謝秀菊　夏啟玉　劉帥　麥賢俊　賈瑞宗　郭安平　徐志勝　李峰　孔祥義　趙輝

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因番木瓜；拷貝數(shù)；內(nèi)參基因；數(shù)字PCR；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

番木瓜（Carica papaya L.）是世界四大熱帶、亞熱帶暢銷水果之一。番木瓜環(huán)斑病毒（Papayaringspot virus，PRSV）是危害番木瓜最嚴(yán)重的病毒，其侵染番木瓜植株后，造成番木瓜大面積減產(chǎn)甚至整片果園死亡。1986 年，ABEL 等[1]發(fā)現(xiàn)將病毒基因轉(zhuǎn)入寄主植物，可以導(dǎo)致寄主植物對(duì)病毒產(chǎn)生抗性，此后轉(zhuǎn)基因技術(shù)被應(yīng)用到番木瓜的抗病育種中。第一個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜品種是將夏威夷PRSV 55-1 的外殼蛋白（coat protein， CP）基因轉(zhuǎn)入Sunset 品種中[2]，田間抗性表現(xiàn)相當(dāng)良好，該轉(zhuǎn)基因品種于1997 年在夏威夷獲得商業(yè)化應(yīng)用。隨后，2009 年美國(guó)弗羅里達(dá)大學(xué)的轉(zhuǎn)基因番木瓜X17-2 品系[3]也獲得商業(yè)化應(yīng)用。我國(guó)的番木瓜轉(zhuǎn)基因育種是從1996 年開(kāi)始的，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)出了抗病品系華農(nóng)1 號(hào)，并且在2010 年獲得了國(guó)家頒發(fā)的番木瓜農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)。我國(guó)臺(tái)灣中興大學(xué)的CHENG 等[4]和BAU 等[5-6]也研發(fā)出了轉(zhuǎn)基因番木瓜抗病品系16-0-1、18-2-4等。近些年來(lái)，研究人員仍在不斷進(jìn)行新的番木瓜轉(zhuǎn)基因育種研究。

在轉(zhuǎn)基因植物育種研究中，外源基因整合進(jìn)入受體植物基因組的拷貝數(shù)會(huì)影響外源目的基因的表達(dá)及其遺傳穩(wěn)定性[7]。當(dāng)外源基因以1～2 個(gè)拷貝數(shù)整合到受體基因組時(shí)，一般能夠穩(wěn)定高效表達(dá)，而當(dāng)外源基因以多拷貝數(shù)整合到受體基因組時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)水平較低甚至基因沉默，從而無(wú)法得到表現(xiàn)目的性狀的轉(zhuǎn)基因植株[8-9]。因此，研究人員往往會(huì)選擇單低拷貝整合的株系，然而，單低拷貝整合的轉(zhuǎn)基因株系往往需要從大量T₀代植株中篩選得到。此外，純合轉(zhuǎn)基因植株的獲得，也需要從大量性狀分離的T1 代轉(zhuǎn)基因植株中篩選。因此，高效的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因育種至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)的方法為Southern 雜交，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但其對(duì)樣品DNA 的質(zhì)量和含量要求較高，且成本高，周期長(zhǎng)，難以滿足高通量外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)的需求。因此，亟需建立簡(jiǎn)單、快速、高效的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)的方法。本研究以已知外源基因?yàn)閱慰截愓系霓D(zhuǎn)CP基因番木瓜為參照，篩選出番木瓜基因組中的單拷貝基因；進(jìn)一步以其為內(nèi)參基因，建立基于絕對(duì)定量的數(shù)字PCR 技術(shù)（digital PCR， dPCR）和熒光定量PCR技術(shù)（fluorescence quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因拷貝數(shù)的方法，為轉(zhuǎn)基因番木瓜育種提供新的高通量拷貝數(shù)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料轉(zhuǎn)基因番木瓜株系來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，包含：21 株轉(zhuǎn)入海南PRSV 的CP 基因的T1 代番木瓜、55 株轉(zhuǎn)入海南PRSV 的輔助成分-蛋白酶基因（HC-Pro）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0 代番木瓜苗和28 株轉(zhuǎn)入海南PRSV 的復(fù)制酶基因（Nib）發(fā)夾結(jié)構(gòu)的T0 代番木瓜苗。

1.1.2 試劑 廣譜植物基因組DNA 快速提取試劑盒（CZ301-01）購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司； QuantStudio? 3D 數(shù)字PCR 預(yù)混液v2、QuantStudio 3D 數(shù)字PCR 20K 芯片v2 、QuantStudio 3D 數(shù)字PCR 芯片罩蓋v2 、QuantStudio 3D 數(shù)字PCR 上樣刀片、注射器裝浸液、浸液吸頭等均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；2X Q3 SYBR qPCR Master mix 購(gòu)自吐露港生物科技有限公司，PCR 平蓋八排管購(gòu)自Labselect 公司。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 番木瓜單拷貝內(nèi)參基因的篩選及鑒定（1）番木瓜單拷貝基因的篩選及dPCR 引物與探針設(shè)計(jì)。在phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search）網(wǎng)站的番木瓜基因組中，挑選出可能為單拷貝的2 個(gè)基因Cpa03g018830 和Cpa03g018770 作為候選內(nèi)參基因，下載這2 個(gè)基因的DNA 序列。使用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（F/R）與探針（P），Cpa03g018830 和Cpa03g018770 的探針5端連接VIC 熒光基團(tuán)，3′端連接MGB 熒光猝滅基團(tuán)，該基團(tuán)散發(fā)紅色熒光。轉(zhuǎn)基因番木瓜外源基因CP 和NPTⅡ（neomycin phosphotransferase）的探針5′端連接FAM 熒光基團(tuán)，3′端連接BHQ1 熒光猝滅基團(tuán)，該基團(tuán)散發(fā)綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)使用的所有引物及探針序列見(jiàn)表1。

（2）轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜的T₁代陽(yáng)性植株的篩選。以T₀代經(jīng)過(guò)Southern 雜交驗(yàn)證為單拷貝的轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜的T₁代陽(yáng)性植株幼苗作為內(nèi)參基因拷貝數(shù)鑒定的參照，首先通過(guò)PCR 篩選出轉(zhuǎn)CP 番木瓜的T1 代陽(yáng)性植株。采集21 株轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜的T1 代幼苗的葉片，提取其基因組DNA，通過(guò)常規(guī)PCR 篩選陽(yáng)性幼苗。反應(yīng)體系為：Green Master Mix 12.5 μL，CP-F1（10 μmol/L）1 μL，CP-R1（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板1 μL，Nuclease-free water 9.5 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

（3）dPCR 鑒定候選內(nèi)參基因的拷貝數(shù)。從上述轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜的T₁代陽(yáng)性植株中隨機(jī)選取8 株，編號(hào)為CP1～CP8。使用QuantStudio^TM3DAnalysisSuiteTM 數(shù)字PCR 儀，通過(guò)dPCR 檢測(cè)候選內(nèi)參基因Cpa03g018830 在番木瓜基因組中的拷貝數(shù)。反應(yīng)體系為：2×dPCR Master Mix 7.3 μL，CP 基因、Cpa03g018830 基因的正向引物和反向引物（10 μmol/L）各1.3 μL，探針（10 μmol/L） 0.36μL，DNA 模板（10 ng/μL）1 μL，Nuclease-free water0.28 μL，總體積14.50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?6 ℃變性10 min；60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 2 min。反應(yīng)結(jié)束后，將芯片放入dPCR 讀取儀中讀取FAM 和VIC 熒光信號(hào)，并使用對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，得到檢測(cè)樣品DNA 中CP 基因和Cpa03g018830 基因的拷貝數(shù)（ copy/μL ）， 計(jì)算樣品中CP 基因與Cpa03g018830 基因的拷貝數(shù)比值，通過(guò)比值判斷Cpa03g018830 基因在番木瓜基因組中的拷貝數(shù)。

選取已確認(rèn)為單拷貝雜合的植株CP7 作為Cpa03g018770 基因在番木瓜基因組中拷貝數(shù)鑒定的參照，通過(guò)數(shù)字PCR 檢測(cè)Cpa03g018770 基因在番木瓜基因組中的拷貝數(shù)； 同時(shí)以Cpa03g018830 基因?yàn)閱慰截悓?duì)照來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證Cpa03g018770 基因的拷貝數(shù)。Cpa03g018770 基因和Cpa03g018830 基因的dPCR 實(shí)驗(yàn)各設(shè)3 個(gè)重復(fù)。1.2.2 dPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜T0 代的外源基因拷貝數(shù) 以轉(zhuǎn)番木瓜PRSV 病毒HC-Pro 基因的T₀代陽(yáng)性番木瓜苗為待測(cè)樣品， 編號(hào)為HC-Pro-1～HC-Pro-11，采集11 株幼苗的葉片，提取其基因組DNA。以Cpa03g018770 基因和Cpa03g018830 基因?yàn)閮?nèi)參基因，以番木瓜轉(zhuǎn)基因常用的篩選基因NPTⅡ 為外源目的基因，通過(guò)dPCR 檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)HC-Pro 基因番木瓜基因組中的拷貝數(shù)。其中，以Cpa03g018770 基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)6 株轉(zhuǎn)HC-Pro 基因番木瓜苗（HC-Pro-1～HC-Pro-6）；以Cpa03g018830 基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)全部11 株轉(zhuǎn)HC-Pro 基因番木瓜苗。數(shù)字PCR 儀反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1.2.1。反應(yīng)結(jié)束后，將芯片放入dPCR 讀取儀中讀取FAM 和VIC 熒光信號(hào)，并使用對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，得到檢測(cè)樣品DNA 中NPTⅡ基因、Cpa03g018830 基因、Cpa03g018770 基因的拷貝數(shù)（ copy/μL ）， 計(jì)算樣品中NPTⅡ 基因與Cpa03g018830 基因、Cpa03g018770 基因的拷貝數(shù)比值，通過(guò)比值判斷NPTⅡ基因在番木瓜基因組中的拷貝數(shù)。

1.2.3 熒光定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜T₀代植株的外源基因拷貝數(shù) （1）引物驗(yàn)證。熒光定量PCR 引物同數(shù)字PCR 引物一樣，且不需要探針。以2 份已知拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因番木瓜的基因組DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證內(nèi)參Cpa03g018830、Cpa03g018770 基因和外源基因NPTⅡ的引物有效性。反應(yīng)在LighterCycler? 96熒光分析儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系為：2X Q3 SYBRqPCR Master Mix（Universal）10 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，Template DNA（50 ng/μL）1 μL，ddH2O 8.2 μL，總體積為20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)擴(kuò)增曲線及溶解曲線判定引物是否有效。

（2）qPCR 檢測(cè)待測(cè)樣品的外源基因拷貝數(shù)。以轉(zhuǎn)HC-Pro 基因的T0 代陽(yáng)性番木瓜苗為待測(cè)樣品，編號(hào)為HC-Pro-12～HC-Pro-55。以轉(zhuǎn)Nib 基因的T0 代陽(yáng)性番木瓜苗為待測(cè)樣品，編號(hào)為Nib-1～Nib-28。分別采集番木瓜幼苗的葉片，提取其基因組DNA 。此外， HC-Pro-1～HC-Pro-11 和CP1～CP8 也作為待測(cè)樣品通過(guò)qPCR 再次驗(yàn)證其拷貝數(shù)，待測(cè)樣品共91 份。以Cpa03g018770 基因和Cpa03g018830 基因?yàn)閮?nèi)參基因，以NPTⅡ基因?yàn)橥庠茨康幕?，以單拷貝純合的轉(zhuǎn)基因番木瓜株系作為對(duì)照，通過(guò)qPCR 檢測(cè)所有待測(cè)樣品的外源基因在轉(zhuǎn)基因番木瓜基因組中的拷貝數(shù)。qPCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同引物驗(yàn)證，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后，使用LightCycler^?96SW 1.1 系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用2^?ΔΔC_T法分析轉(zhuǎn)基因植株中NPTII 基因的相對(duì)拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜單拷貝內(nèi)參基因的篩選及鑒定

2.1.1 CP 基因陽(yáng)性植株的PCR 鑒定 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，若出現(xiàn)500 bp 左右的目的條帶則為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，可能為CP 基因純合或CP 基因雜合，若無(wú)目的條帶則為非轉(zhuǎn)基因植株。21 株T1 代幼苗的PCR 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，其中，有17株為CP 基因陽(yáng)性植株，這17 株番木瓜植株可作為內(nèi)參基因拷貝數(shù)鑒定的參照。

2.1.2 dPCR 鑒定候選內(nèi)參基因的拷貝數(shù) 由于番木瓜屬于二倍體植物，轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜單拷貝株系的T1 代陽(yáng)性植株的CP 基因與Cpa03g018830基因的拷貝數(shù)比值為1 或0.5 時(shí)，Cpa03g018830基因?yàn)閱慰截惢?。且根?jù)CP 基因與目的基因的拷貝數(shù)比值，可得出轉(zhuǎn)CP 基因番木瓜的T1 代陽(yáng)性植株為純合或雜合，拷貝數(shù)比值為1 時(shí)為單拷貝純合CP 植株，拷貝數(shù)比值為0.5 時(shí)為單拷貝雜合CP 植株。8 個(gè)樣品的數(shù)字PCR 散點(diǎn)圖見(jiàn)圖2，其中，藍(lán)色散點(diǎn)為CP 基因熒光孔數(shù)；紅色散點(diǎn)為Cpa03g018830 基因熒光孔數(shù)；綠色散點(diǎn)為CP 基因和Cpa03g018830 基因熒光孔數(shù)，黃色散點(diǎn)為無(wú)信號(hào)孔數(shù)。dPCR 實(shí)驗(yàn)的拷貝數(shù)結(jié)果（表2）顯示，7 個(gè)樣品的CP 基因與Cpa03g018830 基因的拷貝數(shù)比值接近為1 或0.5，CP8 樣本的拷貝數(shù)比值為0.12， 結(jié)果異常， 將其排除。因此，Cpa03g018830 基因在番木瓜基因組中為單拷貝基因。且CP3 與CP4 樣品為單拷貝純合植株，CP1、CP2、CP5、CP6、CP7 樣品為單拷貝雜合植株。

由于CP7 為單拷貝雜合植株，其CP 基因與目的基因的拷貝數(shù)比值為0.5 時(shí)，則目的基因?yàn)閱慰截惢?。CP7 的dPCR 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（表3）顯示，CP 基因與Cpa03g018770 基因和Cpa03g018830 基因的拷貝數(shù)比值均接近0.5。因此，Cpa03g018770基因和Cpa03g018830 基因在番木瓜基因組中均為單拷貝基因，可作為內(nèi)參基因應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)。

2.2 dPCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜T0代植株的外源基因拷貝數(shù)

番木瓜是二倍體植物，因此單拷貝整合的外源基因片段與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為0.5，雙拷貝整合的外源基因片段與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1，三拷貝整合的外源基因片段與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1.5，四拷貝、五拷貝等多拷貝外源基因片段整合拷貝數(shù)以此類推。

以Cpa03g018770 基因?yàn)閮?nèi)參基因，以NPTⅡ基因?yàn)橥庠茨康幕颍?1 株轉(zhuǎn)HC-Pro 基因的T₀代陽(yáng)性番木瓜苗的dPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，HC-Pro-1 、HC-Pro-2 、HC-Pro-3 、HC-Pro-4 、HC-Pro-5 檢測(cè)為單拷貝，HC-Pro-6 檢測(cè)為五拷貝（表4）。以Cpa03g018830 基因?yàn)閮?nèi)參基因的數(shù)字PCR 結(jié)果表明，HC-Pro-1、HC-Pro-2、HC-Pro-3、HC-Pro-4、HC-Pro-5 檢測(cè)為單拷貝，HC-Pro-6 檢測(cè)為五拷貝，HC-Pro-7、HC-Pro-8 和HC-Pro-10檢測(cè)為四拷貝，HC-Pro-9 和HC-Pro-11 檢測(cè)為六拷貝。其中，HC-Pro-1～HC-Pro-6 經(jīng)2 個(gè)內(nèi)參基因檢測(cè)的結(jié)果一致（表5）。

2.3 qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜T0代植株的外源基因拷貝數(shù)

2.3.1 qPCR 引物的驗(yàn)證 3 對(duì)引物的擴(kuò)增曲線及融解曲線表明，3 對(duì)引物均有明顯的擴(kuò)增曲線，且融解曲線均具有唯一的吸收峰，可作為qPCR檢測(cè)引物（圖3）。

2.3.2 qPCR 檢測(cè)待測(cè)樣品的外源基因拷貝數(shù)采用2^?ΔΔC_T法分析轉(zhuǎn)基因植株中NPTII 基因的相對(duì)拷貝數(shù)，定義已知單拷貝純合轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照為參照因子，即為1，各樣本相對(duì)于參照因子拷貝數(shù)的倍數(shù)為2^?ΔΔC_T。由于T₀ 代植株的插入為雜合型，因此單拷貝植株的相對(duì)定量值（RQ）應(yīng)為純合單拷貝參照的1/2，相對(duì)表達(dá)量約為0.5；而雙拷貝植株的RQ 值與純合單拷貝對(duì)照相等，相對(duì)表達(dá)量約為1；三拷貝植株的相對(duì)定量值RQ應(yīng)該為純合單拷貝對(duì)照的3/2，相對(duì)表達(dá)量約為1.5；多拷貝外源基因整合拷貝數(shù)以此類推。樣品HC-Pro-12～HC-Pro-55 的qPCR 檢測(cè)拷貝數(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖4，其中，有25 個(gè)是單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，有1 個(gè)是雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株，有2 個(gè)是三拷貝轉(zhuǎn)基因植株，其余均為三拷貝以上轉(zhuǎn)基因植株。樣品Nib-1～Nib-28 的qPCR 檢測(cè)拷貝數(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖5，有5 個(gè)是單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，有2 個(gè)是雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株，有6 個(gè)是三拷貝轉(zhuǎn)基因植株，其余均為三拷貝以上轉(zhuǎn)基因植株。樣品CP1～CP8 和HC-Pro-1～HC-Pro-11 的qPCR 檢測(cè)拷貝數(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖6，CP1、CP2、CP5、CP6 和CP7 樣品為單拷貝雜合植株，CP3、CP4 和CP8 樣品為單拷貝純合植株，除CP8 號(hào)的dPCR 結(jié)果異常，其余均與dPCR 檢測(cè)的拷貝數(shù)結(jié)果一致。HC-Pro-1、HC-Pro-2、HC-Pro-3、HC-Pro-4 和HC-Pro-5 均為單拷貝轉(zhuǎn)基因植株， HC-Pro-7 、HC-Pro-8 和HC-Pro-10 為四拷貝轉(zhuǎn)基因植株，HC-Pro-6 為五拷貝轉(zhuǎn)基因植株，以上植株的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果與dPCR 的檢測(cè)結(jié)果一致；HC-Pro-9 和HC-Pro-11經(jīng)qPCR 檢測(cè)為十五拷貝和五拷貝，然而dPCR的檢測(cè)結(jié)果均為六拷貝，結(jié)果不一致，這可能是因?yàn)闊晒舛繉?duì)外源基因單低拷貝整合的檢測(cè)靈敏度較高，而對(duì)多拷貝整合的檢測(cè)靈敏度低的緣故。

3 討論

在轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)中，外源基因的拷貝數(shù)檢測(cè)是不可缺少的一環(huán)，因此獲得一種簡(jiǎn)便、高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法至關(guān)重要。傳統(tǒng)的Southern雜交的結(jié)果準(zhǔn)確可信，但其成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，一次檢測(cè)樣品少，操作要求高。qPCR 也常用于轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，可分為熒光染料法和探針?lè)?，探針?lè)ㄏ啾扔谌玖戏ǎ芨_地對(duì)低拷貝的目的DNA 片段進(jìn)行定量分析，但探針價(jià)格較昂貴，成本高。染料法雖然相較于探針?lè)ň珳?zhǔn)度稍有降低，但在檢測(cè)外源基因的單低拷貝整合時(shí)的準(zhǔn)確性也足以滿足育種工作需求，且其成本較低，更適宜高通量檢測(cè)。目前，qPCR 測(cè)定外源基因拷貝數(shù)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻[10-11]和棉花[12]等作物的拷貝數(shù)檢測(cè)。dPCR 技術(shù)是在qPCR 技術(shù)基礎(chǔ)上的一次技術(shù)革新，其分析結(jié)果可直接得出DNA 分子的個(gè)數(shù)，對(duì)起始樣品進(jìn)行絕對(duì)定量。相比qPCR，dPCR 無(wú)需任何校準(zhǔn)物，具有更高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。dPCR 在基因表達(dá)研究[13]、miRNA 研究[14-16]、基因組拷貝數(shù)鑒定[17-18]等方面具有廣闊前景。HINDSON 等[19]研究表明，dPCR 能夠簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確地測(cè)定水稻、柑橘、馬鈴薯、玉米、番茄和小麥中的外源基因拷貝數(shù)。NARANCIO 等[20]比較了qPCR 和dPCR 方法在白三葉中外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)中的優(yōu)劣，結(jié)果表明，dPCR 在白三葉中的拷貝數(shù)檢測(cè)上具有更高的準(zhǔn)確性。

要建立qPCR 和dPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)的方法，需要拷貝數(shù)明確的單拷貝基因作為內(nèi)參基因。XUE 等[21]通過(guò)對(duì)甘蔗多個(gè)基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，APRT 基因最適合作為甘蔗DNA含量定量的內(nèi)源參考基因，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因甘蔗中外源基因拷貝數(shù)的鑒定。本研究篩選出了2 個(gè)番木瓜單拷貝基因Cpa03g018830 與Cpa03g018770，驗(yàn)證了其作為內(nèi)參基因準(zhǔn)確可用，且可將2 個(gè)內(nèi)參基因同時(shí)使用，若2 個(gè)內(nèi)參結(jié)果相一致，則結(jié)果更準(zhǔn)確，因此，這2 個(gè)基因可作為內(nèi)參基因應(yīng)用于qPCR 或dPCR 鑒定轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因拷貝數(shù)的研究。

本研究中，利用dPCR 與qPCR 方法分別測(cè)定了轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因的拷貝數(shù)，HC-Pro-9 和HC-Pro-11 經(jīng)qPCR 檢測(cè)為十五拷貝和五拷貝，然而dPCR 的檢測(cè)結(jié)果均為六拷貝，可能是因?yàn)閝PCR 對(duì)外源基因單的低拷貝整合的檢測(cè)靈敏度較高，而對(duì)外源基因多拷貝整合的檢測(cè)靈敏度低較低。相比較來(lái)說(shuō)，數(shù)字PCR 不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，并不受PCR 擴(kuò)增效率影響，具有更高的靈敏度和檢測(cè)準(zhǔn)確度， 基于陣列式的QuantStudio 3D dPCR 系統(tǒng)等商業(yè)平臺(tái)也已成為臨床應(yīng)用的關(guān)鍵設(shè)備，dPCR 的結(jié)果對(duì)外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)更準(zhǔn)確。qPCR 成本較低，簡(jiǎn)單快速，適合用來(lái)在大量轉(zhuǎn)基因植株中初篩出單低拷貝整合的植株，經(jīng)qPCR 初步篩選到的單低拷貝整合的株系可進(jìn)一步用Southern 雜交進(jìn)行驗(yàn)證，不僅進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與權(quán)威性，還節(jié)省成本。本研究建立的利用dPCR 和qPCR 技術(shù)高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜中外源基因拷貝數(shù)的方法，可為番木瓜轉(zhuǎn)基因抗病育種中單低拷貝株系的選育提供新的方法。