石 田,韓生義,李淑萍,胡國元,李玲霞,李生慶*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810016;2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海西寧 810016;3.青海省動物疾病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點實驗室,青海西寧 810016)

近年來,青藏高原牧區(qū)犢牦牛腹瀉的發(fā)病率呈上升趨勢,同時犢牦牛腹瀉死亡時常發(fā)生。引起犢牦牛腹瀉的病因可分為兩大類,主要包括傳染性因素和非傳染性因素,在臨床中以傳染性因素較多見,傳染性因素主要包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等。研究表明細(xì)菌性因素是引起青海牧區(qū)犢牦牛腹瀉的主要原因,其中大腸埃希氏菌是最主要的致病因素。大腸埃希氏菌作為一種條件性致病菌,在正常情況下不會對動物機(jī)體造成損傷,但當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變以及動物機(jī)體抵抗能力下降時便會大量繁殖,產(chǎn)生毒素,危及牦牛的生長;加之青海地區(qū)地處高海拔環(huán)境,冷季持續(xù)周期較長,同時牦牛養(yǎng)殖業(yè)粗放的養(yǎng)殖方式,在這樣的情況下,一旦犢牛沒有得到好的照料,會導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低,大腸埃希氏菌便會在犢牛體內(nèi)繁殖產(chǎn)生大量毒素,引起犢牛腹瀉的發(fā)生,且其主要危害哺乳階段的犢牛,具有發(fā)病急、傳播速度快、危害嚴(yán)重的特點,一旦發(fā)生流行,將會引發(fā)大量的死亡[1]。大腸埃希氏菌擁有多種致病性的血清型,且各血清型之間的交叉保護(hù)能力較差,導(dǎo)致該病的防控難度增大。同時,已有研究證實大腸埃希氏菌可經(jīng)接合、轉(zhuǎn)座等方式進(jìn)行水平傳播,將其具有的毒力基因和耐藥基因進(jìn)行水平傳播,增大對該病的治療和防治難度[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌上不斷有新的毒力因子和血清型的發(fā)現(xiàn)。然而,現(xiàn)有的關(guān)于青海地區(qū)大腸埃希氏菌在該方面的細(xì)致研究較少,因此,通過本項研究可以為青海牧區(qū)致犢牦牛腹瀉大腸埃希氏菌流行病學(xué)及部分生物學(xué)特性的深入探析及犢牦牛腹瀉病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株 樣品采自青海省玉樹、果洛、海北3個州的腹瀉犢牦牛新鮮糞便、腹瀉死亡犢牛腸道內(nèi)容物(糞便93份、腸內(nèi)容物6份)。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922、大腸埃希氏菌O157:H7 NCTC12900菌株,由青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院高原動物疫病診斷實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 昆明系小白鼠,16～18 g,雄性,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心(生產(chǎn)許可證號:SCXK(甘)2020-0002)。

1.1.3 主要試劑 伊紅美藍(lán)瓊脂、SS瓊脂、LB瓊脂、LB肉湯等,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 700,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;2×TaqMaster Mix,西安擎科生物股份有限公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增引物由西安擎科生物股份有限公司合成。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;O抗原標(biāo)準(zhǔn)血清,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272),寧波普朗特儀器有限公司產(chǎn)品;超凈工作臺(SW-CJ-2FD),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;離心機(jī)、移液槍、PCR儀,Ependorf公司產(chǎn)品;電子天平(GL822i-1SCN),北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品;全功能凝膠成像儀(FluorChem R),Protein Simple公司產(chǎn)品;水平電泳槽(WIX-liteDNA)、多功能電泳儀電源(WIX-EP600T),北京韋克斯科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離鑒定 將采集的肛門拭子和胃腸道內(nèi)容物樣本,無菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后;劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板以及SS平板,37 ℃培養(yǎng)16～18 h[3-4];挑取紫黑色帶有金屬光澤區(qū)域的表面光滑、大小適中的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,并傳代純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的16S rDNA鑒定 設(shè)計并合成大腸埃希氏菌16S rDNA通用引物,上游引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物R:5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,引物由西安擎科生物股份有限公司合成,提取分離純化后的菌株DNA作為模板[4-6]。PCR反應(yīng)體系:(50 μL體系)上、下游引物各1 μL,菌株DNA模板2 μL,2×TaqMaster Mix 25 μL,ddH2O 21 μL;PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 30 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,并送北京擎科生物股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果與NCBI的GenBank已知序列進(jìn)行比對分析,確定菌種信息。

1.2.3 菌株的毒力基因檢測 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-8]和 NCBI數(shù)據(jù)庫基因序列設(shè)計毒力基因擴(kuò)增引物序列見表1;PCR反應(yīng)體系(25 μL體系):上、下游引物各0.5 μL,菌株DNA模板1 μL,2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL;PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s,退火30 s,72 ℃ 1 min,共32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 毒力基因引物信息

1.2.4 菌株的致病性試驗 為進(jìn)一步驗證分離菌株的致病力,對分離的疑似大腸埃希氏菌菌株進(jìn)行小鼠腹腔攻毒試驗。將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖菌18 h,用PBS洗滌后調(diào)整濃度為2.5×109、5×108、2.5×108CFU/mL,每株菌分別注射小鼠2只,每只小鼠腹腔注射0.2 mL;對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水,接種后各組隔離詞養(yǎng),每隔8 h觀察一次,連續(xù)觀察5 d,記錄小鼠的死亡情況[9-11]。

1.2.5 菌株的血清型鑒定 對初步鑒定為致病性大腸埃希氏菌的菌株,采用玻片凝集試驗進(jìn)行血清型鑒定[12-13]。

1.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分群 采用已提取的大腸埃希氏菌菌株基因組,采用三重PCR,對chuA、yjaA和TspE4.C2[14-16]這3種基因(表2)同時進(jìn)行PCR檢測,利用電泳圖譜確定大腸埃希氏菌的系統(tǒng)發(fā)育群分型;引物由西安擎科生物股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL體系):3對上、下游引物各1 μL,菌株DNA模板3 μL,2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 3.5 μL;PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s、退火30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。系統(tǒng)發(fā)育群分型依據(jù)見表3。

表2 系統(tǒng)發(fā)育群分類引物信息

表3 系統(tǒng)發(fā)育群分型

2 結(jié)果

2.1 菌株分離培養(yǎng)及染色鏡檢

經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng),得到疑似大腸埃希氏菌79株,菌株在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈圓形、紫黑色的、帶有綠色金屬光澤的不透明邊界清晰的菌落;在SS培養(yǎng)基上呈圓形、粉色,不透明邊界清晰的菌落;革蘭氏染色鏡檢,可見兩端鈍圓的長桿狀,長度在2～4 μm之間。

2.2 16S rDNA PCR鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增以及凝膠電泳,得到約1 450 bp的目的條帶(圖1),與預(yù)期結(jié)果相符;分離菌株的測序結(jié)果呈單一峰值,表明測序結(jié)果可靠;經(jīng)Blast比對,79株分離菌株與大腸埃希氏菌同源性在99%以上,確定其為大腸埃希氏菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; E1～E7.大腸埃希氏菌分離菌株; N.陰性對照

2.3 毒力基因檢測

對79株分離菌株進(jìn)行毒力基因檢測,凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖2,其中79株菌株均檢測出毒力基因,毒力基因檢出率為100%。檢測出的毒力基因分別是F17、ompA、fimC、espA、HPI、VT1、SLT2和LEE,檢出率分別為62.03%、100%、100%、5.06%、17.72%、2.53%、1.27%和1.27%,其中多株含有3種及以上毒力基因。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; E1～E21.大腸埃希氏菌分離菌株M.DNA Marker DL 2 000; E1-E21.Escherichia coli isolates

2.4 小鼠致病性試驗

試驗組小鼠精神沉郁,行動遲緩不喜動,呼吸急促,被毛凌亂無光澤、食欲減退;對照組小鼠生命體征正常。79株菌株2.5×109CFU/mL劑量組小鼠均在72 h內(nèi)死亡;部分菌株接種2.5×108CFU/mL也可致死小鼠,對死亡小鼠進(jìn)行剖檢可見小腸部分腸段內(nèi)含大量積液,腸壁變薄;肺部可見點狀出血點,其他臟器無明顯病變。

2.5 O抗原血清型鑒定

血清凝集試驗結(jié)果顯示,79株致病性大腸埃希氏菌分離株中,共鑒定出17種血清型,分別為 O4、O20、O25、O26、O27、O55、O64、O78、O107、O117、O126、O127、O144、O148、O152、O153和O154(表4),其中O25、O55和O107為優(yōu)勢血清型,分別占定型血清的20.3%、11.4%和15.2%。

表4 血清型檢出

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果

大腸埃希氏菌chuA、YjaA、TspE4.C2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3,79株牦牛源大腸埃希氏菌中,檢測出A、B1和B2共3種進(jìn)化分群,優(yōu)勢菌群為B1,其次是A,未有D群檢出,各個分群的地區(qū)分布比例見表5。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600; E1-E24.大腸埃希氏菌分離菌株M.DNA Marker DL 600; E1-E24.Escherichia coli isolates

表5 不同地區(qū)系統(tǒng)發(fā)育群分型分布

3 討論

大腸埃希氏菌是自然界中通用的微生物,也是人類和動物正常腸道微生物群的重要組成部分[17],這種無害的共生生物可以通過含有編碼毒力因子的基因的綜合移動遺傳元件的混合物[18],通過基因突變成為能夠引起廣泛腸道和腸外疾病的人獸共患病病原體,相關(guān)研究證明非致病性大腸埃希氏菌可以通過突變其必需的脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白獲得毒力,從而導(dǎo)致宿主患病[19]。同時,大腸埃希氏菌作為條件性致病菌,受犢牛免疫力、圈舍衛(wèi)生情況及環(huán)境等因素的影響,會導(dǎo)致犢牛腹瀉的發(fā)生,犢牛腹瀉臨床癥狀表現(xiàn)為急性腹瀉、脫水、虛脫等[20]。導(dǎo)致腹瀉發(fā)生的主要因素是大腸埃希氏菌攜帶的毒力因子,毒力因子是特定的分子,主要是由細(xì)菌、真菌、原生動物和病毒產(chǎn)生和釋放的蛋白質(zhì),大腸埃希氏菌的毒力因子種類繁多,其中腸毒素、志賀類菌素、菌毛黏附素和毒力島等是最常見的毒力因子[21]。本研究中檢測出的毒力基因主要是fimC(100%)、ompA(100%)、F17(62.03%)及部分HPI(17.72%)大腸埃希氏菌常見的黏附素K88、K99、F41、987P毒力因子均不攜帶,與宋康[22]的研究結(jié)果黏附素K99、F41陽性率為92.5%存在差異;與姚望遠(yuǎn)等[23]關(guān)于青海腹瀉牦牛大腸埃希氏菌分離株的生物學(xué)特性研究比較而言存在較大差異,該研究表明青海地區(qū)大腸埃希氏菌的優(yōu)勢毒力基因sfa占比96.9%,大部分大腸埃希氏菌的進(jìn)化群屬A型(79.5%),所檢測的大腸埃希氏菌菌株中優(yōu)勢血清型為O91和O145,分別占15.4%和14.4%,與本研究關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。79株大腸埃希氏菌菌株檢測出16種血清型, O25、O55和O107為優(yōu)勢血清型;同時陳明勇等[24]的研究表明西藏地區(qū)牦牛致病性大腸埃希氏菌O血清型檢測的優(yōu)勢血清型是 O142、O148、O158和O26;達(dá)娃次仁等[25]研究表明,西藏地區(qū)導(dǎo)致牦牛腹瀉大腸埃希氏菌的優(yōu)勢血清型為 O78、O26、O115、O158 和 O14; 高睿等[26]的研究證明陜西省引起犢牛腹瀉的主要致病菌為大腸埃希氏菌,其優(yōu)勢血清型為O2、O86和O101。以上研究與青海地區(qū)大腸埃希氏菌O血清型優(yōu)勢血清與其他地區(qū)所報告的并不相符。79株大腸埃希氏菌的系統(tǒng)進(jìn)化分群為A、B1、B2這3個組群,未檢測出D群,其中優(yōu)勢群為B1群,其次為A群。江婉琳等人的研究表明新疆克拉瑪依地區(qū)奶牛源致病性大腸埃希氏菌的系統(tǒng)進(jìn)化群主要是B1群,其次為A群,與本研究一致[13],然而張星星等[27]的研究表明新疆犢牛源大腸埃希氏菌系統(tǒng)進(jìn)化群主要是A群,D群與本研究存在差異。研究表明,大腸埃希氏菌的致病力與系統(tǒng)進(jìn)化分群有關(guān),其中A和B1群為條件致病群,因毒力較弱直接引起宿主患病的概率較低,但在宿主免疫力降低時則會發(fā)揮致病性,與本研究的結(jié)論一致;其中B2和D與致病性緊密相關(guān),因其可攜帶大量毒力因子[28-29]。引起腹瀉的大腸埃希氏菌主要發(fā)生在A、B1和D群,引起腸外感染的主要分布于B2群。研究表明,B1群菌株從家養(yǎng)動物中分離的頻率較高,人類宿主中分離的大腸埃希氏菌主要為B2和A群,這些研究表明大腸埃希氏菌系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)與大腸埃希氏菌定植的自然宿主類型之間存在關(guān)聯(lián)[30]。綜上所述,說明對于引起犢牛腹瀉的大腸埃希氏菌的血清型、系統(tǒng)進(jìn)化分群,以及攜帶的毒力因子等,不同區(qū)域之間存在差異,雖具有相似性但致病機(jī)理還是存在差異。腹瀉病的防治需考慮地域因素,且需要對不同地區(qū)的致病性大腸埃希氏菌的致病機(jī)理、血清型、耐藥性、毒力基因等進(jìn)行研究分析,才能確保后續(xù)對該病的防治和治療方案是切實有效的。本研究證實,青海省牦牛源大腸埃希氏菌臨床菌株具有多種O血清型,普遍攜帶多種毒力基因,且大多數(shù)菌株屬B1條件致病群,通過本研究了解了青海犢牛源大腸埃希氏菌的遺傳特征、毒力之間的相關(guān)性,對犢牛大腸埃希氏菌性疾病的防控具有重要意義。