陳亮 聶平平

【摘 要】目的：探討常綠鉤吻堿促進(jìn)人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞凋亡的機制。方法：常綠鉤吻堿體外培養(yǎng) HT-29細(xì)胞24 h后，用噻唑藍(lán)（MTT）比色法評估其對細(xì)胞增殖的影響，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法觀察HT-29細(xì)胞的凋亡情況，蛋白印跡法（western-blot）觀察HT-29細(xì)胞的B型淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）蛋白和B型淋巴細(xì)胞瘤-2（ Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)情況。結(jié)果：常綠鉤吻堿可抑制 HT-29 細(xì)胞增殖，8 μg/mL 常綠鉤吻堿干預(yù) 24 h 后，對 HT-29 細(xì)胞增殖的平均抑制率達(dá)58.81%。DAPI染色法觀察到常綠鉤吻堿可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。western-blot法觀察到常綠鉤吻堿能降低HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)（P＜0.05），對 Bax 蛋白表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。結(jié)論：常綠鉤吻堿能有效地抑制 HT-29 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HT-29細(xì)胞的凋亡，其機制可能與通過Bcl-2/Bax途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】常綠鉤吻堿；結(jié)腸癌；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）06-0020-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.06.zgmzmjyyzz202406005

Effect and Mechanism of Sempervirine on Human Colonic Carcinoma Cells Proliferation and Apoptosis

CHEN Liang NIE Pingping

Fuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350001，China

Abstract：Objective To explore the mechanism of the Sempervirine on the apoptosis of the human colonic carcinoma HT-29 cells.Method The HT-29 cells were treated with Sempervirine for 24 h and the cell proliferation was assessed by 3-（4，5-dimethylthiazol-zy1）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）assay；4，6-diamidino-2-phenylindole （DAPI）staining experiment were used to observe the apoptosis of HT-29 cells.Western-blot test was used to analyze the protein expression of B cell lymphoma-2（Bcl-2）and the B cell lymphoma-2（Bcl-2）associated X protein（Bax）of HT-29 cells after 24 hourstreatment of the Sempervirine.Result In the study，it was demonstrated that the Sempervirine had the inhibition against the proliferation of HT-29 cells.The average inhibitory effect（58.81%）was observed after the HT-29 cells were treated with 8 μg/mL of Sempervirine for 24 h.The apoptotic effect of the Sempervirine on HT-29 cells was also confirmed by the DAPI staining experiment.Western-blot assay showed that expression of Bcl-2 protein was lower in the Sempervirine-treated group than that in control group （P＜0.05），but the expression of Bax protein was not changed obviously（P＞0.05）.Conclusion The Sempervirine inhibited the proliferation of HT-29 cells and induced the apoptosis of HT-29 cells，and the mechanism may be associated with activating the Bcl-2/Bax pathway.

Key words：Sempervirine；Coionic Carcinoma；Cell Apoptosis

鉤吻，又名斷腸草、大茶藥、野葛等，為馬錢科植物胡蔓藤Gelsemium elegans（Gardn.et champ）Benth.的全草，是有毒植物，在我國主要分布在我國浙江、福建、廣東、廣西、貴州、云南等地^［1］。鉤吻具有破瘕積的功效^［2］，現(xiàn)代藥理研究^［3］發(fā)現(xiàn)鉤吻具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用。曾有醫(yī)者將鉤吻總生物堿制成注射劑應(yīng)用于臨床治療癌性疼痛取得一定療效^［4］，鉤吻生物堿的毒性也對其臨床應(yīng)用帶來一定限制，也需要進(jìn)一步研究相關(guān)作用機制，以便能夠更好地應(yīng)用于臨床。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)鉤吻中提取出的常綠鉤吻堿具有較強抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的作用，但是具體機制尚未明確。本研究利用MTT實驗、DAPI染色及western-blot等研究方法，從Bcl-2/Bax途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度出發(fā)，探討常綠鉤吻堿抗結(jié)腸癌作用的機制。

1 材料

1.1 藥物與細(xì)胞 常綠鉤吻堿，由昆山遠(yuǎn)慕生物技術(shù)有限公司提供（純度＞99%，貨號YM-0065），配制前用二甲基亞砜（DMSO）溶液配制成5 mg/mL的母液，于4 ℃保存待用。人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供（貨號KGG3225-1）。

1.2 試劑和儀器 南美胎牛血清（美國Hyclone公司，貨號SV30087.02）;雙抗青鏈酶素（10000units/mL，10000μg/mL鏈霉素。美國Hyclone公司，貨號SV30010）;McCoys5A液體培養(yǎng)基（武漢博士德公司，貨號PYG0026）;胰蛋白酶-EDTA（美國Hyclone公司，貨號SH30042.01）;二甲基亞砜（DMSO）溶液（北京索萊寶公司，貨號D8371）;噻唑藍(lán)（MTT）干粉（江蘇凱基公司，貨號KGH3101-1）;細(xì)胞凋亡DAPI染色劑試劑盒（江蘇凱基公司，貨號KGA215）;RIPA細(xì)胞裂解液（上海碧云天公司，貨號P0013B）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天公司，貨號P0011）;一抗稀釋液（上海碧云天公司，貨號P0023A）;二抗稀釋液（上海碧云天公司，貨號P0023D）;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司，貨號P0012A）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天公司，貨號P0015）;超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天公司，貨號P0018S）;β-actin蛋白一抗（英國abcam公司，貨號ab8226）;Bcl-2蛋白一抗（英國abcam公司，貨號ab59348）;Bax蛋白一抗（英國abcam公司，貨號ab32503）;二抗（北京全式金公司，貨號HS201-01、HS101-01）;ELX800酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;二氧化碳培養(yǎng)箱（中國力康公司）;IX7熒光倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;潔凈工作臺（蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司）;25 cm²培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）;Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 HT-29細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、1%雙抗青鏈酶素的McCoys5A液體培養(yǎng)基置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞以McCoys5A培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁴個/mL分別接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)液，根據(jù)前期預(yù)實驗觀察到常綠鉤吻堿對HT-29細(xì)胞增殖的抑制情況，將細(xì)胞分為實驗組（常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)），對照組（等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)）及調(diào)零組（不含細(xì)胞直接加等體積的培養(yǎng)液），以上5組各設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，然后吸取各孔中的液體加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL/孔 ，振蕩混勻，并于室溫放置10 min，使結(jié)晶充分溶解并混勻，在ELX800酶標(biāo)儀于570 nm處測定5組吸光度值（即OD值），抑制率=1-（實驗組-調(diào)零組）/（對照組-調(diào)零組）。以上實驗重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將取對數(shù)生長期的HT-29接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實驗組（用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)），對照組（等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)）。HT-29細(xì)胞用常綠鉤吻堿干預(yù)培養(yǎng)24 h后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及變化，并拍照。

2.4 DAPI染色液染色觀察 HT-29細(xì)胞的凋亡情況 將取對數(shù)生長期的HT-29接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實驗組（用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)），對照組（等體積不含常綠鉤吻堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)），HT-29細(xì)胞用常綠鉤吻堿干預(yù)培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔用1 μg/mL的DAPI染色液500 μL漂洗后，棄去染色液，每孔再加1 μg/mL的DAPI染色液500 μL，37 ℃孵育染色15 min，棄去染色液，后每孔加500 μL無水甲醇溶液漂洗，棄去甲醇溶液，每孔加入500μL Buffer后，用IX7熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的凋亡情況。

2.5 western-blot檢測Bcl-2和Bax蛋白 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞胰酶消化后，取3×10⁶個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后。吸棄原培養(yǎng)液，細(xì)胞分為實驗組（用常綠鉤吻堿終質(zhì)量濃度分別為4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)），對照組（直接加等體積的培養(yǎng)液）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后， 用預(yù)冷的PBS洗滌2次， 收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液150 μL，4 ℃裂解30 min， 收集細(xì)胞裂解液， 14000 rpm離心15 min， 收集上清液，BCA試劑測定蛋白含量，加入5×蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×，100 ℃蛋白變性5 min，上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠， 每孔20 μg蛋白進(jìn)行電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h， 一抗（β-actin、Bcl-2、Bax蛋白用一抗稀釋液1∶1000稀釋）4 ℃過夜， TBST洗膜3次， 每次10 min， 二抗（以1∶8000用二抗稀釋液稀釋）室溫孵育2 h， TBST漂洗3遍，每遍10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參基因，用Image Lab軟件進(jìn)行顯色分析，以上實驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間用單因素方差分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞增殖的影響 質(zhì)量濃度4 μg/mL常綠鉤吻堿干預(yù)24 h后，即對HT-29細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05）。隨著藥物濃度的提高及干預(yù)時間的延長，HT-29的抑制率也升高，呈明顯的時間劑量依賴。8 μg/mL常綠鉤吻堿干預(yù)24 h后，對 HT-29 細(xì)胞增殖的平均抑制率可達(dá)58.81%，使用SPSS 17.0計算IC₅₀約為7.48 μg/mL。詳見表1。

3.2 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響（干預(yù)24 h） 空白對照組細(xì)胞胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核仁清晰，呈良好的貼壁生長，如圖1A所示。實驗組當(dāng)常綠鉤吻堿質(zhì)量濃度為4 μg/mL作用24 h時，可明顯觀察到細(xì)胞胞質(zhì)混濁，細(xì)胞體積縮小，開始出現(xiàn)細(xì)胞懸浮、脫落，甚至死亡，如圖1B所示；隨著劑量的增加細(xì)胞狀態(tài)越差，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少如圖1C和圖1D所示。實驗結(jié)果顯示常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞有明顯的抑制作用，并隨濃度的增加逐漸增強，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

3.3 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞凋亡的影響（干預(yù)24 h） DAPI染色劑染色后，空白對照組HT-29細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核呈圓形，邊緣清晰，如圖2A所示。實驗組常綠鉤吻堿干預(yù)后凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色熒光，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，核小體碎片增加。隨著藥物劑量的增加，HT-29細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，表明常綠鉤吻堿可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。如圖2B、C、D所示。

3.4 western-blot檢測 常綠鉤吻堿對于HT-29細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響（干預(yù)24 h） 與對照組相比，實驗組各組Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），而Bax蛋白的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），表明常綠鉤吻堿可降低HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，但對Bax蛋白的表達(dá)無明顯影響。如圖3和圖4所示。

4 討論

細(xì)胞凋亡是機體維持穩(wěn)定的重要保護(hù)機制之一，細(xì)胞凋亡率的減少是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵性步驟。腫瘤發(fā)展過程中增殖與凋亡平衡的破壞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖^［5］。

Bcl-2和Bax蛋白均屬于Bcl-2家族，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，Bax則為促凋亡蛋白，Bcl-2家族是凋亡調(diào)控的重要分子，在腫瘤中Bcl-2家族成員表達(dá)異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃逸凋亡，保持持續(xù)的增殖能力，Bcl-2定位于線粒體膜，Bax則主要以單體形式定位于細(xì)胞漿，當(dāng)受到凋亡刺激時，Bax發(fā)生構(gòu)象改變，從胞漿移位到線粒體外膜形成二聚體或寡聚體并插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降和促凋亡分子的釋放，進(jìn)而促發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，Bcl-2可與Bax形成異二聚體，阻礙Bax等促凋亡蛋白的功能，抑制細(xì)胞色素C（Cyt-c）和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的釋放，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用^［6］。Bcl-2/Bax異常升高可見于多種腫瘤之中，Bax/Bcl-2與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)^［7］。

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和死亡率都很高的惡性腫瘤^［8］。結(jié)腸癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境因素、飲食及生活習(xí)慣均密切相關(guān)，其發(fā)病涉及多因素、多個階段及不同基因的變化。細(xì)胞凋亡程序的失常與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)。有研究表明Bcl-2表達(dá)量可影響結(jié)腸組織的惡變程度，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展^［9］。

目前，中藥的抗腫瘤作用越來越受到重視，以其副作用少、療效確切的特點受到許多研究者關(guān)注。中藥對于逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥也具有一定作用^［10］。研究中藥中的有效抗腫瘤成分將有助于抗腫瘤藥物的研發(fā)。隨著對中藥生物堿研究的不斷深入，越來越多的生物堿被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用，中藥生物堿成分的抗腫瘤機制主要有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，影響腫瘤細(xì)胞自噬和調(diào)節(jié)免疫功能等，可通過調(diào)控 PI3K/AKT、AKT/mTOR、JNK/p38 MAPK、Wnt/β-catenin 等相關(guān)信號通路，多環(huán)節(jié)、多途徑參與到腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及自噬過程中，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展^［11］。

鉤吻含有鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿等多種生物堿成分^［12］。吳達(dá)榮等^［13］的實驗證明鉤吻生物堿的主要成分鉤吻素子在體外對于人結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo有抑制作用。黃靜等^［14］也通過實驗發(fā)現(xiàn)鉤吻生物堿中的鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己和1-甲氧基鉤吻堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖具有顯著的抑制作用。本課題前期研究^［15］發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿可抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，也可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖及遷移^［16］，具有一定抑制血管新生的作用。常綠鉤吻堿是鉤吻生物堿中含有的單體成分之一。有研究^［17］通過體外細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)常綠鉤吻堿可抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251生長，用100 mg/kg的常綠鉤吻堿灌胃給藥小鼠時也未發(fā)現(xiàn)對正常小鼠存在明顯毒性作用。目前鉤吻生物堿抗腫瘤作用的研究仍較少，本研究通過常綠鉤吻堿體外作用于HT-29細(xì)胞，利用MTT試驗及倒置相差顯微鏡觀察到常綠鉤吻堿可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，表現(xiàn)出明顯量效關(guān)系。另外，通過DAPI染色法證實常綠鉤吻堿可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。western-blot檢測發(fā)現(xiàn)常綠鉤吻堿可顯著下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)（P＜0.05），對Bax的蛋白表達(dá)未見明顯影響（P＞0.05）。由此我們推測常綠鉤吻堿可能通過減少HT-29細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而減輕細(xì)胞對凋亡的抑制作用，而非直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因而對Bax蛋白的表達(dá)無明顯影響。這也為常綠生物堿抗腫瘤作用的研究提供了一定理論參考。

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（收稿日期：2023-06-26 編輯：劉 斌）