任永恒綜述,苗春雷,白 南,陳遠(yuǎn)征審校

0 引 言

據(jù)統(tǒng)計(jì),2021年全球已有5.29億人患有糖尿病,到2050年這一數(shù)字將達(dá)到13.1億[1]。在糖尿病高糖微環(huán)境下,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移活性降低、膠原蛋白合成功能障礙和生長因子抵抗共同導(dǎo)致上皮形成能力下降,從而引起糖尿病創(chuàng)面長期遷延不愈[2-3]。糖尿病創(chuàng)面的常規(guī)治療方法主要有加強(qiáng)臨床護(hù)理、降低局部壓力、改善微循環(huán)和控制炎癥反應(yīng)等[4-5],但這些方法并不能從根本上解決問題,且遠(yuǎn)期效果并不理想,所以探討更高效的促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的方法成為研究熱點(diǎn)[6]。干細(xì)胞療法已被證明在慢性創(chuàng)面治療上發(fā)揮了重要作用,其中治療效果比較好的干細(xì)胞為脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)[7],因其具有獲取方便、儲(chǔ)備量大和增殖速度快等優(yōu)勢,常被用于組織的再生和修復(fù)[8],然而干細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出存活率低、致瘤性和異質(zhì)性等問題[9-10],因此其移植治療一直存在爭議,所以需要尋找一種新的風(fēng)險(xiǎn)較低的治療方法。脂肪細(xì)胞外基質(zhì)/基質(zhì)血管組分凝膠(adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel,SVF-gel)作為近年來新興的脂肪組織衍生物開始被廣泛研究,因其中包含的高密度細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和基質(zhì)血管組分(stromal vascular fraction,SVF)等多種生物活性物質(zhì)在難愈性創(chuàng)面的修復(fù)中得到了明確應(yīng)用,使得SVF膠成為治療糖尿病創(chuàng)面的新穎療法之一。本文就SVF膠治療糖尿病創(chuàng)面的作用機(jī)制及其應(yīng)用作一綜述。

1 SVF膠

1.1 SVF膠制備在無菌條件下,Yao等[11]采用吸脂的方法將所獲取的脂肪組織在冰水混合物中靜置,棄去液體層后置入離心機(jī)中,以1200×g離心3 min后靜置,去除最下層無用液體,保留最上層油脂及中間層脂肪。取2個(gè)10 mL注射器,用魯爾連接器(Luer-Lok connector)連接兩個(gè)注射器口,達(dá)到密封對(duì)接。置入第一步離心后的中間層脂肪,推動(dòng)含有脂肪組織側(cè)的注射器活塞,以10 mL/s的恒定速度將脂肪組織通過連接器推注至對(duì)側(cè)注射器中,如此反復(fù)推注約2 min。推注完成后,兩注射器同時(shí)回抽形成真空負(fù)壓狀態(tài),充分破碎脂肪組織,直至脂肪顆粒成絮凝狀、蛋花樣即可。再經(jīng)納米過濾器過濾掉多余的結(jié)締組織,加入第一步離心所保留的最上層油脂后混合,再次置于離心機(jī)中,以2000×g離心3 min后靜置,中間層黏性凝膠狀物即為所需的SVF膠。

1.2SVF膠成分用膠原酶等相關(guān)酶消化剪碎的成熟脂肪組織,可得到一種獨(dú)特的、不含脂肪細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞混合物,稱為SVF。SVF是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng),不僅包括ADSCs,還包括內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞等[12]。SVF膠的制作加工過程是通過簡單的物理方法對(duì)成熟脂肪組織進(jìn)行破碎和離心,高度濃縮了ECM和SVF等活性成分,其有核活性細(xì)胞數(shù)量約為4.56×105cells/mL,顯著高于納米脂肪的4.12×104cells/mL[13],雖然最終產(chǎn)物在體積上被高度濃縮為初始的十分之一,但具備了高功能的細(xì)胞密度。置于電鏡下觀察時(shí),其內(nèi)可見大小不等的細(xì)胞及部分脂肪組織結(jié)構(gòu)均勻分散,在濃縮的ECM支架上附著大量SVF細(xì)胞以及破裂的成熟脂肪細(xì)胞壁和毛細(xì)血管碎片[14]。此外,相比于含有同等SVF細(xì)胞數(shù)的Coleman脂肪而言,SVF膠中濃縮的ECM(其中包含膠原蛋白、纖維蛋白和彈性蛋白等)更多,在調(diào)節(jié)細(xì)胞行為、刺激細(xì)胞增殖、激活細(xì)胞分化潛能及促進(jìn)生長因子分泌的同時(shí),可使細(xì)胞免于巨噬細(xì)胞的吞噬[11],從而起到了為ADSCs等活性細(xì)胞提供適宜生存微環(huán)境的作用。

2 SVF膠活性成分修復(fù)糖尿病創(chuàng)面機(jī)制

2.1 ADSCs糖尿病創(chuàng)面的典型表現(xiàn)包括血液循環(huán)不良、異常炎癥和最外層表皮防御屏障生成障礙[15]。在創(chuàng)面愈合的過程中,結(jié)締組織中的細(xì)胞通過分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,使創(chuàng)面邊緣完整的血管以萌發(fā)或發(fā)芽的方式形成新生血管是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16-17]。Chang等[18]將成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)誘導(dǎo)ADSCs產(chǎn)生的增強(qiáng)型ADSCs局部注射于糖尿病大鼠足部創(chuàng)面周圍,經(jīng)TUNEL試驗(yàn)驗(yàn)證了其對(duì)創(chuàng)面周圍組織凋亡的抑制作用,同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,刺激血管的新生,增強(qiáng)創(chuàng)面的血流,加速了糖尿病傷口的閉合。Cao等[19]在建立糖尿病大鼠創(chuàng)面模型的過程中表述,經(jīng)ADSCs注射治療的第14天,創(chuàng)面愈合率為86.76%±5.5%,顯著高于對(duì)照組的37.91%±5.05%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并對(duì)ADSCs進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)其具有比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更高的血管生成相關(guān)基因表達(dá)水平,可見基于ADSCs的治療加速了糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合。

ADSCs還可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)和抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)[20],減緩糖尿病創(chuàng)面的炎癥進(jìn)程。M1型巨噬細(xì)胞受腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和脂多糖等促炎因子調(diào)控,產(chǎn)生白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-12、IL-23和活性氧等加重組織損傷。相反,M2型巨噬細(xì)胞受IL-4和IL-10等抗炎因子刺激,釋放轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)等加快組織愈合[21-22]。Shi等[23]研究證實(shí)ADSCs通過分泌高表達(dá)circ-Snhg11的外泌體,與下游的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)受體作用,激活miR-144-3p/HIF-1α通路,抑制高糖微環(huán)境誘導(dǎo)的炎性因子IL-1β和TNF-α的釋放,同時(shí)維持M2型巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài),加快糖尿病小鼠的創(chuàng)面愈合速率,調(diào)節(jié)創(chuàng)面中炎癥水平。Chen等[24]為評(píng)價(jià)ADSCs促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的能力,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定了經(jīng)ADSCs注射治療前后的糖尿病大鼠創(chuàng)面炎癥因子表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-10的表達(dá)上調(diào),同時(shí)TNF-α的表達(dá)下調(diào),表明ADSCs可通過直接分泌或旁分泌的方式抑制炎癥介質(zhì)的釋放[25],具有減輕糖尿病創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的功能。

當(dāng)皮膚發(fā)生損傷后,其修復(fù)過程依賴角質(zhì)細(xì)胞的上皮化[26-27]。Amidzadeh等[28]使用含角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs,檢測到角質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(角蛋白10、外膜蛋白、膠原蛋白-1和波形蛋白)的表達(dá),結(jié)果說明皮膚損傷引起成纖維細(xì)胞高表達(dá)的KGF可以刺激ADSCs向上皮角質(zhì)細(xì)胞方向分化,加快創(chuàng)面的修復(fù)。此外,Hasegawa等[29]在研究ADSCs修復(fù)創(chuàng)面的機(jī)制時(shí),通過流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡等技術(shù)檢測到ADSCs群體內(nèi)存在p63和DSG3等角質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)記物,且當(dāng)其與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),可以檢測到角蛋白5及DSG3表達(dá)的上調(diào),由此可看出ADSCs在特定環(huán)境下可被誘導(dǎo)形成上皮細(xì)胞,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。Wang等[30]不僅在體外觀察到ADSCs分泌的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)通過Fas/Fasl信號(hào)通路抑制角質(zhì)細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移及其在體外促血管生成中的旁分泌作用,還在糖尿病小鼠體內(nèi)證實(shí)了ADSCs釋放的EVs加快了糖尿病創(chuàng)面的血管生成及再上皮化。不難看出,ADSCs在糖尿病創(chuàng)面治療中的效果是肯定的[31]。

2.2ECMECM是由膠原、蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等成分組成的非細(xì)胞三維大分子結(jié)構(gòu),基質(zhì)各成分之間以及細(xì)胞與黏附受體間的結(jié)合,形成了一個(gè)持續(xù)分解與重構(gòu)的動(dòng)態(tài)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),居住于其中的多種細(xì)胞通過表面受體將ECM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi),調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)生理功能,對(duì)維持正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[32]。傷口愈合過程被劃分為炎癥、增殖和重塑三個(gè)階段,涉及皮膚不同部位的不同細(xì)胞成分與相關(guān)ECM組分間的廣泛溝通[33]。

創(chuàng)面修復(fù)的過程始終離不開多種生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)控[34],許多生長因子已被發(fā)現(xiàn)可與ECM組分相互作用,如VEGF、IGF-I、IGF-II、TGF-β、KGF、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、FGF、TNF-α、IL-6等[35]。Ishihara等[36]發(fā)現(xiàn)ECM中包含的多種結(jié)構(gòu)蛋白可與VEGF和PDGF等結(jié)合,延緩生長因子釋放速度來增加其組織留存時(shí)間的同時(shí),顯著提升生長因子在體內(nèi)促進(jìn)糖尿病傷口愈合的功效。ECM作為生長因子的儲(chǔ)存和隔離場所,在保留內(nèi)源性生長因子和吸附外源性生長因子的同時(shí)[37],通過直接結(jié)合的方式將它們的活性集中在細(xì)胞附近,并保護(hù)它們免受降解[38]。Martino等[39]分別將上述兩種血管生成相關(guān)生長因子與融合了胎盤生長因子-2的ECM蛋白結(jié)合,發(fā)現(xiàn)結(jié)合了ECM的生長因子促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面修復(fù)的能力得到增強(qiáng)。此外,纖維蛋白-2可與TGF-β結(jié)合蛋白-1競爭TGF-β結(jié)合位點(diǎn)并促進(jìn)TGF-β的釋放,與之相反,纖維蛋白-4通過R-Smad通路抑制TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo),表現(xiàn)出負(fù)性調(diào)節(jié)能力,可見ECM可對(duì)生長因子的生物活性進(jìn)行調(diào)控[40]。

ECM始終與干細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)溝通和相互作用,不僅是細(xì)胞結(jié)構(gòu)不可分割的部分,而且還指導(dǎo)和支持干細(xì)胞的命運(yùn)、形態(tài)變化、黏附、增殖、生存和分化等過程[41]。ECM通過內(nèi)部的多種基質(zhì)細(xì)胞蛋白或直接與細(xì)胞表面的整合素家族跨膜受體結(jié)合的方式,傳導(dǎo)影響細(xì)胞行為的外部信號(hào),而整合素的活化又可使ECM與細(xì)胞間的黏附力增加和基質(zhì)重塑,更有利于細(xì)胞發(fā)揮遷移、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能[42-44]。皮膚內(nèi)存在的ig-h3蛋白是一種由TGF-β誘導(dǎo)的ECM糖蛋白[45],Li等[46]將ig-h3蛋白加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)物中,進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析,觀察到增殖標(biāo)志物PCNA、Ki67和表皮干細(xì)胞標(biāo)志物P63、KRT14的表達(dá)增加,同時(shí)基于轉(zhuǎn)錄組分析后證實(shí),ig-h3蛋白通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)創(chuàng)面愈合所需表皮干細(xì)胞的生長、增殖和功能的維持。由此可看出,ECM具有特定的功能,可與嵌入的細(xì)胞相互作用,指導(dǎo)并調(diào)節(jié)細(xì)胞活性,有效的促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合。

細(xì)胞所駐留的、復(fù)雜的動(dòng)態(tài)細(xì)胞外微環(huán)境,也被定義為細(xì)胞生態(tài)位[47-48],由ECM、EVs和生長因子組成,其中ECM提供的三維結(jié)構(gòu)是組成生態(tài)位的主要成分,支持細(xì)胞黏附和存活,調(diào)節(jié)其行為和命運(yùn)[49]。在新生肉芽組織中,成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞需要TGF-β為主的化學(xué)信號(hào)和ECM提供的機(jī)械信號(hào),機(jī)械信號(hào)通常來自于ECM蛋白質(zhì)的組分變化、重排列和激活,引起ECM硬度和剛性改變的同時(shí)又增強(qiáng)TGF-β化學(xué)信號(hào)的激活,并與細(xì)胞形成可傳遞ECM張力的局灶性粘連結(jié)構(gòu)[50-51]。Zhang等[52]運(yùn)用三維生物打印技術(shù)將脂肪衍生脫細(xì)胞基質(zhì)(adipose-derived decellularized ECM,adECM)與甲基丙烯酰明膠和甲基丙烯酰透明質(zhì)酸結(jié)合形成的生物活性支架置入裸鼠背部創(chuàng)面,觀察到adECM組第7天的創(chuàng)面未閉合面積顯著小于無dECM組,此外進(jìn)行的Masson染色中膠原蛋白的沉積及III型/I型膠原的比值和CD31免疫組化染色中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的含量均顯著優(yōu)于無dECM組,證實(shí)ECM形成的細(xì)胞外微環(huán)境有利于ADSCs生物功能的發(fā)揮。

3 SVF膠在糖尿病創(chuàng)面中的應(yīng)用

Xing等[53]用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定的糖尿病大鼠模型,于背部創(chuàng)面分別給予各組治療措施后,在第7、14、21、28天等各時(shí)間點(diǎn)均觀察到高劑量SVF膠組的創(chuàng)面愈合率顯著優(yōu)于其它組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),后續(xù)進(jìn)行的組織染色結(jié)果提示SVF膠增強(qiáng)傷口血管生成及膠原沉積并減輕炎癥及纖維化,同時(shí)猜測SVF膠促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能與MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活相關(guān)。不難看出,應(yīng)用SVF膠對(duì)糖尿病創(chuàng)面進(jìn)行治療的效果是肯定的。楊麗娜等[54]考慮到糖尿病高血糖微環(huán)境對(duì)ADSCs活性的影響,因此將ADSCs與SVF膠聯(lián)合應(yīng)用,觀察到ADSCs的創(chuàng)周皮下注射和創(chuàng)面涂抹聯(lián)合SVF膠的創(chuàng)面涂抹治療組的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合速率顯著高于其它治療組,且炎癥細(xì)胞浸潤較少,毛細(xì)血管及纖維細(xì)胞生長較多,具有更強(qiáng)的促進(jìn)創(chuàng)面愈合能力。因此,SVF膠改善了ADSCs的局部生長環(huán)境,提高了其治療糖尿病創(chuàng)面的效果。

此外,為直觀觀察SVF膠在臨床中治療糖尿病創(chuàng)面的效果,Deng等[55]以常規(guī)負(fù)壓創(chuàng)面治療(negative pressure wound therapy,NPWT)為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)SVF膠組的平均創(chuàng)面愈合率為34.55%±11.18%,而NPWT組為10.16%±2.67%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),同時(shí)進(jìn)行的創(chuàng)面組織學(xué)檢測結(jié)果提示SVF膠組創(chuàng)面的膠原蛋白積聚水平、新生血管數(shù)量均顯著高于對(duì)照組,結(jié)果表明SVF膠有利于糖尿病創(chuàng)面愈合,這與Cai等[56]進(jìn)行的SVF膠治療糖尿病創(chuàng)面長期隨訪結(jié)果相一致,提示了其安全性、有效性和持久性。賀譯賢等[57]選取9例糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面患者,于創(chuàng)傷表面敷以SVF膠并在創(chuàng)面周圍及基底處給予注射治療,發(fā)現(xiàn)SVF膠治療組創(chuàng)面的愈合速率、肉芽組織生長情況及疼痛評(píng)分均明顯優(yōu)于封閉式負(fù)壓吸引治療組且無明顯不良反應(yīng)發(fā)生,此外檢測的創(chuàng)面組織免疫組化結(jié)果提示SVF膠通過下調(diào)金屬蛋白酶-1阻止膠原降解進(jìn)而為糖尿病創(chuàng)面愈合提供適宜條件。這些實(shí)驗(yàn)及臨床案例均表明了SVF膠在促進(jìn)創(chuàng)面愈合上的積極作用并明確了其可行性,為糖尿病創(chuàng)面治療提供了一種更高效快速的方法。

4 結(jié)語與展望

SVF膠作為近年來一種新的脂肪產(chǎn)物,因其將Coleman脂肪中的ECM和SVF細(xì)胞高度濃縮并保留其生物活性而被廣泛研究,其中包含的ECM為SVF細(xì)胞的生長和生物學(xué)功能的發(fā)揮提供了支持微環(huán)境,所以具有比SVF細(xì)胞更好的治療效果。SVF膠通過促進(jìn)血管新生、抑制創(chuàng)面炎癥、刺激上皮形成、活化細(xì)胞和生長因子以及提供間充質(zhì)干細(xì)胞支持微環(huán)境等機(jī)制促進(jìn)糖尿病難愈性創(chuàng)面修復(fù),雖然在被嘗試應(yīng)用于臨床的過程中,受到倫理學(xué)等因素的限制,缺少研究證據(jù)證實(shí)SVF膠的療效,但其已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出了良好的安全穩(wěn)定性及巨大的糖尿病創(chuàng)面治療潛力。此外,將SVF膠與組織工程和其它難愈性創(chuàng)面治療技術(shù)等相結(jié)合,可以進(jìn)一步擴(kuò)展其在臨床上治療糖尿病創(chuàng)面的應(yīng)用前景。至此,呼吁未來開展更多SVF膠的臨床試驗(yàn)完善制備過程,進(jìn)一步提高體積保留率及創(chuàng)面修復(fù)效率,使其成為糖尿病創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域高效的治療方法,為糖尿病患者帶來福音。