束忠濤 王冉 沈元朝 張漢澤 朱樹嬌 王姝璇 孫利廠

摘要：噬菌體裂解酶因高效、安全的殺菌特性成為潛在的抗菌藥物，并受到廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)在前期通過基因表達(dá)制備高效噬菌體裂解酶Lys BT1的基礎(chǔ)上，深度解析Lys BT1與細(xì)菌上裂解酶受體相互作用的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，成功構(gòu)建出質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1。將該質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入普通小球藻中，電轉(zhuǎn)條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度1.5 kV、脈沖距離2 mm、脈沖時(shí)間0.2 ms，瞬時(shí)表達(dá)后成功進(jìn)行了活性測(cè)定，從而驗(yàn)證了普通小球藻作為裂解酶表達(dá)載體的可行性，為噬菌體裂解酶的表達(dá)系統(tǒng)研發(fā)提供了一條可行路徑。

關(guān)鍵詞：噬菌體裂解酶；小球藻;電轉(zhuǎn)化；抗菌藥物

中圖分類號(hào)：Q939.48文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0734-06

Expression of bacteriophage lyase gene Lys BT1 in Chlorella vulgaris

SHU Zhong-tao1，2，WANG Ran2，SHEN Yuan-chao2，ZHANG Han-ze1，2，ZHU Shu-jiao2，WANG Shu-xuan2，SUN Li-chang2

（1.School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Bacteriophage lyase has become a potential antibacterial drug due to its high efficiency and safe bactericidal properties， and has been widely concerned. In this study， based on the preparation of high-efficiency bacteriophage lyase Lys BT1 by gene expression in the early stage， we deeply analyzed the structural characteristics of Lys BT1 interacting with the lyase receptor on bacteria， and successfully constructed the plasmid pCAMBIA 1301-BT1. The plasmid was introduced into Chlorella vulgaris by electrotransformation. The electrotransformation conditions were as follows： electric field intensity of 1.5 kV， pulse distance of 2 mm， and pulse time of 0.2 ms. After transient expression， the activity determination was successfully carried out. Therefore， the feasibility of Chlorella vulgaris as a lyase expression vector was verified， which provided a feasible path for the development of bacteriophage lyase expression system.

Key words：bacteriophage lyase;Chlorella vulgaris;electrotransformation

噬菌體裂解酶（Bacteriophage lyase）現(xiàn)已在多個(gè)領(lǐng)域顯示其優(yōu)越性和獨(dú)特性，有望成為后抗生素時(shí)代控制食源性致病菌、腐敗菌，保障食品安全的有效殺菌劑[1]。目前使用較多的外源表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌[2]和酵母[3]等，但這些表達(dá)系統(tǒng)仍存在安全性不高、易污染、表達(dá)量低等問題?；蚬こ讨参锞哂胁煌谂囵B(yǎng)細(xì)胞的性能特征，如光合生長和易于分級(jí)，然而，由于繁瑣的遺傳方法、緩慢的生長速度、較低的產(chǎn)量以及監(jiān)管方面的限制等，其發(fā)展?jié)摿€沒有得到充分實(shí)現(xiàn)。微藻的生長條件要求簡(jiǎn)單，且微藻具備植物基因組轉(zhuǎn)錄后翻譯處理能力，同時(shí)微藻具備微生物快速生長和高密度培養(yǎng)特性[4]。目前作為表達(dá)載體的微藻有萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）[5]、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）[6]、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[7]、普通小球藻（Chlorella vulgaris）[8]等。

普通小球藻是小球藻中目前最廣泛培養(yǎng)的藻種之一[9]，富含蛋白質(zhì)和各種其他營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量超過50%[10]，具有重要的商業(yè)價(jià)值，也是目前研究和認(rèn)證的人類食品之一[11]。因其生長速度快、易培養(yǎng)和可塑性強(qiáng)的特性，常被作為外源基因表達(dá)平臺(tái)的首選。Hawkins和Nakamura[12]1999年使用PEG轉(zhuǎn)化法將人生長激素基因（hGH）在普通小球藻中成功進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)。Koo等[13]采用電擊法將牛乳鐵蛋白N-端肽段成功在普通小球藻中獲得表達(dá)。Ng等[14]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在普通小球藻中成功誘導(dǎo)表達(dá)YoeBSpn-GFP和PezT-GFP融合基因，并測(cè)試了其致病性。Shin[8]2020年在氮缺失的條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得hG-cSf多肽。

本試驗(yàn)在前期表達(dá)制備高效噬菌體裂解酶LysBT1（廣譜噬菌體裂解酶）的基礎(chǔ)上，采用噬菌體基因組深度解析及高分辨率X射線晶體和冷凍電鏡技術(shù)，深度解析裂解酶Lys BT1與細(xì)菌上裂解酶受體互作的酶活性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、決定裂解譜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)、酶結(jié)構(gòu)功能的鑒定與預(yù)測(cè)。針對(duì)超級(jí)耐藥細(xì)菌寬譜裂解酶的設(shè)計(jì)，本研究以細(xì)菌上裂解酶的受體為靶標(biāo)，基于酶結(jié)構(gòu)的分子改良、修飾和裂解酶活性中心定向設(shè)計(jì)，研制出對(duì)耐藥菌的寬譜裂解酶，并提高裂解酶的穩(wěn)定性和抑菌活性;通過CRISPR定點(diǎn)基因編輯技術(shù)在普通小球藻中進(jìn)行基因改造，成功構(gòu)建質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1，并在普通小球藻中完成表達(dá)。

1材料及方法

1.1試驗(yàn)材料

普通小球藻、TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌ATCC 25922等均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;高純度質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司;LB肉湯培養(yǎng)基購自BD Difco公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1藻種的培養(yǎng)和生長曲線的測(cè)定將對(duì)數(shù)生長末期的小球藻培養(yǎng)液按10％的接種量接入裝有50 ml培養(yǎng)基的150 ml錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照度2 640 lx，濕度72%，光/暗周期12 h/12 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5） ℃。定期測(cè)定藻液560 nm處的吸光度（OD），檢測(cè)小球藻的生長速度。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建參照本研究室前期方法[15]進(jìn)行試驗(yàn)。裂解酶基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建方法如下：首先，提取噬菌體V-EcoM-C1 的基因組，然后以其為模板、以Lys BT1-F、Lys BT1-R為引物擴(kuò)增噬菌體裂解酶基因。擴(kuò)增程序：預(yù)變性溫度95 ℃，持續(xù)5 min;變性溫度95 ℃，持續(xù)30 s，退火溫度62 ℃，持續(xù)30 s，延伸溫度72 ℃，持續(xù)1 min，共30個(gè)循環(huán);最后延伸溫度72 ℃，持續(xù)10 min?；厥漳康钠魏笥肊coRⅠ和 NotⅠ進(jìn)行雙酶切。將雙酶切后的目的片段連接至經(jīng)Eco RⅠ和NotⅠ雙酶切后的pCAMBIA 1301載體，再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1轉(zhuǎn)化至TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆并測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)載體pCAMBIA 1301-BT1。

1.2.3重組克隆轉(zhuǎn)化取兩支100 μl冰上融化的TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞，分別加入10 μl構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1，溫和吹打混勻后轉(zhuǎn)移至冰上，靜置30 min;在42 ℃水浴鍋中熱激45～60 s，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2 min。向離心管中加入700 μl無抗性LB培養(yǎng)液，37 ℃ 200 r/min復(fù)蘇60 min，再吸取80 μl復(fù)蘇液均勻涂布到含有50 μg/ml卡那霉素的LB固體平板上，將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，在10 ml的EP管中加入5 ml的LB培養(yǎng)基，挑取抗性平板上的單菌落在培養(yǎng)基中攪拌，過夜培養(yǎng)。

1.2.4質(zhì)粒的提取及驗(yàn)證采用北京擎科生物科技股份有限公司高純度質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取，并進(jìn)行核酸驗(yàn)證。

1.2.5瞬時(shí)轉(zhuǎn)化取對(duì)數(shù)生長期的小球藻，稀釋含量梯度至1×108左右;取藻液3～5 ml用BG11洗滌3次，5 000 r/min 5 min;加入山梨醇和甘露醇各100 μl;3 000 r/min離心5 min收集菌體，加入HEPES緩沖液（2.38 g溶于9 ml）混勻，提前用PE紫外燈處理電轉(zhuǎn)杯（注意是否吹干），預(yù)冷備用，將電轉(zhuǎn)杯冰浴30 min后放入電擊轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，電場(chǎng)強(qiáng)度為1.5 kV，脈沖距離2 mm，脈沖時(shí)間為0.2 ms，立即加入100 μl預(yù)冷的BG11液體培養(yǎng)基，將混合液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，再加入0.9 ml BG11培養(yǎng)基，然后在光照條件下恢復(fù)培養(yǎng)48 h。

1.2.6熒光顯微鏡鏡檢取20 μl恢復(fù)后的藻液在熒光顯微鏡下觀察。在無光和有光兩種不同條件下觀察、對(duì)比熒光顯微鏡下的小球藻。

1.2.7噬菌體裂解酶活性測(cè)定將恢復(fù)24 h后的小球藻放入離心機(jī)中按12 000 r/min離心2 min，收集上清液。將沉淀的藻體用BG11懸浮，再放入超聲波破碎儀中按 300 W 15 min破碎，離心收集上清液。通過點(diǎn)樣雙層（底層為1.2% LB，上層為0.6% LB和菌液的混合物）方式檢驗(yàn)上清液中酶的活性，本次所選菌株為大腸桿菌ATCC 25922。

1.2.8最小抑菌濃度測(cè)定將ATCC 25922以挑取單菌落的方式接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～6 h至對(duì)數(shù)期，用PBS洗滌3次，調(diào)整至OD600為0.6，再用LB培養(yǎng)基按照1∶100稀釋后備用。將分離、純化、濃縮后的噬菌體裂解酶質(zhì)量濃度調(diào)整至512 μg/ml，在96孔板前3排的第1列加入200 μl裂解酶，第2～12列各加入100 μl PBS，從第1孔吸取100 μl裂解酶依次向后倍比稀釋至第10孔，1～11孔添加100 μl稀釋后的菌液，12孔加100 μl LB。每梯度裂解酶濃度設(shè)置3組對(duì)照，并設(shè)置空白對(duì)照和陽性對(duì)照，在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，以完全不生長細(xì)菌的裂解酶質(zhì)量濃度為最小抑菌濃度。

2結(jié)果與分析

2.1小球藻的生長曲線

按10%的接種量培養(yǎng)，培養(yǎng)21 d，如圖1所示，在培養(yǎng)的第14～15 d生長速率達(dá)到最快，認(rèn)為此期處于對(duì)數(shù)生長期。

2.2表達(dá)的陽性克隆篩選

正常的TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞對(duì)卡那霉素敏感，在培養(yǎng)基中無法生長，只有攜帶重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1的TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞能成功在卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長，圖2顯示，在含卡那霉素培養(yǎng)基（100 μg/ml）上有單菌落生長，因此可以推斷，重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1在TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。

2.3陽性克隆的核酸分析

試驗(yàn)通過提取過夜培養(yǎng)的TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞DNA做電泳，從圖3可以看出試驗(yàn)組在12 000 bp附近有條帶，與擬轉(zhuǎn)染的噬菌體裂解酶相對(duì)分子質(zhì)量相符。

2.4轉(zhuǎn)染后小球藻的熒光反應(yīng)

以轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的小球藻作為試驗(yàn)組，未導(dǎo)入質(zhì)粒的小球藻作為空白對(duì)照組，將兩組小球藻在白光和激發(fā)光的條件下于熒光顯微鏡下觀察，在白光條件下，兩組均能看到清晰藻體;在激發(fā)光條件下，試驗(yàn)組有明顯的紅色熒光，而對(duì)照組一片黑暗（圖4）。重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1有熒光標(biāo)簽，故推斷試驗(yàn)組成功表達(dá)了質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1。

2.5噬菌體裂解酶的活性

取適量成功轉(zhuǎn)染陽性的小球藻液，離心分離藻液上清液和小球藻破碎后上清液來檢測(cè)小球藻表達(dá)的噬菌體裂解酶的活性。如圖5所示，離心分離藻液的上清液對(duì)大腸桿菌ATCC 25922無明顯的殺菌效果，小球藻破碎后離心后的上清液對(duì)大腸桿菌ATCC 25922有良好的殺菌效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻系統(tǒng)表達(dá)的噬菌體裂解酶能成功裂解致病菌，且該裂解酶殺菌活性良好。

2.6噬菌體裂解酶的最小抑菌質(zhì)量濃度

如圖6所示，質(zhì)量濃度在32 μg/ml時(shí)有明顯分界點(diǎn)，在大于該質(zhì)量濃度時(shí)有明顯的抑菌效果，小于該質(zhì)量濃度時(shí)則抑菌效果較差，由此得出最小抑菌質(zhì)量濃度為32 μg/ml。

3討論

自從科研人員首次嘗試在小球藻中表達(dá)異源蛋白質(zhì)以來，相關(guān)研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。盡管異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量相對(duì)較低，但小球藻具有快速生長、易于培養(yǎng)以及進(jìn)行翻譯后修飾的能力等顯著優(yōu)勢(shì)，因此發(fā)展前景廣闊。當(dāng)前如何提高生產(chǎn)能力仍然是小球藻異源蛋白質(zhì)商業(yè)化的主要挑戰(zhàn)，這取決于開發(fā)用于改進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)、培養(yǎng)系統(tǒng)和下游基于生物煉制的綜合生產(chǎn)的新型遺傳工具箱方面的重大研究進(jìn)展。這些領(lǐng)域的創(chuàng)新和突破將大大提高生產(chǎn)能力、降低生產(chǎn)成本，從而使小球藻成為異源蛋白質(zhì)表達(dá)的競(jìng)爭(zhēng)宿主。目前已報(bào)道的小球藻有效遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌侵染法[16]、基因槍法[17]、電擊轉(zhuǎn)化法[18]、聚乙二醇融合法[19]等。電擊轉(zhuǎn)化法是小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中較為常用的轉(zhuǎn)化方法[20]，牟云等[21]成功通過構(gòu)建電擊轉(zhuǎn)化體系在沙漠小球藻中表達(dá)人乳鐵蛋白;Zhang等[22]以電穿孔的方式將來自大豆的轉(zhuǎn)錄因子基因GmDof4轉(zhuǎn)化到小球藻中。普通小球藻作為可持續(xù)的、安全的生物制造商業(yè)理想分子平臺(tái)，盡管目前遺傳工具的開發(fā)略顯落后，沒有能進(jìn)行商業(yè)化的生物治療平臺(tái)[23]，但在這一領(lǐng)域普通小球藻具有不可替代的潛力。近年來，雖然關(guān)于外源基因在小球藻中轉(zhuǎn)化表達(dá)的研究不斷取得進(jìn)展[24]，但是仍然存在很難進(jìn)行基因工程改良、外源蛋白質(zhì)表達(dá)水平低且不穩(wěn)定[25-26]等問題。

Lys BT1作為一種嵌合式廣譜噬菌體裂解酶，在通過基因分析、篩選和預(yù)測(cè)后，剪切出具有所需能力的基因片段，并利用CRISPR定點(diǎn)基因編輯技術(shù)在小球藻中進(jìn)行基因改造，實(shí)現(xiàn)裂解酶基因多拷貝整合和小球藻、枯草芽孢桿菌高效表達(dá)裂解酶代謝工程改造，實(shí)現(xiàn)裂解酶基因高效表達(dá)，并以小球藻構(gòu)建微藻載藥系統(tǒng)。將含有Lys BT1基因片段進(jìn)行整合，構(gòu)建出質(zhì)粒pCAMBIA 1301-BT1，通過克隆和驗(yàn)證后，利用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒導(dǎo)入普通小球藻，通過熒光顯微鏡鏡檢證明噬菌體裂解酶基因在小球藻中表達(dá)成功，并通過對(duì)目標(biāo)菌的殺菌活性和最小抑菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)的裂解酶有著良好的抑菌殺菌效果。本試驗(yàn)為噬菌體裂解酶的表達(dá)系統(tǒng)研發(fā)提供了一條新思路。不過，目前該表達(dá)系統(tǒng)只能瞬時(shí)表達(dá)裂解酶基因，后續(xù)仍需要進(jìn)一步完善。

4結(jié)論

本試驗(yàn)利用普通小球藻作為表達(dá)平臺(tái)，成功表達(dá)了具備良好活性的裂解酶Lys BT1。這為裂解酶大規(guī)模生產(chǎn)提供了一種可能，但目前仍處于待完善階段，未來可研發(fā)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化裂解酶Lys BT1的普通小球藻系統(tǒng)，應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）

收稿日期：2023-08-31

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（22）2017];江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃一帶一路創(chuàng)新合作項(xiàng)目（BZ2021009）;國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFE0101800）

作者簡(jiǎn)介：束忠濤（1996-），男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事食品安全研究；（E-mail）404339600@qq.com。王冉為共同第一作者。

通訊作者：孫利廠，（E-mail）sunlc@jaas.ac.cn