白瑩 王一卉 葛歡歡 卞雯晗 陳鵬

［摘要］ ?目的 ?探討小鼠角膜上皮細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立方法，并鑒定其表型的穩(wěn)定性。

方法提取小鼠角膜上皮原代細(xì)胞，以猴空泡病毒40大T抗原（SV40-LT）慢病毒感染小鼠角膜上皮原代細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系。通過HE染色與免疫熒光染色對(duì)角膜上皮組織表型和標(biāo)記物（K12、Pax6、Ki-67）進(jìn)行鑒定。提取原代角膜上皮細(xì)胞并對(duì)其角膜上皮細(xì)胞分層蛋白K14進(jìn)行鑒定，觀察細(xì)胞明場(chǎng)視野評(píng)估細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。對(duì)轉(zhuǎn)染后的P1和P8代細(xì)胞的部分標(biāo)志物（K12、Pax6、Ki-67、ABCG2、K14）進(jìn)行鑒定。采用結(jié)晶紫染色法觀察轉(zhuǎn)染后的P1和P8代細(xì)胞克隆的形成能力。

結(jié)果小鼠角膜上皮組織中K12、Pax6、Ki-67染色陽性；P1、P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2染色陽性，上述標(biāo)志物陽性率比較，差異均無顯著性（P＞0.05），P1與P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞克隆能力無明顯差異（P＞0.05）。

結(jié)論使用SV40-LT慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠角膜上皮，成功建立永生化小鼠角膜上皮細(xì)胞系，表型穩(wěn)定且穩(wěn)定增殖。

［關(guān)鍵詞］ ?細(xì)胞系；上皮細(xì)胞；角膜；轉(zhuǎn)染；遺傳標(biāo)記；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號(hào)］ ?R329.24;R394

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ ?A

Establishment and phenotypic identification of an immortalized mouse corneal epithelial cell line

BAI Ying， WANG Yihui， GE Huanhuan， BIAN Wenhan， CHEN Peng

（Department of Human Anatomy， Histology and Embryology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the method for establishing an immortalized mouse corneal epithelial cell line， and to identify the stability of its phenotype.

Methods?Primary mouse corneal epithelial cells were extracted and transfected with Simian Vacuolating Virus 40 Large T Antigen （SV40-LT） lentivirus to establish an immortalized cell line. HE staining and immunofluorescent staining were used to identify the phenotypes and markers （K12， Pax6， Ki-67） of corneal epithelium. Primary cor-

neal epithelial cells were extracted to identify K14 protein in corneal epithelial cell layer， and bright field observation was performed to evaluate cell morphological characteristics. Several markers （K12， Pax6， Ki-67， ABCG2， K14） were identified for P1 and P8 cells after transfection. Crystal violet staining was used to observe the colony-formation ability of P1 and P8 cells after transfection.

Results?Mouse corneal epithelium was stained positive for K12， Pax6 and Ki-67， while the P1 and P8 generations of mouse cor-

neal epithelial cells were stained positive for K12， Pax6， Ki-67， K14， and ABCG2; there were no significant differences in the positive rates of the above markers （P>0.05）. There was no significant difference in colony-formation ability between P1 and P8 cells （P>0.05）.

Conclusion?The immortalized mouse corneal epithelial cell line is successfully established by transfection with SV40-LT lentivirus， which has stable phenotype and proliferation.

［KEY WORDS］?Cell line; Epithelial cells; Cornea; Transfection; Genetic markers; Mice， inbred C57BL

角膜上皮位于角膜前表面，由非角化上皮細(xì)胞有序排列而成，在視覺系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。角膜上皮細(xì)胞（CECs）不斷從角膜緣干細(xì)胞或祖細(xì)胞（LSCs）中更新而來，LSCs或CECs缺乏會(huì)引起角膜表面缺損、角膜炎等，最終可能導(dǎo)致失明［1-2］。

原代角膜上皮細(xì)胞通常在培養(yǎng)3～4代后即停止生長(zhǎng)，導(dǎo)致每次實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量很少，這也是影響角膜上皮疾病相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究深入開展的瓶頸問題。因此，建立可以無限增殖，并且表型穩(wěn)定的角膜上皮細(xì)胞系十分必要［3］。目前，相關(guān)研究報(bào)道了原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的提取方法與應(yīng)用情況，但在細(xì)胞傳代增殖過程中出現(xiàn)的細(xì)胞衰老和形態(tài)改變等問題仍然難以解決［4］。海弗利克極限理論提出體細(xì)胞的增殖能力是有限的，不能進(jìn)行無限的增殖復(fù)制，但在一些特殊條件干預(yù)下，細(xì)胞也可以實(shí)現(xiàn)無限增殖，且無惡化的表征，即處于正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的一種永生化細(xì)胞狀態(tài)［5］。研究顯示，猴空泡病毒40大T抗原（SV40-LT）片段能與細(xì)胞內(nèi)的p53及其他相關(guān)蛋白結(jié)合，所形成的復(fù)合體可導(dǎo)致p53蛋白失活，進(jìn)一步使抑癌基因失效無法表達(dá)，從而防止細(xì)胞出現(xiàn)分裂停滯，達(dá)到調(diào)整宿主細(xì)胞周期使細(xì)胞處于永生化狀態(tài)的目的［6-8］。研究顯示，將SV40-LT慢病毒轉(zhuǎn)染原代赫特維希上皮根鞘細(xì)胞后，能成功建立棕色脂肪永生化細(xì)胞系和上皮根鞘永生化細(xì)胞系［9］。本研究通過將SV40-LT慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠角膜上皮細(xì)胞以構(gòu)建其永生化細(xì)胞系，旨在為角膜上皮疾病的實(shí)驗(yàn)研究提供足夠細(xì)胞來源，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和材料

8～10周齡雄性C57BL/6小鼠10只，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。免疫熒光K12、Ki-67、K14兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔單克隆抗體ABCG2購(gòu)買于武漢愛博泰克生物科技有限公司；鼠單克隆抗體Pax6購(gòu)買于美國(guó)Biolegend公司。SV40-LT（pGMLV-SV40T-PURO Lentivirus，啟動(dòng)子為EF1SymbolaA@，載體類型為慢病毒，組成型表達(dá)方式，嘌呤毒素真核抗性，熒光標(biāo)記）購(gòu)自上海吉滿生物科技有限公司。

1.2 角膜組織切片HE染色

10只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，異氟烷氣體麻醉后脫頸處死，取出左側(cè)眼球，其中5顆眼球以石蠟包埋后切片。將切片脫蠟后依次用蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片后，顯微鏡明場(chǎng)視野觀察角膜組織形態(tài)。剩余5顆眼球置于冰凍組織包埋劑中，－80 ℃冷凍后切片。

1.3 角膜上皮原代細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

剝離出10只小鼠的右側(cè)眼球，置于4 ℃含有1 500 U/L dispase Ⅱ的KSFM培養(yǎng)基中，第2天剝離出角膜，置于48孔板中，加入含1% ITS、1%青霉素/鏈霉素和2% B-27補(bǔ)充劑的KSFM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基），置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，為原代小鼠的角膜上皮細(xì)胞。在培養(yǎng)48 h時(shí)使用倒置顯微鏡明場(chǎng)視野觀察原代角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 永生化細(xì)胞系的建立及細(xì)胞傳代

1.4.1嘌呤毒素的最低致死濃度測(cè)定 將嘌呤霉素加入完全培養(yǎng)基中，以1 mg/L為一個(gè)濃度梯度，配制成0～10 mg/L不同濃度的培養(yǎng)基。將原代小鼠角膜上皮細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于48孔板中，置于培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時(shí)，將原培養(yǎng)基替換為含不同濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d，隨時(shí)通過顯微鏡觀察，以全部細(xì)胞為漂浮狀態(tài)且未見貼壁細(xì)胞為細(xì)胞全部死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。測(cè)得嘌呤霉素的最低致死濃度為2 mg/L。

1.4.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將原代小鼠角膜上皮細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于48孔板中，待融合度達(dá)60%～70%時(shí)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，每孔約為2.0×105個(gè)細(xì)胞，按照公式（病毒量=MOI值×細(xì)胞數(shù)目÷病毒滴度）計(jì)算培養(yǎng)基中需加入SV40-LT的病毒量，其中病毒滴度為5×108 PFU/mL（由上海吉滿生物科技有限公司提供），以MOI值分別為20、10、5進(jìn)行摸索實(shí)驗(yàn)。加入按照上面方法計(jì)算出的不同SV40-LT病毒量后再培養(yǎng)48 h，更換為完全培養(yǎng)基，通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI值為5時(shí)，角膜上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)慢病毒自帶的紅色熒光，表示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。將轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為篩選培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基中加入2 mg/L的嘌呤霉素），每48 h更換1次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)85%以上時(shí)，將細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3細(xì)胞傳代 取培養(yǎng)瓶中的小鼠角膜上皮細(xì)胞，吸出原培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后加入2.5 g/L胰蛋白酶500 μL消化細(xì)胞，后置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中觀察5 min，待細(xì)胞呈分散漂浮狀態(tài)時(shí)，吸出胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞收集到15 mL離心管當(dāng)中，以1 000 r/min離心5 min，吸除上清液，按照吸除上清液的2倍體積重新加入完全培養(yǎng)基，混勻后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，得到P1代小鼠角膜上皮細(xì)胞。重復(fù)上述步驟，得到P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞。

1.5 小鼠角膜上皮細(xì)胞和組織的免疫熒光染色

將原代、P1和P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞分別接種于24孔板中，待融合度達(dá)60%時(shí)，吸出原培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，使用4%多聚甲醛固定20～25 min，以PBS洗滌10 min后，正常山羊血清封閉1 h。原代小鼠角膜上皮細(xì)胞中加入兔抗K12，P1、P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞中均分別加入兔抗K12、鼠抗Pax6、兔抗K14、兔抗Ki-67和兔抗ABCG2一抗，4 ℃條件下過夜，第2天使用PBS洗滌3次后，避光條件下每孔加入二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次。以DAPI室溫染色5 min，PBS洗滌后，于倒置熒光顯微鏡下觀察原代細(xì)胞中K12及P1、P8代細(xì)胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2的表達(dá)情況，并計(jì)算陽性率。取1.2中制備的小鼠角膜組織切片，按照上述步驟進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察角膜組織中K12、Pax6、Ki-67的表達(dá)情況。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將P1和P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞分別接種于6孔板中，待融合度達(dá)80%時(shí)，吸除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS清洗5 min后，加入結(jié)晶紫溶液染色25 min后吸出，以PBS清洗細(xì)胞3次后，記錄克隆形成數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 ±s表示，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 小鼠角膜上皮組織表型及標(biāo)志物鑒定

小鼠角膜組織切片HE染色結(jié)果顯示，其角膜上皮由3～5層細(xì)胞構(gòu)成，角膜上皮復(fù)層正常，角膜基質(zhì)膠原纖維呈矩形規(guī)則排列（圖1A）。角膜組織切片免疫熒光染色顯示，K12在整個(gè)角膜上皮中的染色均呈陽性，但在鄰近結(jié)膜的角膜緣基底上皮中的染色呈陰性（圖1B）；Pax6和Ki-67在角膜上皮中的染色均呈陽性（圖1C、D）。

2.2 原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的表型及明場(chǎng)視野

免疫熒光染色顯示，原代小鼠角膜上皮細(xì)胞中K12顯著表達(dá)，見圖2A～B；圖2B中綠色為K12，藍(lán)色為DAPI。明場(chǎng)視野觀察顯示，角膜組織碎片周圍有向外增殖的角膜上皮細(xì)胞，呈鵝卵石狀，見圖2C～D。

2.3P1和P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞表型及標(biāo)志物鑒定

免疫熒光染色顯示，P1、P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞中K12、Pax6、Ki-67、K14以及ABCG2染色陽性（圖3）。P1和P8代細(xì)胞的上述標(biāo)志物陽性率比較，差異均無顯著性（P＞0.05），見表1。P1和P8代細(xì)胞的明場(chǎng)視野觀察顯示，角膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈鵝卵石狀，且分布均勻（圖4）。

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

P1、P8代細(xì)胞的克隆形成率分別為（375.70±10.02）%、（357.30±11.93）%，兩者比較差異無顯著性（P＞0.05）。

3 討 ?論

目前全世界約有1 000萬人由于眼外傷、嚴(yán)重的感染、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性角膜病變、病原體侵入等原因致角膜盲［1，10-12］。角膜移植手術(shù)與自體或異體角膜緣移植是治療角膜盲的最有效手段，但受到全球供體角膜短缺以及免疫排斥反應(yīng)發(fā)生率過高的限制，導(dǎo)致目前角膜病治療依然是一大難題［13-14］。角膜上皮細(xì)胞對(duì)于角膜病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要，但體外培養(yǎng)的原代小鼠角膜上皮細(xì)胞傳代次數(shù)有限，并且容易衰老，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)需要大量的實(shí)驗(yàn)小鼠，增加了實(shí)驗(yàn)成本［15］。

SV40-LT是具有廣譜轉(zhuǎn)化效應(yīng)的細(xì)胞永生化基因，可以與多種蛋白結(jié)合以延長(zhǎng)細(xì)胞周期，為臨床細(xì)胞學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。有研究表明SV40-LT轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后，與肝細(xì)胞內(nèi)的p53和磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRB）結(jié)合，致p53和pRB功能喪失，腫瘤抑制通路失活，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［6-8］。國(guó)內(nèi)外研究者不斷嘗試應(yīng)用永生化技術(shù)體外建立角膜上皮細(xì)胞系［16-18］，如通過重組的SV40腺病毒載體或編碼端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人角膜上皮細(xì)胞成功構(gòu)建了永生化人角膜細(xì)胞系［19-20］。但是人角膜樣本來源少，目前市場(chǎng)上銷售的永生化細(xì)胞系價(jià)格昂貴，因此如果能成功培養(yǎng)小鼠角膜上皮永生化細(xì)胞系，將會(huì)極大促進(jìn)角膜病相關(guān)研究的開展。

研究顯示，K12是角膜上皮細(xì)胞的標(biāo)志物［21］，在整個(gè)角膜上皮組織和角膜基底層上緣組織中均有表達(dá)，在永生化角膜上皮細(xì)胞中也廣泛表達(dá)；Pax6是角膜發(fā)育的主要調(diào)控基因，可直接與K12啟動(dòng)子結(jié)合［22-23］，在永生化角膜上皮細(xì)胞系中廣泛表達(dá)；Ki-67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物［24］。本研究首先對(duì)小鼠角膜組織切片進(jìn)行了HE染色，顯示其角膜上皮由3～5層細(xì)胞構(gòu)成，角膜基質(zhì)膠原纖維呈矩形規(guī)則排列。免疫熒光染色顯示，在整個(gè)角膜上皮中均可見染色陽性的K12、Pax6和Ki-67，提示在小鼠角膜上皮中均有K12、Pax6和Ki-67表達(dá)。然后本研究又對(duì)從角膜組織中提取出來的原代小鼠角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，免疫熒光染色結(jié)果顯示，原代小鼠角膜上皮細(xì)胞中K12顯著表達(dá)，顯微鏡明場(chǎng)視野觀察顯示角膜組織碎片周圍有向外增殖的呈鵝卵石狀角膜上皮細(xì)胞，提示原代小鼠角膜上皮細(xì)胞提取成功。本研究又對(duì)原代小鼠角膜上皮細(xì)胞通過梯度摸索實(shí)驗(yàn)，得到其轉(zhuǎn)染SV40-LT的最適MOI為5，計(jì)算加入培養(yǎng)板中的病毒量；為了讓細(xì)胞能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，又在培養(yǎng)液中加入最低致死濃度（2 mg/L）的嘌呤霉素，再將細(xì)胞進(jìn)行傳代，獲得P1、P8代小鼠角膜上皮細(xì)胞。免疫熒光染色結(jié)果顯示，P8代與P1代細(xì)胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2均染色陽性，且K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2陽性率比較，差異均無顯著性。K14是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物，僅僅表達(dá)于角膜緣基底細(xì)胞以及角膜上皮基底層［25-26］。ABCG2又稱乳腺癌抵抗蛋白1（BCRP1），是ABC家族的一員，是許多組織中干細(xì)胞的通用標(biāo)志物［27］，在角膜緣干細(xì)胞中也顯著表達(dá)。最后為了評(píng)估傳代細(xì)胞的增殖能力，又進(jìn)行了細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示P8和P1代細(xì)胞的克隆形成率無顯著差異。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染SV40-LT的原代小鼠角膜上皮細(xì)胞在傳代后穩(wěn)定表達(dá)K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2，且沒有發(fā)生衰老或停止增殖等現(xiàn)象，說明永生化小鼠角膜上皮細(xì)胞系建立成功。但因?yàn)镾V40-LT介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染會(huì)改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，與原代細(xì)胞相比，獲得的永生化細(xì)胞會(huì)隨著多次傳代出現(xiàn)異常核型，這也是本方法構(gòu)建的細(xì)胞系局限性的一個(gè)方面。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)染SV40-LT成功建立了小鼠角膜上皮永生化細(xì)胞系，保留了原代小鼠角膜上皮細(xì)胞的特性，并且細(xì)胞的克隆能力良好。該方法獲得的小鼠角膜上皮細(xì)胞易于培養(yǎng)，穩(wěn)定增殖，為解決一直以來實(shí)驗(yàn)用原代小鼠角膜上皮細(xì)胞數(shù)量少、易衰老等問題提供了可行方法，為角膜致病機(jī)制、藥物開發(fā)等方面的研究提供了可方便獲得的細(xì)胞系。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明： 本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-AEC-2022296）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定進(jìn)行。

作者聲明： 白瑩、王一卉、陳鵬參與了研究設(shè)計(jì)；白瑩、王一卉、葛歡歡、卞雯晗參與了實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)整理分析和論文寫作與修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）