī)制。

APN 由脂肪組織分泌，是唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞，其可對(duì)機(jī)體的糖脂代謝產(chǎn)生一定的影響（Aye 等，2013）。其可與相應(yīng)受體進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)而對(duì)下游MAPK 信號(hào)通路產(chǎn)生一定的激活作用（Aye 等，2013）。如熱量變化能激活脂肪細(xì)胞分泌APN，從而激活下游通路參與脂質(zhì)代謝調(diào)控（Shinmura 等，2008）。APN 在機(jī)體糖代謝中發(fā)揮著重要作用，在維持能量平衡的同時(shí)還可以提升細(xì)胞抗氧化能力，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和腎臟疾病等，與肥胖、高血壓、糖尿病等具有十分密切的關(guān)系（Aye 等，2013）。另一方面，APN 表達(dá)量在肥胖個(gè)體中顯著降低（Tu 等，2013），表明脂聯(lián)素與肥胖密切相關(guān)。目前已經(jīng)證實(shí)，脂聯(lián)素參與調(diào)節(jié)脂肪代謝和胰島素敏感性，是一種胰島素增敏激素，對(duì)胰島素抵抗具有改善作用（Hotta 等，2001）。鑒于AMPK 途徑是促進(jìn)胰島素敏感性的重要通路，可以推測(cè)黃芩根提取物通過APN-AMPK-PPARγ 軸調(diào)節(jié)胰島素敏感性，從而參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)。此外，本研究顯示，黃芩根提取物降低了血液胰島素含量，但目前并不明確這一變化是脂肪分解代謝的原因還是結(jié)果，尚需進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)胰島素在黃芩根提取物-APN-AMPK-PPARγ 調(diào)節(jié)軸介導(dǎo)下脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)制。綜上所述，黃芩根提取物可通過激活A(yù)PN-AMPK-PPARγ 信號(hào)通路，在脂肪分解代謝中起重要作用，從而降低肥胖及血壓。