王春芳,韓一芳綜述,汪春暉審校

0 引 言

病毒感染性疾病長期以來嚴重威脅人類的健康和生命,疫苗的研究誕生和抗病毒藥物的應用使天花被消滅,乙型腦炎等病毒感染性疾病發(fā)病率大幅下降。但病毒性肝炎、出血熱、狂犬病等仍然廣泛存在,同時,艾滋病、傳染性非典型肺炎、中東呼吸綜合征、H7N9禽流感、埃博拉出血熱等新發(fā)感染病不斷出現(xiàn),特別是新型冠狀病毒的出現(xiàn),使得抗病毒類藥物的研發(fā)推上了熱潮。由于針對病毒的相關疫苗及藥物研發(fā)周期長,且易因病毒變異而失效,目前大多數(shù)病毒性疾病缺乏特效的治療藥物。多肽藥物因其獨特的生化特性在抗病毒治療中的應用前景,日益引起人們的關注。本文主要就多肽在病毒感染性疾病中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 多肽的簡介

肽一般由2～50個氨基酸殘基組成,其中2～10個氨基酸組成的肽屬于寡肽,11～50個氨基酸組成的肽屬于多肽,分子量介于小分子和蛋白質之間。多肽分為天然肽和合成肽,天然肽可從動物、植物、微生物中直接提取,合成肽可通過重組技術、固相合成法、α-氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐法、碳酸二甲酯兩步法、N-甲氧?；被嶂苯影邢蛎擊群铣煞ǖ确椒ㄈ斯ず铣伞４送?多肽還通過自組裝作為各種治療藥物的輸送載體。多肽藥物具有生物活性高、免疫原性低、特異性好、組織滲透性好、毒性低安全性好、易于合成和修飾、不易在組織中蓄積等特點。自1921年合成第一個治療性肽胰島素以來,伴隨著結構生物學、重組生物制劑和合成和分析技術的進步,多肽類藥物的研發(fā)已成為藥物研究的熱點之一。

2 多肽的抗病毒作用

目前,抗病毒藥物主要可分為核苷類似物、蛋白酶抑制劑、免疫調節(jié)劑,通過抑制病毒復制、抑制病毒侵入細胞、增強機體免疫力等方面來治療病毒感染。但由于現(xiàn)有抗病毒藥物不良反應以及耐藥性病毒突變體的產(chǎn)生,抗病毒新藥及新療法的研發(fā)尤為重要,近年來多肽類物質的抗病毒作用引起了廣泛關注。抗病毒肽通過不同作用機制展現(xiàn)出強有效的抗病毒作用,且對包膜病毒和非包膜病毒均具有抗病毒活性。根據(jù)已知的病毒蛋白結構及其細胞靶點,可合理設計和優(yōu)化不同靶定區(qū)域、不同長度的抗病毒多肽,所合成的多肽對靶點具有高度特異性,通過篩選得到對特定的病毒病原體具有廣泛抗病毒活性的多肽。

2.1抗包膜病毒

2.1.1 抗新型冠狀病毒多肽嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)是一種包膜正義單鏈RNA病毒,病毒基因組編碼四種主要的結構蛋白,刺突蛋白S(spike protein)、N蛋白(nucleocapsid protein)、M蛋白(membrane protein) 和E蛋白(envelope protein)。S蛋白介導病毒與宿主細胞膜之間以及感染細胞和鄰近未感染細胞之間的附著和融合,是冠狀病毒感染細胞的核心蛋白。雖然現(xiàn)有疫苗接種有一定的控制感染和重癥的作用,但由于SARS-CoV-2突變體的快速迭代,而無法提供長期的有效保護。目前研究的抗新冠病毒多肽作用方式主要體現(xiàn)在以下幾個方面:①多肽可通過靶向S蛋白中的宿主細胞受體結合域(receptor binding domain, RBD)來抑制其與宿主血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)的結合進而抑制病毒的感染。有研究報道,由人腸道潘式細胞分泌的防御素5(human defensin-5,HD5)可通過靶向宿主ACE2,抑制其與S蛋白的RBD結合,進而減少SARS-CoV-2侵入細胞[1];Beddingfield等[2]發(fā)現(xiàn)纖連蛋白衍生的多肽ATN-161,可能通過與整合素RGD基序(arginine glycine aspartate sequence)附近位點的結合抑制整合素α5β1-S和蛋白RBD復合物的形成,從而抑制病毒感染。此外,一種由人氣道上皮細胞產(chǎn)生的天然肽LL-37與S1RBD結合,也具有抑制SARS-CoV-2假病毒顆粒感染的潛能[3]。2020年4月初,研究者首次探索口服 LL-37抗COVID-19 的初步療效,入組的11例輕型患者,對該藥均具有較好的耐受性、依從性,服藥后未出現(xiàn)不良反應,消化道和全身癥狀改善尤為顯著[4]。隨后研究表明,LL-37可阻斷 SARS-CoV-2 刺突蛋白和宿主受體 ACE2的結合,限制SARS-CoV-2 感染[3]。但是由于患者數(shù)量少,臨床證據(jù)不足。為進一步評估口服 LL-37 的有效性并證明其對 Omicron的確切治療效果,Zhao等[5]進行了一項臨床試驗,研究中共納入238例輕度奧密克戎BA.5感染住院患者(129例接受口服LL-37,109例口服接受乳酸桿菌,發(fā)現(xiàn)口服LL-37有較高的安全性,而且早期口服LL-37進行干預治療效果更好,具有對抗SARS-CoV-2其他突變體的應用前景。②多肽以激活S蛋白的水解酶弗林蛋白酶(furin)和跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)為靶向,是治療SARS-CoV-2的另一種策略。有研究發(fā)現(xiàn)使用弗林蛋白酶抑制劑CMK(decanoyl-RVKR-chloromethylketone)和MI-1851可消除furin的裂解,抑制SARS-CoV-2感染哺乳動物細胞[6-7]。Bestle等[6]測試發(fā)現(xiàn)擬肽抑制劑MI-432及其類似物MI-1900可以通過抑制TMPRSS2復制阻斷病毒感染人呼吸道上皮細胞。③多肽的設計可以計算機分析技術作為輔助工具,針對病毒生命周期的各個階段設計強效SARS-CoV-2抑制劑。有計算機輔助藥物設計發(fā)現(xiàn)SARS-CoV和SARS-CoV-2的S2具有序列高度相似性[8],表明有效阻斷SARS-CoV的多肽也可能抑制SARS-CoV-2感染,為治療SARS-CoV-2提供了新思路。

2.1.2抗人類免疫缺陷病毒多肽獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunedeficiency syndrome, AIDS)簡稱艾滋病,由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起。HIV是一種具有包膜的正鏈RNA病毒,其膜表面嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。在HIV-1感染靶細胞的過程中,gp120與細胞表面的CD4受體和CXCR4或CCR5共受體結合,觸發(fā)gp41的構象變化。目前針對HIV的多肽設計主要是HIV進入抑制劑。HIV進入抑制劑通過靶向病毒表面蛋白或宿主細胞受體來阻斷病毒與宿主細胞的融合或阻斷病毒進入宿主細胞。Bashir等[9]研究發(fā)現(xiàn)人類血紅蛋白a衍生肽的類似物HbAHP-25直接作用于gp120,抑制其與CD4結合,微摩爾水平即可抑制HIV-1感染;Cimbro等[10]關于硫酸化V2模擬肽抑制HIV-1進入和融合的報道,為針對HIV-1的治療和疫苗設計的策略提供了線索;Wang等[11]的研究結果表明,來源于HIV包膜蛋白(Env)胞內(nèi)區(qū)的F9170可靶向HIV包膜蛋白胞內(nèi)區(qū)的LLP1結構域,破壞病毒膜的完整性,使得HIV基因組釋放,失去感染能力。恩夫韋肽(Enfuvirtide)是目前唯一經(jīng)FAD批準用于治療HIV的多肽類藥物。盡管FDA批準的抗HIV肽數(shù)量有限,但是很多肽類藥物已經(jīng)進入臨床研究階段,如西夫韋肽(臨床試驗Ⅲ)和阿達帕韋(臨床試驗Ⅱ),基于肽的HIV進入抑制劑比抗體成本更低,并且比小分子化合物具有更高的特異性[12]。

2.1.3抗流感病毒多肽流感病毒(influenza virus,IV),屬于正黏病毒科,根據(jù)核蛋白和基質蛋白抗原性的不同,可分為甲、乙、丙、丁4種亞型,其中甲型流感病毒(infuenza A virus,IAV)因其常見的抗原飄移和抗原轉變而易引起大流行。IAV為單鏈負鏈8節(jié)段RNA包膜病毒,分別編碼聚合酶B1(PB1)、聚合酶B2(PB2)、聚合酶A(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、基質蛋白(M)、非結構蛋白(NS)。病毒包膜由植物血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和質子通道(M2)組成,病毒的核心由核蛋白(NP)和RNA依賴的三聚體RNA聚合酶組成,該聚合酶又包括三個P蛋白(PB1、PB2和PA),目前抗流感病毒多肽藥物主要以HA、NA、PB1和M2為靶標。

最近Reyes-Barrera等[13]觀察到,天然和合成EB(entry blocker)肽可通過干擾宿主膜糖蛋白的唾液酸(SA)與HA的結合,抑制病毒復制(IC50分別為20.7 nM、754.4 nM),且天然EB肽對IAV流感蛋白的抗病毒效力是合成肽的32倍。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)具有低溶血活性、低細胞毒性和良好藥代動力學特性的errKPAQP(P2)對NA具有較強的親和力, 能夠減少流感病毒誘導的炎癥,并最大限度地降低感染小鼠的死亡率。有實驗表明PB1-0肽可通過阻斷PA-PB1間的相互作用進而抑制病毒復制[15]。Martyna等[16]研究發(fā)現(xiàn)M2AH可通過改變M2蛋白結構,引起病毒膜的變形,中和流感病毒的毒性,從而阻止傳播。目前針對流感病毒包膜和宿主細胞吸附以及整個RNA復制過程的多肽藥物在研,但尚未上市,這些多肽藥物潛在效能有待進一步驗證。

2.1.4抗其他包膜病毒針對丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的合成肽波西普韋(Boceprevir)和特拉匹韋(Telaprevir),于2011 年獲得 FDA 批準,這些肽作用于HCV的NS3/4,干擾病毒的復制[17];來源于兩棲類抗微生物肽的 HS-1 能破壞病毒衣殼從而對抗登革熱病毒[18];依賴于人源細胞發(fā)現(xiàn)人Claudin衍生肽CL7.1(claudin-7)和CL1.1(claudin-1)可阻斷寨卡病毒的膜融合過程,也是廣泛的黃病毒抑制劑[19]。

2.2抗非包膜病毒目前研究的抗病毒多肽活性主要依賴于破壞病毒包膜的特性,而對于非包膜病毒,多肽的研發(fā)主要基于直接與非包膜病毒衣殼相互作用而產(chǎn)生抑制作用。有研究報道人抗菌肽LL-37、豬抗菌肽PG-1和羊抗菌肽SMAP-29均對人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)有直接抗病毒作用[20-21]。α防御素HD5可阻斷人腺病毒(human adenovirus, HAdV)的脫膜和基因組暴露,使病毒侵入細胞時無法脫殼而在溶酶體中積累,從而拮抗病毒感染[22]。乳鐵蛋白對HAdV的抗病毒活性可發(fā)生在感染期間的多個階段[23]。

3 多肽的免疫調節(jié)作用

多肽除抗病毒、殺菌作用之外,還具有免疫調節(jié)作用。

3.1抗原的識別多肽可作為抗原,激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答的分子,基于肽的疫苗已被廣泛用于針對病毒的免疫反應。肽疫苗是通過與患者的人類白細胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)結合進行表達,HLA 分子將肽疫苗呈遞給T細胞受體,從而誘導特異性T細胞反應。有研究報道基于五種來源于HCV基因型1和2的核心、NS3和NS4蛋白的保守區(qū)域設計的肽疫苗IC41,以多聚L-精氨酸為佐劑,在Ⅱ期臨床試驗中,對60名HLA-A2 慢性無應答反應感染者接種IC41,發(fā)現(xiàn)有67%的患者產(chǎn)生T細胞免疫應答反應[24]。

3.2調節(jié)宿主的炎癥反應多肽具有促炎和抗炎作用,可通過作用于先天免疫細胞(如吞噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等),間接調節(jié)趨化因子和固有免疫分子(補體、細胞因子等)的釋放,調節(jié)感染患者體內(nèi)免疫反應來減少病毒感染所引發(fā)的劇烈炎癥反應。細胞因子風暴是SARS-CoV-2重癥感染者的主要死亡原因,有臨床研究表明AMY-101(一種高度選擇性的補體C3抑制劑)可抑制COVID-19患者體內(nèi)通過補體系統(tǒng)(C3)激活導致的炎癥反應,但僅開展了Ⅱ期臨床試驗,明確結果需通過進一步臨床研究完善[25-27]。LL-37通過調節(jié)固有免疫細胞,特別是嗜中性粒細胞IL-8 的釋放,減少IAV對機體肺部的損傷[28],也可抑制巨噬細胞焦亡,誘導促炎細胞因子的釋放[29]。

3.3調節(jié)信號通路多肽可作為信號分子,與免疫細胞上的受體結合影響免疫應答。多肽可以與Toll 樣受體(toll-like receptors, TLRs)信號通路相互作用,影響 Toll 樣受體的識別和免疫應答。有研究表明 HNP-1 能夠與 HAdV-C5、HAdV-D26 和 HAdV-B35 的衣殼直接結合,并將病毒定位到 TLR4 復合物以促進 HAdV 的侵入,并誘導 NLRP3 炎癥小體激活和 IL-1β 釋放[30]。LL-37 能夠通過調節(jié)IIFN 信號通路介導抗 ZIKV 的作用[31]。

綜上所述,多肽可直接作用于病毒顆粒,或者通過干預病毒生命周期的各個階段去阻斷病毒的感染,其作用機制主要分為三種:①干擾病毒的吸附和進入,通過破壞病毒和靶細胞識別和結合過程導致病毒感染失敗;②抑制病毒復制;③參與宿主抗病毒免疫調節(jié)。

4 結 語

多肽藥物相較于小分子藥物具有更好的特異性和生物多樣性,且不良反應低;同時比生物制品(蛋白質或抗體)成本低、組織滲透性好、易于改造。與傳統(tǒng)抗生素相比,具有免疫調節(jié)活性、耐藥性較低等優(yōu)勢。但是多肽的應用也存在以下問題。首先,天然多肽半衰期短、在體內(nèi)穩(wěn)定性差,易受蛋白酶的降解。但有研究指出可通過序列修飾、環(huán)化如聚乙二醇化、擬肽等方法修飾或掩蓋多肽的潛在切割位點,從而減少蛋白酶的識別和蛋白降解,也可納米載體遞送方式解決其分子量較大的問題。其次,多肽如多粘素對機體腎臟和神經(jīng)存在潛在毒性,以及一些抗微生物肽對真核細胞(特別是紅細胞)的毒性作用等不良反應限制了其在臨床上的應用?；瘜W修飾的設計、治療指數(shù)的引入、基于目標的合理化修飾和合成可提高未來多肽的療效。此外,如果要使多肽得到可持續(xù)的應用,就必須掌握它們是否可規(guī)避目前傳統(tǒng)抗病毒藥物耐藥性問題?？傊?抗病毒多肽藥物的研發(fā)由實驗結果轉化為臨床藥物,需完善設計、合成、實驗、臨床試驗等一系列研究過程,以其巨大的抗病毒潛能、市場應用前景和經(jīng)濟優(yōu)勢仍十分具有科學價值。