王艷 王莎莎 朱春陽 董晨 王瑞 邱文生

［摘要］ ?目的 ?探討不同濃度蟾蜍他靈（BT）對人結直腸癌細胞HCT116增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化的影響。

方法采用CCK-8實驗檢測不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24和48 h后的細胞活力，并計算半抑制濃度（IC50）；平板克隆實驗驗證0、12.5、25.0 nmol/L BT（設為A、B、C組）處理14 d后對HCT116細胞集落形成能力的影響；使用劃痕和Transwell實驗驗證0、25、50 nmol/L BT（設為A、C、D組）處理24 h后對HCT116細胞遷移和侵襲能力的影響；應用Western blot實驗檢測A、C、D組處理24 h后HCT116細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達水平。

結果CCK-8實驗結果顯示，BT處理HCT116細胞24或48 h后，隨著BT的濃度增加，其抑制HCT116細胞增殖的作用顯著增強（F=2 106.00、3 725.00，P<0.05），處理24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L；平板克隆實驗結果顯示，B、C組細胞的集落數(shù)量顯著少于A組（F=159.30，t=12.40、17.32，P<0.05）；劃痕和Transwell實驗結果顯示，C、D組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)量顯著低于A組（F=120.30、296.80，t=12.71～21.27，P<0.05）；Western blot實驗結果顯示，BT顯著上調HCT116細胞內E-cadherin蛋白表達（F=2 736.00，P<0.05），其中C、D組顯著高于A組（t=50.27、72.13，P<0.05）；而BT顯著下調N-cadherin蛋白表達（F=626.80，P<0.05），其中C、D組顯著低于A組（t=26.54、33.57，P<0.05）。

結論BT可明顯抑制人結直腸癌細胞HCT116的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化過程，有望成為結直腸癌治療的潛在候選藥物。

［關鍵詞］ ?結直腸腫瘤；HCT116細胞；蟾酥甾類；細胞增殖；細胞運動；腫瘤浸潤；上皮-間質轉化

［中圖分類號］ ?R735.34

［文獻標志碼］ ?A

Effect of bufotalin on the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells

WANG Yan， WANG Shasha， ZHU Chunyang， DONG Chen， WANG Rui， QIU Wensheng

（Faculty of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the effect of different concentrations of bufotalin （BT） on the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells.

Methods?CCK-8 assay was used to measure cell viability after 24 and 48 h of BT treatment at different concentrations （0， 10， 20， 40， 80， 160， and 320 nmol/L）， and the half-maximal inhibitory concentration （IC50） was calculated. The plate colony formation assay was used to verify the effect of BT treatment at the concentrations of 0， 12.5， and 25.0 nmol/L for 14 days on the colony formation ability of HCT116 cells （established as groups A， B， and C）. The wound healing assay and the Transwell assay were used to verify the effect of BT treatment at the concentrations of 0， 25， and 50 nmol/L for 24 h on the migration and invasion abilities of HCT116 cells （established as groups A， C， and D）. Western blot was used to measure the protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin in HCT116 cells after 24 h of treatment in groups A， C and D.

Results?CCK-8 assay showed that after HCT116 cells were treated by BT for 24 or 48 h， the inhibitory effect of BT on the proliferation of HCT116 cells increased significantly with the increase in the concentration of BT （F=2 106.00，3 725.00，P<0.05）， with an IC50 value of 49.59 nmol/L for 24-hour treatment and 24.10 nmol/L for 48-hour treatment. The plate colony formation assay showed that groups B and C had a significantly lower number of colonies of cells than group A （F=159.30，t=12.40，17.32，P<0.05）. The wound healing assay and the Transwell assay showed that compared with group A， groups C and D had significantly lower cell migration rate and number of invading cells （F=120.30，296.80，t=12.71-21.27，P<0.05）. Western blot showed that BT significantly upregulated the protein expression level of E-cadherin in HCT116 cells （F=2 736.00，P<0.05）， and groups C and D had a significantly higher expression level than group A （t=50.27，72.13，P<0.05）; BT significantly downregulated the protein expression level of N-cadherin （F=626.80，P<0.05）， and groups C and D had a significantly lower expression level than group A （t=26.54，33.57，P<0.05）.

Conclusion?BT can significantly inhibit the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition of human colorectal cancer HCT116 cells and is expected to become a potential candidate for the treatment of colorectal cancer.

［KEY WORDS］?Colorectal neoplasm; HCT116 cells; Bufanolides; Cell proliferation; Cell movement; Neoplasm invasiveness; Epithelial-mesenchymal transition

結直腸癌在全球發(fā)病率居第三位，死亡率僅次于肺癌［1］。近年來，盡管手術和藥物治療有了重大進展，但晚期結直腸癌患者預后仍然很差。據(jù)統(tǒng)計，Ⅰ期結直腸癌患者的5年生存率為90%，而Ⅳ期患者的5年生存率下降至10%左右［2］。因此，迫切需要尋找新的治療藥物，使結直腸癌患者獲益。

蟾蜍他靈（BT）是一種從中藥蟾酥中分離出來的蟾蜍二烯內酯［3］。其已被證明具有強心、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性［4-6］。近年來，BT因其顯著的抗腫瘤活性而受到廣泛的關注。研究發(fā)現(xiàn)，BT可誘導人惡性黑色素瘤A375細胞發(fā)生細胞周期停滯和凋亡，從而抑制其增殖［7］；BT還可以通過抑制STAT3/上皮間質轉化（EMT）軸來抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞和HCC1937細胞的增殖、遷移和侵襲［8］。另外，在非小細胞肺癌細胞A549異種移植模型中，5、10 mg/kg的BT可顯著抑制腫瘤生長［9］。然而，BT是否具有抑制結直腸癌細胞的作用尚不明確。本研究通過使用不同濃度BT處理人結直腸癌HCT116細胞后，檢測BT對HCT116細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力的影響，并探究BT對HCT116細胞EMT的影響，旨在為結直腸癌新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人正常腸上皮細胞系NCM460、人結直腸癌細胞系HCT116由武漢普諾賽生命科技有限公司提供， CCK-8試劑盒及BT購自上海陶術生物科技有限公司， BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，E-cadherin和N-cadherin單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology（CST），GAPDH多克隆抗體和羊抗兔二抗購于上海愛必信生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將NCM460和HCT116細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、潮濕、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳2～3代且待細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.3CCK-8實驗檢測細胞活力

將處于對數(shù)生長期的NCM460和HCT116細胞以10 000個/孔接種至96孔板，在細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h以后，分別使用濃度為0、10、20、40、80、160、320 nmol/L的BT處理細胞，第24、48小時時分別向各孔細胞中加入10 μL的CCK-8檢測試劑孵育1 h，使用酶標儀檢測波長450 nm處各孔的吸光度（A）值。

使用Graphpad Prism 8.0軟件計算半抑制濃度（IC50）。以BT處理HCT116細胞第24、48 小時的IC50為依據(jù)，選擇合適的濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 平板克隆實驗檢測細胞集落形成能力

取處于對數(shù)生長期的HCT116細胞以800個/孔接種至6孔板，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔中分別加入2 mL濃度為0、12.5、25 nmol/L的BT培養(yǎng)液處理細胞（設為A、B、C組），繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每3 d換液一次。當肉眼觀察到有細胞集落形成時，取出6孔板，去除原培養(yǎng)液，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，以0.1%結晶紫溶液染色20 min，拍照并使用Image J軟件計算各組集落數(shù)量。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

準備6孔板，用馬克筆在其背后畫橫線，橫線相隔0.5 cm。取處于對數(shù)生長期的HCT116細胞接種在6孔板上，待細胞生長密度達到約90%時，用100 μL無菌移液器吸頭垂直于6孔板背后橫線在孔板內進行劃痕，用PBS沖洗3次，然后在每孔中分別加入2 mL濃度為0、25、50 nmol/L的BT培養(yǎng)液處理細胞（設為A、C、D組），用顯微鏡在第0、24小時時拍攝劃痕愈合情況，并計算細胞遷移率。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

準備含有Matrigel膠的Transwell小室。在24孔板中加入含10%血清的培養(yǎng)基，然后用鑷子將小室置于24孔板內，取在6孔板中處理24 h的A、C、D組HCT116細胞分別以50 000個/孔混合200 μL無血清培養(yǎng)基加入小室，最后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待24 h后，去除原培養(yǎng)液，使用4%多聚甲醛固定30 min，以0.1%結晶紫溶液染色20 min。于倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取3個視野拍照，使用Image J軟件進行計數(shù)。

1.7 Western blot實驗檢測細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達水平

取接種于培養(yǎng)皿處理24 h的A組、C組、D組HCT116細胞，將含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液加入細胞內進行充分裂解后，提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度配置等量等體積的蛋白樣本，隨后100 ℃煮沸5 min，放入－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣本，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，然后加入一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。第2天用二抗常溫孵育1 h，使用顯影儀顯影獲取蛋白條帶。以GAPDH作為內部參照，計算目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Image J軟件處理圖像。所有實驗均獨立重復3次，計量資料以 ±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett方法，兩組之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 ?果

2.1BT對HCT116細胞活力的影響

CCK-8實驗結果顯示，經不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24或48 h，隨著濃度的升高，BT對NCM460細胞活力的抑制能力逐漸增強（F=478.70、659.90，P<0.05）。經不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）的BT處理24或48 h，隨著濃度的升高，BT對HCT116細胞活力的抑制能力逐漸增強（F=2 106.00、3 725.00，P<0.05）。詳見圖1。BT處理NCM460細胞24和48 h后的IC50分別為261.40、141.10 nmol/L，BT處理HCT116細胞24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L。根據(jù)BT處理HCT116細胞24和48 h的IC50值，后續(xù)選擇濃度0、12.5、25 nmol/L的BT用于平板克隆實驗，濃度0、25、50 nmol/L的BT用于其他實驗。

2.2BT對HCT116細胞集落形成能力的影響

平板克隆實驗結果顯示，A～C組HCT116細胞的集落數(shù)量分別為（453.00±17.00）、（301.00±8.89）、（240.70±17.56）個，各組間比較差異有顯著性（F=159.30，P<0.05），其中B、C組顯著少于A組（t=12.40、17.32，P<0.05），C組顯著少于B組（t=4.92，P<0.05）。見圖2。

2.3BT對HCT116細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，A、C、D組HCT116細胞的遷移率分別為（28.84±3.00）%、（4.22±2.38）%、（1.63±1.49）%，各組間比較差異有顯著意義（F=120.30，P<0.05），其中C、D組顯著低于A組（t=12.71、14.05，P<0.05），D組與C組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

2.4BT對HCT116細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，A、C、D組HCT116細胞的侵襲數(shù)量分別為（781.00±77.00）、（21.33±1.53）、（8.67±0.58）個，各組間比較差異具有顯著性（F=296.80，P<0.05），其中C、D組顯著少于A組（t=20.92、21.27，P<0.05），D組與C組比較無顯著差異（P＞0.05）。見圖4。

2.5BT對HCT116細胞EMT的影響

Western blot實驗結果顯示，A組、C組、D組HCT116細胞中E-cadherin的蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、2.02±0.03、2.47±0.04，N-cadhe-

rin的蛋白相對表達量分別為1.00±0.00、0.48±0.02、0.34±0.04。隨著BT的濃度增加，E-cadherin蛋白表達顯著上調（F=2 736.00，P<0.05），其中C、D組顯著高于A組（t=50.27、72.13，P<0.05），D組顯著高于C組（t=21.86，P<0.05）；而N-cadherin蛋白表達則顯著下調（F=626.80，P<0.05），其中C、D組顯著性低于A組（t=26.54、33.57，P<0.05），D組顯著低于C組（t=7.03，P<0.05）。見圖5。

3 討 ?論

結直腸癌是一種始于結腸和直腸的癌癥。國際癌癥研究機構估計，到2040年，全球結直腸癌新發(fā)病例數(shù)將明顯增加，死亡率將明顯增高［10］。目前結直腸癌的臨床治療主要包括手術和化療，然而耐藥性的發(fā)生和化療相關的毒副作用是結直腸癌患者化療失敗或停藥的主要原因［11-12］。中藥因其在緩解癥狀、降低放化療引起的不良反應、延長生存期等方面的獨特優(yōu)勢，成為腫瘤治療的一個研究熱點［13］。BT是一種從中藥蟾酥中提取的類固醇內酯類化合物［14］。蟾酥是中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍有毒分泌物中的干燥產物，其在中國用于疾病的治療已有數(shù)百年的歷史［15］。其中蟾蜍二烯內酯被認為是蟾酥最主要的活性成分之一，其對多種腫瘤具有顯著的抑制作用［16］。

既往研究表明，BT對食管鱗狀細胞癌細胞系Eca-109、EC9706、TE5、Hec2、TE11均有明顯的抑制作用［17］。成骨細胞瘤細胞U2OS異種移植模型小鼠經0.5～1 mg/kg的BT處理后，小鼠體內腫瘤生長受到了顯著抑制［18］。然而，BT在結直腸癌中的抗腫瘤作用知之甚少。無限復制是癌細胞生長所獲得的一種表型，癌細胞通過修復端粒來獲得無限倍增的能力［19］。因此，本研究首先探究了不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 nmol/L）BT對人結直腸癌細胞HCT116增殖活力的影響，結果顯示，隨著濃度的升高，BT對HCT116細胞增殖的抑制能力逐漸增強，并呈劑量依賴性，24和48 h的IC50分別為49.59、24.10 nmol/L。此外，本研究還設置了人正常腸上皮細胞NCM460作為對照，結果發(fā)現(xiàn)BT對于NCM460細胞有一定的抑制作用，24和48 h的IC50分別為261.40、141.10 nmol/L。與HCT116細胞比較，BT處理NCM460細胞24和48 h的IC50更高，這表明NCM460細胞比HCT116細胞更能耐受BT的毒副作用。另有研究表明BT可抑制成骨細胞瘤細胞MG63和非小細胞肺癌細胞A549的集落形成能力［9，18］。因此，本研究也進一步觀察了BT對HCT116細胞集落形成能力的影響，本研究以BT處理HCT116細胞24 h后的IC50為依據(jù)，設置0、12.5、25.0 nmol/L的濃度梯度處理HCT116細胞，結果顯示隨著BT濃度增加，HCT116細胞存活的集落數(shù)量顯著減少。以上這些結果表明，BT對結直腸癌細胞具有明顯的細胞毒作用。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，BT可以抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞、HCC1937細胞的遷移和侵襲能力［8］。轉移是腫瘤患者死亡的主要原因。在轉移過程中，腫瘤細胞離開原發(fā)部位并擴散到全身，形成繼發(fā)腫瘤并最終致器官衰竭［20］。轉移級聯(lián)反應的第一步是侵襲，腫瘤細胞穿透其周圍的基底膜并通過細胞外基質遷移到周圍組織［21］。因此，本研究探究了BT是否會影響結直腸癌細胞的遷移和侵襲，以BT處理HCT116細胞24和48 h后的IC50為依據(jù)，設置0、25、50 nmol/L的濃度梯度處理HCT116細胞。劃痕和Transwell實驗的結果顯示，隨著BT濃度增加，HCT116的細胞遷移率和細胞侵襲數(shù)量顯著減少，表明其能夠抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲。

EMT被認為是癌細胞一種關鍵的表型改變，其將上皮細胞轉化為間充質細胞，因此對腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移至關重要［22］。一些分子標志物的表達水平可以揭示EMT的程度，如癌組織或癌細胞內E-cadherin表達降低和N-cadherin表達增加可顯著性誘導EMT過程［23-24］。有研究證實，BT可以通過增加三陰性乳腺癌細胞中E-cadherin蛋白表達和降低N-cadherin、Vimentin蛋白表達，來抑制EMT過程［8］。在本研究中，BT處理可以顯著上調HCT116細胞中E-cadherin蛋白表達，同時下調N-cadherin蛋白表達，這表明BT可以抑制結直腸癌細胞的EMT過程，進而抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BT是一種有前途的天然抗癌藥物，能明顯抑制人結直腸癌細胞的增殖、集落形成、遷移、侵襲和EMT過程，可為結直腸癌抗腫瘤治療藥物的開發(fā)提供新的思路。但是本研究仍然存在諸多不足之處，僅局限于細胞水平的實驗研究，后續(xù)應考慮構建結直腸癌和轉移瘤動物模型，進一步深入研究BT在動物體內的抗癌作用及其分子機制。

作者聲明： 王艷、邱文生、王莎莎負責研究構思和實驗設計；王艷負責細胞培養(yǎng)和實驗操作；朱春陽、董晨、王瑞負責實驗數(shù)據(jù)處理。所有作者均參與該論文寫作和修改并同意發(fā)表，且均聲明無利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）