王甜甜 王爽 李玲

［摘要］ ?目的探討黃芩素對(duì)自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）模型小鼠心肌組織纖維化的影響及其機(jī)制。

方法將20只BalB/C小鼠隨機(jī)分為空白組、EAM組、黃芩素組、地塞米松組，每組5只。在飼養(yǎng)至第0、7天時(shí)，除空白組小鼠外余均皮下注射200 μL完全弗氏佐劑與α-MyHC肽混合乳劑，飼養(yǎng)至第8天時(shí)開(kāi)始對(duì)EAM組、黃芩素組及地塞米松組小鼠分別給予羧甲基纖維素鈉、黃芩素、地塞米松灌胃，給藥至第21天時(shí)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）及收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）。第21天時(shí)將各組小鼠脫頸處死后取心臟組織進(jìn)行HE染色和Masson染色；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）和免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠心臟組織中的膠原Ⅰ（CollagenⅠ）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、白細(xì)胞介素17A（IL-17A）、Treg轉(zhuǎn)錄因子（FOXP3）及白細(xì)胞介素10（IL-10）的mRNA及蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果超聲心動(dòng)圖顯示，黃芩素組小鼠LVEF、LVFS顯著高于EAM組（F=51.55、35.38，q=8.08、5.97，P<0.05），LVIDd、LVIDs顯著低于EAM組（F=4.64、17.72，q=2.88、4.77，P<0.05）。HE及Masson染色結(jié)果顯示，黃芩素組及地塞米松組小鼠心臟組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和膠原纖維的沉積較EAM組有所改善。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，黃芩素組及地塞米松組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例顯著低于EAM組（F=6.80，q=3.60、3.06，P<0.05）。RT-qPCR結(jié)果顯示，黃芩素組小鼠心臟組織中CollagenⅠ、IL-17A mRNA水平顯著低于EAM組（F=112.40、77.49，q=14.57、8.27，P<0.05），MMP-1、FOXP3、IL-10 mRNA水平顯著高于EAM組（F=19.05～144.60，q=5.37～11.21，P<0.05）。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，黃芩素組小鼠心臟組織中CollagenⅠ、IL-17A蛋白表達(dá)顯著低于EAM組（F=13.70、13.97，q=4.72、5.64，P<0.05），MMP-1、FOXP3、IL-10蛋白表達(dá)顯著高于EAM組（F=6.77～17.21，q=3.32～6.14，P<0.05）。

結(jié)論黃芩素通過(guò)調(diào)控脾臟中Th17/Treg平衡減輕EAM小鼠心肌損傷，進(jìn)而減輕心肌組織纖維化進(jìn)程。

［關(guān)鍵詞］ ?心肌炎；自身免疫疾??；纖維化；黃芩苷；Th17細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；基因表達(dá)調(diào)控；小鼠

［中圖分類號(hào)］ ?R542.21;R593.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ ?A

Effect of baicalein on fibrosis of myocardial tissue in EAM model mice

WANG Tiantian， WANG Shuang， LI Ling

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］?Objective?To explore the effect of baicalein on myocardial fibrosis in experimental autoimmune myocarditis （EAM） mice and its mechanism.

Methods?Twenty BalB/C mice were divided into blank group， EAM group， baicalein group， and dexamethasone group， with 5 mice in each group. On days 0 and 7， all the mice except those in the blank group were subcutaneously injected with 200 μL of complete Freunds adjuvant and α-MyHC peptide emulsion. Starting from day 8， the mice in the EAM group， baicalein group， and dexamethasone group were intragastrically administered sodium carboxymethyl cellulose， baicalein， and dexamethasone， respectively. Echocardiography was performed on day 21 of administration to determine left ventricular ejection fraction （LVEF）， shortening fraction （LVFS）， left ventricular end-diastolic internal diameter （LVIDd）， and left ventricular end-systolic internal diameter （LVIDs） in mice across all groups. On day 21， the mice from all groups were euthanized by cervical dislocation and their heart tissues were collected for HE staining and Masson staining. Flow cytometry was used to detect the proportion of Th17/Treg cells among the splenocytes. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot were used to analyze the mRNA and protein expression of Collagen Ⅰ， matrix metalloproteinase-1 （MMP-1）， interleukin 17A （IL-17A）， Treg transcription factor （FOXP3）， and IL-10 in the cardiac tissue of mice.

Results?Echocardiographic results showed that the LVEF and LVFS of mice in baicalein group were significantly higher than those in the EAM group （F=51.55，35.38，q=8.08，5.97，P<0.05）， while LVIDd and LVIDs were significantly lower than the EAM group （F=4.64，17.72，q=2.88，4.77，P<0.05）. HE and Masson staining showed that infiltration of inflammatory cells and deposition of collagen fibers in the cardiac tissue of mice were significantly mitigated in the baicalein and dexamethasone groups as compared with the EAM group. Flow cytometry showed that the proportion of Th17/Treg cells was significantly higher in the EAM group than in the baicalein and dexamethasone groups （F=54.75，q=3.60，3.06，P<0.05）. RT-qPCR showed that the mRNA levels of Collagen Ⅰ and IL-17A in the heart tissue of mice were significantly lower in the baicalein group than in the EAM group （F=112.40，77.49，q=14.57，8.27，P<0.05）， while the mRNA levels of MMP-1， FOXP3， and IL-10 were significantly higher in the baicalein group than in the EAM group （F=19.05-144.60，q=5.37-11.21，P<0.05）. Western blot showed that the expression of Collagen Ⅰ and IL-17A was significantly lower in the heart tissue of mice in the baicalein group than that in the EAM group （F=13.70，13.97，q=4.72，5.64，P<0.05）， while the expression of MMP-1， FOXP3， and IL-10 was significantly higher in the baicalein group than in the EAM group （F=6.77-17.21，q=3.32-6.14，P<0.05）.

Conclusion?Baicalein alleviates myocardial damage in EAM mice by regulating the balance between Th17/Treg in the spleen， thereby reducing the progression of myocardial tissue fibrosis.

［KEY WORDS］?Myocarditis; Autoimmune diseases; Fibrosis; Baicalein; Th17 cells; T-lymphocytes， regulatory; Gene expression regulation; Mice

心肌炎是指以心肌局限性或彌漫性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的疾?。?］。在心肌炎發(fā)病期間，炎癥細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)可引起心肌損傷［2］，炎癥后期會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于心肌纖維化的治療以減輕心肌組織炎癥損傷為主，以求減少心肌組織纖維化。Th17和Treg是CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)亞群，其中Th17細(xì)胞主要起促炎作用，Treg細(xì)胞與抑炎反應(yīng)相關(guān)［3］。Th17通過(guò)分泌白細(xì)胞介素17（IL-17）促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Treg則通過(guò)分泌白細(xì)胞介素10（IL-10）抑制炎癥反應(yīng)。在心力衰竭患者的外周血中，Th17細(xì)胞的比例增加，Treg細(xì)胞的比例減少，Th17/Treg細(xì)胞的比例失衡從而加重了心肌纖維化［4］。黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗纖維化等多種藥理作用和生物活性［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可以通過(guò)調(diào)控Th17/Treg的平衡緩解結(jié)腸炎的進(jìn)展［7］，并通過(guò)調(diào)控TGF-β1和p-Smad2/3的表達(dá)減輕肺纖維化［8-9］。目前關(guān)于黃芩素抑制心臟組織纖維化的研究較少，本研究通過(guò)構(gòu)建自身免疫性 心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）小鼠模型，并使用黃芩素對(duì)小鼠進(jìn)行治療，以探討黃芩素對(duì)EAM模型小鼠心肌組織纖維化的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

完全弗氏佐劑（CFA）購(gòu)買于上海Sigma公司，α-MyHC肽購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，黃芩素購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，地塞米松、蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒、山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG購(gòu)買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Masson染色試劑盒（G1346）購(gòu)買于北京索萊寶生物科技有限公司，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA、鼠抗CD4、鼠抗CD3、鼠抗CD25、鼠抗Treg轉(zhuǎn)錄因子（FOXP3）、鼠抗IL-17A購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，兔抗Ⅰ型膠原α1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、IL-10抗體購(gòu)自北京Bioss公司，兔抗FOXP3抗體購(gòu)自成都正能生物技術(shù)有限公司，GAPDH KC-5G5購(gòu)自上海Aksomics公司，PAGE快速凝膠試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物技術(shù)有限公司，MolPure細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×q3SYBR qPCR Master Mix試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物技術(shù)有限公司，BalB/C小鼠購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.2 EAM小鼠模型構(gòu)建及分組

將雄性6～8周齡的BalB/C 小鼠（體質(zhì)量18～20 g）隨機(jī)分為空白組、EAM組、黃芩素組、地塞米松組，每組5只，飼養(yǎng)在青島大學(xué)SPF級(jí)別鼠房，保持恒溫恒濕環(huán)境，12 h/12 h晝夜光照。飼養(yǎng)至第0、7天時(shí)，除空白組小鼠，余均將CFA和α-MyHC肽混合乳劑200 μL于腹股溝及腋窩處皮下注射。飼養(yǎng)至第8天開(kāi)始，EAM組小鼠給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.1 mL灌胃，黃芩素組小鼠給予0.5%羧甲基纖維素鈉+黃芩素150 mg/kg共0.1 mL灌胃，地塞米松組小鼠給予0.5%羧甲基纖維素鈉+地塞米松0.5 mg/kg共0.1 mL灌胃，持續(xù)給藥至第21天。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠心功能指標(biāo)

第21天麻醉小鼠使其鎮(zhèn)靜，使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（VINNO6LAB）對(duì)小鼠進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。通過(guò)胸骨旁短軸和長(zhǎng)軸視圖獲得二維和M型超聲心動(dòng)圖圖像，測(cè)量小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。

1.4 各組小鼠心肌組織HE及Masson染色

進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后將所有小鼠脫頸處死，取心臟部分固定脫水、透明、浸蠟包埋、切片并烘干后，按照HE及Masson染色試劑盒說(shuō)明書要求的步驟進(jìn)行染色，封片后在正置顯微鏡下拍照。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例

將各組小鼠脫頸處死后取出脾臟，無(wú)菌條件下研磨制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種到96孔板中，每孔加入0.2 μg α-MyHC肽、0.12 μg BFA及100 μL含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 h，隨后1 000 r/min離心5 min，棄上清液。進(jìn)行Th17染色，鼠抗CD4、鼠抗CD3胞外染色共30 min，再次以1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.2% Triton X-100破膜，然后鼠抗IL-17A胞內(nèi)染色30 min。進(jìn)行Treg染色，鼠抗CD4、鼠抗CD3以及鼠抗CD25胞外染色共30 min，胞外染色結(jié)束以后，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.2% Triton X-100破膜，然后鼠抗FOXP3胞內(nèi)染色1 h。染色結(jié)束以后使用200目銅網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，使用Beckman CytoFLEX進(jìn)行上樣檢測(cè)，最后再采用FlowJo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)各組小鼠的心臟組織中膠原Ⅰ（CollagenⅠ）、MMP-1、IL-17A、FOXP3及IL-10的mRNA表達(dá)水平使用MolPure細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取各組小鼠心臟組織的總RNA并且轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)說(shuō)明書使用2×q3SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2－△△CT法。引物序列見(jiàn)表1。

1.7免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠心臟組織中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10蛋白相對(duì)表達(dá)量用電子秤分別稱取各組小鼠心臟組織20 mg，組織剪剪碎后加入200 μL RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的混合物，在研磨管中進(jìn)行研磨，結(jié)束后靜置5 min，將液體吸出至新的1.5 mL EP管中，以11 832 r/min離心5 min，取上清液。加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮10 min，得到蛋白樣品。用15.0%或12.5%的SDA-PAGE將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST洗3次，將膜分別與一抗CollagenⅠ（1∶1 000）、MMP-1（1∶1 000）、IL-17A（1∶500）、FOXP3（1∶1 000）、IL-10（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜，用TBST洗3次后與二級(jí)HRP偶聯(lián)抗體（1∶1 000）在室溫下孵育2 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒配制顯色液，將條帶置于VILBER顯影儀進(jìn)行曝光拍照并分析條帶的灰度值，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以 ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較比較采用Dunnett t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) ?果

2.1 黃芩素對(duì)EAM小鼠心功能的影響

超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，空白組、黃芩素組及地塞米松組的LVEF、LVFS均顯著高于EAM組（F=51.55、35.38，q=5.96～11.00，P<0.05）；空白組及黃芩素組的LVIDd、LVIDs明顯低于EAM組（F=4.64、17.72，q=2.88～6.30，P<0.05），地塞米松組的LVIDs明顯低于EAM組（F=17.72，q=6.27，P<0.05），但LVIDd與EAM組無(wú)明顯差異（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 黃芩素對(duì)EAM小鼠心肌組織炎癥反應(yīng)和纖維化的影響

HE及Masson染色結(jié)果顯示，空白組小鼠心肌組織中無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積，EAM組小鼠心肌組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積，黃芩素組和地塞米松組心肌組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積較EAM組明顯減少（圖1）。

2.3黃芩素對(duì)EAM小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組、EAM組、黃芩素組、地塞米松組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例分別為（0.29±0.10）%、（0.30±0.07）%、（0.16±0.03）%、（0.08±0.04）%。黃芩素組、地塞米松組小鼠脾細(xì)胞Th17/Treg比例明顯低于EAM組（F=6.80，q=3.60、3.06，P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4黃芩素對(duì)EAM小鼠心臟組織中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10 mRNA水平影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組、黃芩素組、地塞米松組小鼠心臟組織中CollagenⅠ、IL-17A水平明顯低于EAM組（F=112.40、77.49，q=8.27～15.91，P<0.05）；黃芩素組MMP-1、FOXP3、IL-10水平明顯高于EAM組（F=19.05～144.60，q=5.37～11.21，P<0.05）；地塞米松組FOXP3、IL-10水平也明顯高于EAM組（F=19.05、144.60，q=4.36、10.32，P<0.05），MMP-1水平與EAM組無(wú)明顯差異（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.5黃芩素對(duì)EAM小鼠心臟組織中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10蛋白表達(dá)水平影響

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組、黃芩素組、地塞米松組小鼠心臟組織中CollagenⅠ、IL-17A蛋白表達(dá)水平顯著性低于EAM組（F=13.70、13.97，q=4.61～5.95，P<0.05）；黃芩素組MMP-1、IL-10、FOXP3蛋白表達(dá)水平明顯高于EAM組（F=6.77～17.21，q=3.32～6.14，P<0.05）；地塞米松組小鼠心臟組織中FOXP3、MMP-1、IL-10蛋白水平與EAM組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)表4、圖3。

3 討 ?論

心肌纖維化的特征是心肌中成纖維細(xì)胞募集介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白進(jìn)行性積累，心肌纖維化主要發(fā)生在心力衰竭后期［10-12］。有研究認(rèn)為炎癥細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子形成炎癥微環(huán)境，激活成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致心肌纖維化的形成［13］。既往研究表明，黃芩素可通過(guò)調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞比例減輕結(jié)腸炎臨床癥狀［7］，還可抑制不同原因?qū)е碌姆卫w維化和腎纖維化進(jìn)展［14-15］，而黃芩素是否可以抑制EAM小鼠心肌組織纖維化研究較少。心肌纖維化與心功能障礙緊密相關(guān)，判斷心功能障礙的指標(biāo)包括LVEF、LVFS、LVDId、LVIDs等，LVEF、LVFS降低以及LVIDd、LVIDs升高均表明左心室收縮功能的減弱。WANG等［16］通過(guò)采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)EAM小鼠上述指標(biāo)，證明巴西多芬可以減輕EAM引發(fā)的小鼠心功能障礙。本實(shí)驗(yàn)中，EAM組小鼠的LVEF以及LVFS明顯低于黃芩素組，LVIDd、LVIDs則明顯高于黃芩素組，表明黃芩素可以明顯減輕EAM小鼠心功能障礙。HE及Masson染色結(jié)果顯示，黃芩素組及地塞米松組小鼠心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積較EAM組明顯減少，從組織學(xué)上體現(xiàn)了黃芩素對(duì)EAM小鼠心肌組織纖維化的緩解作用。在心肌纖維化小鼠中，心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度激活后分泌較多膠原蛋白，以Collagen Ⅰ為主，而具有膠原蛋白降解功能的MMP活性下降，引起膠原降解減慢，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中大量膠原纖維沉積，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生纖維化。本研究中RT-qPCR及免疫印跡結(jié)果顯示，EAM小鼠心臟組織中CollagenⅠ表達(dá)水平較高，而黃芩素及地塞米松干預(yù)后CollagenⅠ的表達(dá)明顯下降，EAM小鼠心臟組織中MMP-1的mRNA及蛋白表達(dá)較低，而黃芩素干預(yù)后其表達(dá)明顯上調(diào)，地塞米松干預(yù)后MMP-1的mRNA及蛋白表達(dá)與EAM組則無(wú)明顯差異。因此，黃芩素干預(yù)可以降低EAM小鼠心臟組織中CollagenⅠ的表達(dá)，增加MMP-1的表達(dá)，進(jìn)而減少EAM小鼠心肌組織纖維化。

炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與心肌纖維化發(fā)生有著密不可分的關(guān)系。EAM小鼠心肌組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)主要和CD4+T細(xì)胞有關(guān)［17］。Th17與Treg細(xì)胞之間平衡紊亂發(fā)生在多種疾病中，如Th17/Treg比值在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥和自身免疫性結(jié)腸炎患者中顯著升高［18-20］。為探討黃芩素干預(yù)后EAM小鼠心肌纖維化減輕機(jī)制，本研究于小鼠飼養(yǎng)后第21天檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例，結(jié)果顯示黃芩素組及地塞米松組小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比例相較于EAM組明顯降低。RT-qPCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示，黃芩素組小鼠心臟組織中IL-17A mRNA及蛋白水平較EAM組明顯下調(diào)，F(xiàn)OXP3、IL-10 mRNA及蛋白水平明顯上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)IL-17RA和IL-17RC在小鼠心肌成纖維細(xì)胞中呈高表達(dá)，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)IL-17可以誘導(dǎo)心肌纖維化［21］，而體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都顯示Treg產(chǎn)生的IL-10顯著抑制了心肌成纖維細(xì)胞的膠原合成，Treg細(xì)胞已被證明可通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子IL-10從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)［22-24］。因此黃芩素干預(yù)后EAM小鼠心臟組織中促纖維化因子IL-17A水平明顯下調(diào)，抗纖維化因子IL-10水平明顯上調(diào)，說(shuō)明黃芩素抑制了心肌成纖維細(xì)胞激活，減輕了心肌組織纖維化。

綜上所述，黃芩素干預(yù)可通過(guò)調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞比例的平衡減輕EAM小鼠的心肌纖維化，本研究結(jié)果為延緩EAM患者心肌纖維化進(jìn)程提供了治療新思路。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明： 本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-AEC-2023-417）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理守則》的條例進(jìn)行。

作者聲明： 王甜甜、王爽參與了研究設(shè)計(jì)；王甜甜、李玲參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻(xiàn)］

［1］FELDMAN A M， MCNAMARA D. Myocarditis［J］. N Engl J Med， 2000，343（19）：1388-1398.

［2］ KODAMA M， ZHANG S， HANAWA H， et al. Immunohistochemical characterization of infiltrating mononuclear cells in the rat heart with experimental autoimmune giant cell myocarditis［J］. Clin Exp Immunol， 1992，90（2）：330-335.

［3］ WAN Z K， ZHOU Z F， LIU Y， et al. Regulatory T cells and T helper 17 cells in viral infection［J］. Scand J Immunol， 2020，91（5）：e12873.

［4］ LU M， QIN X L， YAO J G， et al. Th17/Treg imbalance modulates rat myocardial fibrosis and heart failure by regulating LOX expression［J］. Acta Physiol， 2020，230（3）：e13537.

［5］ ZHAO Q， CHEN X Y， MARTIN C. Scutellaria baicalensis， the golden herb from the garden of Chinese medicinal plants［J］. Sci Bull， 2016，61（18）：1391-1398.

［6］ LU X H， WU K F， JIANG S M， et al. Therapeutic mechanism of baicalein in peritoneal dialysis-associated peritoneal fibrosis based on network pharmacology and experimental validation［J］. Front Pharmacol， 2023，14：1153503.

［7］ LIU C， LI Y Y， CHEN Y P， et al. Baicalein restores the ba-lance of Th17/Treg cells via aryl hydrocarbon receptor to atte-nuate colitis［J］. Mediators Inflamm， 2020，2020：5918587.

［8］ SUN X H， CUI X J， CHEN X H， et al. Baicalein alleviated TGF β1-induced type Ⅰ collagen production in lung fibroblasts via downregulation of connective tissue growth factor［J］. Biomedecine Pharmacother， 2020，131：110744.

［9］ GAO Y， LU J， ZHANG Y， et al. Baicalein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats through inhibition of miR-21［J］. Pulm Pharmacol Ther， 2013，26（6）：649-654.

［10］ ZEISBERG E M， TARNAVSKI O， ZEISBERG M， et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis［J］. Nat Med， 2007，13（8）：952-961.

［11］ASSOMULL R G， PRASAD S K， LYNE J， et al. Cardiovascular magnetic resonance， fibrosis， and prognosis in dilated cardiomyopathy［J］. J Am Coll Cardiol， 2006，48（10）：1977-1985.

［12］ LANG C， SAUTER M， SZALAY G， et al. Connective tissue growth factor： A crucial cytokine-mediating cardiac fibrosis in ongoing enterovirus myocarditis［J］. J Mol Med， 2008，86（1）：49-60.

［13］ BARCENA M L， JEUTHE S， NIEHUES M H， et al. Sex-specific differences of the inflammatory state in experimental autoimmune myocarditis［J］. Front Immunol， 2021，12：686384.

［14］ YUANJ H， MAY， YUANL H， et al. Baicalein attenuates bleomycin-induced lung fibroblast senescence and lung fibrosis through restoration of Sirt3 expression［J］. Pharm Biol， 2023，61（1）：288-297.

［15］ WANG W， ZHOU P H， XU C G， et al. Baicalein ameliorates renal interstitial fibrosis by inducing myofibroblast apoptosis in vivo and in vitro［J］. BJU Int， 2016，118（1）：145-152.

［16］ WANG J， LIU T S， CHEN X W， et al. Bazedoxifene regulates Th17 immune response to ameliorate experimental autoimmune myocarditis via inhibition of STAT3 activation［J］. FrontPharmacol， 2020，11：613160.

［17］ SUN P， WANG N X， ZHAO P， et al. Circulating exosomes control CD4+ T cell immunometabolic functions via the transfer of miR-142 as a novel mediator in myocarditis［J］. Mol Ther， 2020，28（12）：2605-2620.

［18］ BETTELLI E， KORN T， OUKKA M， et al. Induction and effector functions of T（H）17 cells［J］. Nature， 2008，453（7198）：1051-1057.

［19］ CHABAUD M， DURAND J M， BUCHS N， et al. Human interleukin-17：A T cell-derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium［J］. Arthritis Rheum， 1999，42（5）：963-970.

［20］ LOCK C， HERMANS G， PEDOTTI R， et al. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets va-lidated in autoimmune encephalomyelitis［J］. Nat Med， 2002，8（5）：500-508.

［21］ LIU Y F， ZHU H T， SU Z L， et al. IL-17 contributes to cardiac fibrosis following experimental autoimmune myocarditis by a PKCβ/Erk1/2/NF-κB-dependent signaling pathway［J］. Int Immunol， 2012，24（10）：605-612.

［22］ ASSEMAN C， MAUZE S， LEACH M W， et al. An essential role for interleukin 10 in the function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation［J］. J Exp Med， 1999，190（7）：995-1004.

［23］ RUBTSOV Y P， RASMUSSEN J P， CHI E Y， et al. Regulatory T cell-derived interleukin-10 limits inflammation at environmental interfaces［J］. Immunity， 2008，28（4）：546-558.

［24］ CAO Y X， XU W， XIONGS D. Adoptive transfer of regulatory T cells protects against Coxsackievirus B3-induced cardiac fibrosis［J］. PLoS One， 2013，8（9）：e74955.

（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）