范巨峰,芮宏亮,宋 森,張巖崑,范微微,呂 偉,周 璐,李 晶,黃文罡,侯 瑩

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實驗研究

人尿道黏膜上皮細(xì)胞系與脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)復(fù)合培養(yǎng)的實驗研究

范巨峰,芮宏亮,宋 森,張巖崑,范微微,呂 偉,周 璐,李 晶,黃文罡,侯 瑩

目的 探討人尿道黏膜上皮細(xì)胞系與脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)復(fù)合培養(yǎng)的效果。方法 將人尿道黏膜上皮細(xì)胞系接種于脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)上，待細(xì)胞在脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)上生長至鋪滿表面，用活細(xì)胞示蹤劑標(biāo)記細(xì)胞，然后將脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)固定、封片，倒置相差和熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果 人尿道黏膜上皮細(xì)胞系細(xì)胞在脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)上生長，細(xì)胞呈單層生長，活細(xì)胞示蹤劑顯示細(xì)胞生長良好，并具有活細(xì)胞功能。結(jié)論 人尿道黏膜上皮細(xì)胞系是良好的實驗室組織工程化尿道種子細(xì)胞，脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)是良好的實驗室組織工程化尿道支架材料，適用于實驗室組織工程化尿道復(fù)合過程研究。

組織工程; 人尿道黏膜上皮細(xì)胞系; 脫細(xì)胞羊膜基質(zhì); 復(fù)合培養(yǎng)

先天性尿道下裂、反復(fù)手術(shù)失敗型尿道下裂與先天性尿道上裂、陰莖缺損等畸形都存在尿道缺損，需要再造尿道，這是整形外科和泌尿外科共同的治療難題[1-2]。組織工程化尿道的構(gòu)建即應(yīng)用組織工程學(xué)的原理與方法，構(gòu)建具有正常形態(tài)功能的尿道組織，從而達(dá)到修復(fù)缺損與畸形的目的。其相關(guān)研究主要包括4個方面：種子細(xì)胞的研究、支架材料的研究、細(xì)胞與支架的復(fù)合過程研究、組織工程化尿道的構(gòu)建。自2013年3月起，我們的實驗主要探討人尿道黏膜上皮細(xì)胞系(normal human urinary tract epithelial cells, SV-HUC-1)與脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)(human acellular amniotic membrane matrix, HAAM)的復(fù)合過程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 F-12K培養(yǎng)基(美國INVITROGEN公司)；胎牛血清(FBS，美國HYCLONE公司)；青霉素(華北制藥廠)；鏈霉素(華北制藥廠)；胰蛋白酶(美國SIGMA公司)；NaCl分析純、KCl分析純、Na2HPO4分析純、KH2PO4分析純、NaHCO3分析純、苯酚紅(北京化學(xué)試劑公司)；直徑90 mm塑料細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國CORNING公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本NAPCO公司，型號：5410)；超凈操作工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，型號：LD4-2)；高溫烤箱(日本SAKURA公司，型號：HE-21)；微量加樣槍(德國EPPENDORF公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所，型號：JY-96-2)。

1.2 主要溶液配制 ⑴含10%FBS的F-12K培養(yǎng)液：在500 ml的F-12K培養(yǎng)基中，加入青鏈霉素混合液10 ml(青霉素和鏈霉素終濃度分別為100 U/ml和0.1 mg/ml)和FBS 55 ml，分裝后4℃保存。⑵D-Hanks平衡鹽溶液：量取800 ml超純水，依次加入NaCl 8.00 g、KCl 0.40 g、Na2HPO40.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.35 g和苯酚紅0.02 g(電磁攪拌器攪拌，待1種試劑完全溶解后，再加入另一種試劑)，完全溶解后，補(bǔ)足雙蒸水至1000 ml，測定pH 7.2～7.4，分裝，高壓(100～150 kPa)滅菌20 min，室溫冷卻，-20℃保存。⑶胰蛋白酶(0.05%)EDTA(0.02%)溶液：量取D-Hanks平衡鹽溶液300 ml，加入胰蛋白酶 0.25 g，電磁攪拌器攪拌，直至完全溶解；另外量取D-Hanks平衡鹽溶液200 ml，加入EDTA 0.10 g，電磁攪拌器攪拌，直至完全溶解，混合2種溶液，以NaHCO3調(diào)節(jié)pH 7.4，用不銹鋼正壓膜過濾系統(tǒng)除菌后，分裝，-20℃保存，4℃?zhèn)溆?。⑷?xì)胞凍存液：分別量取F-12K培養(yǎng)液7 ml、DMSO 1ml和FBS 2 ml，混合均勻，配制成含20%FBS、10%DMSO的凍存液，-20℃保存，室溫備用。

1.3 實驗方法 ⑴種子細(xì)胞制備：將生長至70%融合的SV-HUC-1細(xì)胞以PBS清洗2遍，0.25%胰酶-EDTA消化3 min后加入終止液，然后吸入離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，留取細(xì)胞備用。⑵支架材料制備：羊膜脫細(xì)胞過程，通過鈍性分離胎盤羊膜后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，培養(yǎng)皿中甘油浸泡3次，用生理鹽水反復(fù)沖洗羊膜，用胰酶消化羊膜表層的細(xì)胞，振蕩、沖洗制成HAAM置于磷酸鹽緩沖液中，制成脫細(xì)胞羊膜。將HAAM在含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基中浸泡1 h，然后鋪于培養(yǎng)皿底部。⑶種子細(xì)胞與支架材料的復(fù)合：將第10代傳代SV-HUC-1細(xì)胞按1×106/cm2，接種于HAAM上，置于培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，待細(xì)胞在HAAM上生長至鋪滿表面，用活細(xì)胞示蹤劑標(biāo)記細(xì)胞，然后將HAAM固定、封片，于倒置相差和熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

SV-HUC-1細(xì)胞在HAAM上生長，細(xì)胞呈單層生長，活細(xì)胞示蹤劑顯示細(xì)胞生長良好。倒置相差顯微鏡觀察顯示，HAAM上和非羊膜部分的細(xì)胞生長良好，形態(tài)規(guī)整；倒置熒光顯微鏡顯示，生長在HAAM上的SV-HUC-1細(xì)胞存活良好(圖1)。

3 討論

尿道下裂是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)先天性畸形，手術(shù)矯治是目前治療尿道下裂的唯一有效方法，但治療難度大，手術(shù)并發(fā)癥相對較高。目前尿道下裂的手術(shù)方法主要包括：尿道口前移陰莖頭成形術(shù)；以Danis-Browne法為代表的陰莖皮條埋藏法；以帶蒂陰莖、陰囊皮瓣修復(fù)尿道的手術(shù)方法；以膀胱黏膜、口腔頰黏膜等游離代替物修復(fù)尿道的手術(shù)方法等。而無論應(yīng)用哪種手術(shù)方式，術(shù)后并發(fā)癥均嚴(yán)重影響了尿道下裂的治療效果。組織工程學(xué)的興起為組織或器官的重建開辟了新的途徑。其方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)活細(xì)胞種植于天然的或人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)上，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，將他們移植到體內(nèi)，以達(dá)到重建新的有功能性組織的目的[3-4]，其核心內(nèi)容是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體[5-6]。與傳統(tǒng)的修復(fù)尿道方法相比，組織工程化尿道具有諸多優(yōu)點：其組織結(jié)構(gòu)為正常尿道黏膜，無論用于再造尿道或修復(fù)尿道缺損，其內(nèi)環(huán)境更接近于正常尿道環(huán)境，更符合正常人體生理要求；在治療過程中不增加新的創(chuàng)傷，減少患者的痛苦；可以大大降低尿道狹窄、毛發(fā)生長、結(jié)石形成等手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率[5-6]。隨著氣管、血管等組織工程化人體空腔器官的研究進(jìn)展，對組織工程化尿道的相關(guān)研究逐漸得到重視并成為未來的發(fā)展趨勢。

圖1 SV-HUC-1細(xì)胞在HAAM上生長 a,b. HAAM上和非羊膜部分的細(xì)胞生長良好，形態(tài)規(guī)整(倒置相差顯微鏡 ×10) c,d. HAAM上SV-HUC-1細(xì)胞存活良好(倒置熒光顯微鏡 ×20)
Fig 1 SV-HUC-1 on human acellular amniotic membrane matrix (HAAM). a,b. cells grew well on SIS and iSIS, cell morphology was regular form (inverted phase contrast microscope ×10). c,d. SV-HUC-1 grew well on HAAM (inverted fluorescence microscope ×20).

在應(yīng)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建尿道過程中，選擇合適的種子細(xì)胞是確保研究實施的重要條件。直接取自人體或動物的成體膀胱黏膜上皮細(xì)胞和尿道黏膜上皮細(xì)胞是常用的構(gòu)建組織工程化尿道的種子細(xì)胞。來自泌尿系統(tǒng)的上皮細(xì)胞是最適宜用于尿道組織工程的種子細(xì)胞，但取自人體或動物的成體泌尿系上皮細(xì)胞在經(jīng)歷若干代傳代后性質(zhì)發(fā)生較大變化，雖然有研究報道在較短的時間內(nèi)獲得大量擴(kuò)增的尿道黏膜上皮細(xì)胞用于組織工程化尿道的構(gòu)建[7]，但多數(shù)研究在應(yīng)用人體或動物成體細(xì)胞作為種子細(xì)胞時，在體外培養(yǎng)其傳代多為10代以內(nèi)，之后細(xì)胞發(fā)生不同程度的變性[8-10]，成為組織工程化尿道進(jìn)一步研究的“瓶頸”。本研究旨在探討組織工程種子細(xì)胞與支架材料的復(fù)合過程，需要1種可以反復(fù)傳代而不發(fā)生變性的尿道黏膜上皮種子細(xì)胞，繞過成體細(xì)胞難以大量傳代這一難以避免的事實對整個實驗過程的干擾，使實驗順利的進(jìn)行。因此，本實驗選用SV-HUC-1作為種子細(xì)胞，這種細(xì)胞來源于泌尿系上皮細(xì)胞，其特點是在多次傳代后仍能夠保持原有的細(xì)胞性質(zhì)。在前期實驗中我們已經(jīng)證實，SV-HUC-1細(xì)胞在經(jīng)過體外培養(yǎng)20代后，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞形態(tài)正常；經(jīng)細(xì)胞鑒定提示，泌尿系細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin和CK-18的mRNA表達(dá)正常；經(jīng)活細(xì)胞示蹤劑示綜顯示，細(xì)胞活性良好。證實SV-HUC-1經(jīng)體外培養(yǎng)多次傳代后仍保持原有細(xì)胞特性，是適合用于尿道組織工程實驗研究的理想種子細(xì)胞[11]。本實驗應(yīng)用經(jīng)過體外培養(yǎng)10代后的SV-HUC-1作為種子細(xì)胞。

生物支架材料在組織工程研究中同樣起重要作用，組織工程中所用的支架材料包括合成材料和天然生物材料。合成材料的優(yōu)點是能大量生產(chǎn)并可根據(jù)需要設(shè)計材料的特性，但缺點是組織相容性差，可引起不同程度的炎癥反應(yīng)，而且這些材料上培養(yǎng)的細(xì)胞和構(gòu)建的組織，在結(jié)構(gòu)和功能上都與體內(nèi)情況不完全相同。而天然細(xì)胞外基質(zhì)因其演變過程與臨床實際情況近似，在體內(nèi)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)良好，且細(xì)胞親和性好，所以更適用于組織工程[12-13]。目前較為常用的方法是采用單純脫細(xì)胞的膠原筋膜，經(jīng)修剪后，植入缺損尿道進(jìn)行修復(fù)。如果尿道缺損過長，面積過大，單純采用脫細(xì)胞膠原筋膜修復(fù)，效果不甚理想[14]。膀胱黏膜下層和小腸黏膜下層常被用作尿路組織的修復(fù)材料，但單獨作為移植物時，容易發(fā)生攣縮現(xiàn)象。理想的生物支架應(yīng)具有如下條件：良好的組織相容性；可降解性和降解速率的可控性；無抗原作用；三維立體結(jié)構(gòu)，能夠提供細(xì)胞黏附和生長空間；易塑形并有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖、轉(zhuǎn)移和分化。脫細(xì)胞羊基質(zhì)是通過生物化學(xué)方法，去除組織中的細(xì)胞和抗原成分，保留細(xì)胞外基質(zhì)框架，其特殊的組織結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞黏附和生長。因其特有的結(jié)構(gòu)特點和促進(jìn)組織修復(fù)的生物學(xué)基礎(chǔ)，具備上述理想生物支架材料的各種特點，已成為國內(nèi)外組織工程研究常用的支架材料選擇。新鮮人羊膜具有5層結(jié)構(gòu)：上皮細(xì)胞層、基底膜、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層。羊膜具有以下特點：含有纖維粘連素、層粘連素、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、其他蛋白多糖大分子和多種細(xì)胞生長因子，如表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子,有促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化等重要功能，羊膜基底膜易于誘導(dǎo)上皮細(xì)胞移行長入,增強(qiáng)上皮細(xì)胞的黏附性,促進(jìn)上皮的分化、增殖,阻止上皮細(xì)胞凋亡，并含有多種蛋白酶抑制劑,通過抑制相應(yīng)的蛋白酶而發(fā)揮抗炎作用[15]。因脫掉細(xì)胞成分后羊膜基質(zhì)無免疫原性，所含的Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及硫酸肝素蛋白多糖等成分有利于種子細(xì)胞黏附、移行及上皮化，防止細(xì)胞凋亡，而且羊膜來源廣泛，取材方便，易于處理和保存[15]，是一種理想的生物支架。

本實驗發(fā)現(xiàn)，SV-HUC-1在HAAM上可以生長良好，與支架材料復(fù)合良好。證實SV-HUC-1是良好的實驗室組織工程化尿道種子細(xì)胞，HAAM是良好的組織工程化尿道支架材料，適用于實驗室組織工程化尿道復(fù)合過程研究。本研究通過觀察人尿道黏膜上皮細(xì)胞系與HAAM復(fù)合培養(yǎng)的效果，為今后組織工程化尿道的復(fù)合階段研究提供了可靠的前期研究基礎(chǔ)。

[1] 范巨峰, 李森愷, 李養(yǎng)群, 等. 再造尿道組織材料的易感染性研究[J]. 中華整形外科雜志, 2005,21(2):132-134.

[2] Kozinn SI, Harty NJ, Zinman L, et al. Management of complex anterior urethral strictures with multistage buccal mucosa graft reconstruction[J]. Urology, 2013,82(3):718-723.

[3] Salgado AJ, Oliveira JM, Martins A, et al. Tissue engineering and regenerative medicine: past, present, and future[J]. Int Rev Neurobiol, 2013,108C:1-33.

[4] Simaioforidis V, de Jonge P, Sloff M, et al. Ureteral tissue engineering: where are we and how to prceed? [J]. Tissue Eng Part B Rev, 2013,19(5):413-419.

[5] Pokrywczynska M, Jundzill A, Adamowicz J, et al. Tissue engineering-experimental method of urinary bladder regeneration[J]. Postepy Hig Med Dosw (Online), 2013,67:790-799.

[6] Alberti C. Tissue engineering as innovative chance for organ replacement in radical tumor surgery[J]. Eur Rrv Med Pharmacol Sci, 2013,17(5):624-631.

[7] Wood D. Reach for the sky-tissue engineering in urology[J]. BJU Int, 2013,112(6):708.

[8] 傅 強(qiáng), 鄧晨亮, 殷德明, 等. 脫細(xì)胞基質(zhì)載體和表皮細(xì)胞結(jié)合構(gòu)建尿道的實驗研究[J]. 中華泌尿外科雜志, 2006,27(4):128-130.

[9] Zhang Y, Atala A. Urothelial cell culture[J]. Methods Mol Biol, 2013,1037:27-43.

[10] Xie M, Song L, Fan S, et al. Evaluation of stretched electrospun silk fibroin matrices seeded with urothelial cells for urethra reconstruction[J]. J Surg Res, 2013,184(2):774-781.

[11] 范微微, 呂 偉, 范巨峰. 人正常泌尿系上皮細(xì)胞系作為組織工程化尿道種子細(xì)胞的可行性研究[J]. 中國美容醫(yī)學(xué), 2012,21(3):433-435.

[12] Nuininga JE, van Moerkerk H, Hanssen A, et al. A rabbit model to tissue engineer the bladder[J]. Biomaterials, 2004,25(9):1657-1661.

[13] Palmer BW, Kropp BP. Update on tissue engineering in pediatric urology[J]. Curr Urol Rep, 2013,14(4):327-332.

[14] Singh SK, Agrawal SK, Mavuduru RS. Management of the stricture of fossa navicularis and pendulous urethral strictures[J]. Indian J Urol, 2011,27(3):371-377.

[15] 高 振, 羅曉婷, 鄧 煒, 等. 羊膜與羊膜細(xì)胞外基質(zhì)在組織工程中的應(yīng)用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2007,11(32):6450-6453.

Research of composite culture of human urinary tract epithelial cells with human coacellular amniotic membrane matrix

FANJu-feng,RUIHong-liang,SONGSen,ZHANGYan-kun,FANWei-wei,LYUWei,ZHOULu,LIJing,HUANGWen-gang,HOUYing.

(DepartmentofPlasticSurgery,BeijingChaoyangHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Objective To discuss the effect of composite culture of normal human urinary tract epithelial cells (SV-HUC-1) with human acellular amniotic membrane matrix (HAAM). Methods SV-HUC-1 was inoculated on human acellular amniotic membrane matrix and the cells were tracked with viable cell tracer when growing on the surface of the amniotic membrane matrix. Then, the cells were observed with inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope. Results SV-HUC-1 grew well on HAAM with normal monolayer morphology, which was proven by viable cell tracer. Conclusion SV-HUC-1 is a desirable seed cell for urinary tract tissue engineering and grows well on HAAM.

Tissue engineering; Normal human urinary tract epithelial cells; Human acellular amniotic membrane matrix; Composite culture

北京市科技新星(2005B04)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次人才(2011-3-019)；北京市衛(wèi)生局“十百千”人才計劃

100020 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 整形外科(范巨峰, 張巖崑, 范微微, 呂 偉, 周 璐, 李 晶, 黃文罡, 侯 瑩);衛(wèi)生部中日友好臨床研究所 中心實驗室(芮宏亮);清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(宋 森)

范巨峰(1971-)，男，遼寧大連人，主任醫(yī)師，博士后.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.018

R318.08

A

1673-7040(2016)04-0246-04

2015-11-14)