劉亞利 李媛 田廣原 高笑宇 云春梅

雙調蛋白最早于1988年被Shoyab等在人乳腺細胞MCF-7上清液中發(fā)現(xiàn)、分離并鑒定[1]。雙調蛋白既是2型細胞因子,也是表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)家族的成員之一。因其既能夠抑制某些癌細胞系的增殖,同時又能夠誘導正常細胞(如成纖維細胞和角質細胞)的增殖,所以命名為“雙調蛋白”[2]。在與表皮生長因子受體結合之后,雙調蛋白激活控制細胞內代謝、增殖、細胞周期的信號轉導通路,啟動級聯(lián)反應,參與器官發(fā)育、組織再生和傷口愈合相關的生物過程[3]。支氣管哮喘是一種以肺部炎癥、氣道高反應性(airway hyperreactivity, AHR)、粘液分泌過多和氣道重塑為特征的慢性氣道疾病[4]。研究表明,AREG與慢性氣道疾病相關,血液和唾液中的AREG可作為哮喘的生物標志物,且在哮喘急性發(fā)作期間,AREG的表達水平較哮喘穩(wěn)定期明顯升高[5]。因此研究哮喘與AREG的關系對于疾病的診治至關重要。

一、雙調蛋白概述

1. 雙調蛋白的表達與釋放

AREG在多種組織器官(氣道、肺組織、結直腸、皮膚等)及細胞(肥大細胞、嗜堿性粒細胞、Ⅱ型固有淋巴細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞)中均有表達[6]。AREG 在人體發(fā)育過程和體內平衡狀態(tài)下具有組成性表達的特性,在組織損傷的修復及重塑、調控炎癥、維持體內穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[7]。

AREG位于4號染色體q13-q21區(qū)域,包含DNA跨度約為10kb的拷貝基因AREG和AREGB[8]。AREG轉錄為由六個外顯子組成的mRNA,編碼252個氨基酸的跨膜雙調蛋白前體(Pro-AREG)[2]。雙調蛋白前體包含許多切割位點,一個疏水信號肽、一個具有糖基化位點的N末端親水前區(qū)、一個含有另一糖基化部位和核定位信號的肝素結合(HB)結構域,以及EGF樣結構域。這些位點的存在會導致不同類型的成熟雙調蛋白,影響其在不同細胞類型中的生物活性。在腫瘤壞死因子轉換酶( Tumor necrosis factor converting enzyme, TACE )的介導下,雙調蛋白前體在結構外區(qū)域經過連續(xù)的蛋白水解,最終作為可溶性的AREG釋放[9]。當可溶性AREG被釋放到微環(huán)境中,AREG可能停留在細胞外基質中或到達血液從而發(fā)揮作用。明確AREG蛋白結構以及釋放途徑,對于了解AREG蛋白的生物學功能及作用至關重要。

2. 雙調蛋白的生理功能及作用

AREG作為表皮生長因子家族成員之一,具有結合EGFR的能力。表皮生長因子受體是一種跨膜糖蛋白,是構成酪氨酸激酶受體ErbB家族的四個成員之一[10]。AREG可通過自分泌、旁分泌、細胞內核易位和被包含在外泌體中等方式進行分泌,隨后與EGFR結合,啟動信號傳導[11]。同時AREG也可以與ErbB家族的其他受體ErbB2、ErbB3和ErbB4促進EGFR同聚或異聚,觸發(fā)細胞內信號的產生,這些信號級聯(lián)反應調節(jié)基因表達并引發(fā)多種細胞反應,如增殖、存活、侵襲、運動和血管生成等。雖然研究表明,與其他EGFR配體相比,AREG 在誘導EGFR對其他ErbB受體進行酪氨酸磷酸化反應的效率較低,但其生物活性與高濃度下的其他配體相似,這可能與對受體的親和力以及AREG所行使的獨特生理功能有關。

研究表明AREG不僅可以誘導有絲分裂信號,還可以誘導細胞分化,在協(xié)調組織穩(wěn)態(tài)、組織修復、纖維化和抑制局部炎癥方面發(fā)揮重要作用[6]。同時AREG還廣泛的參與骨骼發(fā)育、神經再生、囊胚植入、角質形成、細胞增殖和纖維化等生理過程[12]。研究發(fā)現(xiàn),正常骨骼發(fā)育也會受到AREG表達的影響,AREG的表達會由成骨細胞和骨組織的甲狀旁腺激素和其他促骨激素觸發(fā)。AREG還可參與乳腺發(fā)育,尤其是青春期乳腺導管的發(fā)育。同時,AREG已被證實在腫瘤的生物學中發(fā)揮重要作用。研究表明,AREG可以上調乳腺癌細胞中多種蛋白酶的表達,從而在乳腺癌侵襲和轉移中發(fā)揮作用。AREG在肝癌組織和細胞中均有表達,并作為肝癌細胞的促有絲分裂和抗凋亡生長因子參與一系列的病理過程[13]。與人類胎兒成骨細胞系相比,人類骨肉瘤細胞系中AREG水平升高,外源性人類AREG治療以劑量依賴性模式增加了兩種人骨肉瘤細胞株的遷移,同時增加了傷口愈合活性和細胞運動性[14]。AREG在腫瘤學中的生物應用為腫瘤的靶向治療提供了新的治療方向。

此外,AREG在機體免疫以及炎癥反應過程中扮演著重要的角色,當哺乳動物的皮膚、肺臟和腸道的屏障表面不斷暴露于環(huán)境刺激,可能導致炎癥和組織損傷。研究發(fā)現(xiàn),在小鼠腸道損傷和炎癥模型中,腸道的炎癥標志物雙調蛋白表達量增加,同時雙調蛋白的受體,即表皮生長因子受體表達量也會增加[15]。T淋巴細胞是細胞免疫中的主要效應細胞,在免疫應答中產生細胞因子以介導炎癥并調節(jié)其他類型的免疫細胞。感染鼠鞭蟲的C57小鼠體內的Th2細胞亞群會分泌AREG,與T細胞受體結合發(fā)揮清除線蟲的作用。類風濕性關節(jié)炎是一種慢性炎癥性疾病,其主要特征是滑膜增生以及受影響關節(jié)的進行性破壞。AREG在類風濕性關節(jié)炎患者中的表達增加與促炎因子以及血管生成因子的產生有關[16]?？傊?AREG在多種炎癥疾病中發(fā)揮重要作用。

二、雙調蛋白與哮喘

哮喘是一個嚴重的全球性健康問題,影響全球約3.5億患者,在我國哮喘是常見病、多發(fā)病,已經成為主要的、亟需認真面對和解決的公共衛(wèi)生與醫(yī)療保健問題之一[17]。作為一種多因素疾病,哮喘以遺傳易感性和環(huán)境觸發(fā)因素為特征,發(fā)作時伴有可逆性氣道氣流阻塞、非特異性氣道高反應性和慢性氣道炎癥[18]。研究證明我國哮喘患者人數(shù)逐步上升,但因哮喘是復雜的基因與環(huán)境相互作用的結果,其臨床表現(xiàn)、氣道炎癥、氣道重塑的強度及類型具有高度異質性[19],導致哮喘的診斷率低,控制率低,治愈率低。所以深入了解哮喘的發(fā)病機制是一項重要的問題。

1. 哮喘的發(fā)病機制

哮喘是典型的環(huán)境和機體交互影響的疾病,其發(fā)病機制涉及適應性免疫和固有性免疫。適應性免疫應答分為兩個階段,在特定變應原刺激下機體會誘導Th2細胞合成和釋放白細胞介素4(Interleukin-4, IL-4)、白細胞介素5(Interleukin-5,IL-5)和白細胞介素13(Interleukin-13, IL-13),促進IgE的產生進而導致氣道炎癥[20,21]。當過敏原再次進入機體,與IgE形成復合體迅速活化嗜堿性粒細胞和肥大細胞,使其釋放多種炎癥介質,包括細胞因子、趨化因子、組胺、5-羥色胺和蛋白酶,導致平滑肌收縮、血管通透性增強和炎性細胞的募集形成急性哮喘反應[22]。近年發(fā)現(xiàn)固有免疫應答也參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展。Ⅱ型固有淋巴細胞(Innate lymphoid type-2 cells, ILC2)是起源于骨髓中的共同天然淋巴祖細胞,經由淋巴樣祖細胞、早期淋巴樣前體細胞、先天淋巴前體細胞等發(fā)育階段分化而來的細胞群[23]。ILC2在肺穩(wěn)態(tài)、損傷后肺結構的修復及重塑、過敏性炎癥的引發(fā)以及免疫反應過程中發(fā)揮著關鍵作用[24-26]。研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者血液和痰液中ILC2含量增加,尤其在嗜酸性粒細胞型哮喘中[27]。在過敏原或微生物的刺激下,支氣管上皮細胞(Bronchial epithelial cell, BEC)釋放IL-33、IL-25和胸腺基質淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP),誘導支氣管粘膜中的ILC2活化并釋放IL-5、IL-13,促進嗜酸性粒細胞分化成熟并向肺部募集參與哮喘的炎癥過程。同時ILC2還會通過分泌AREG來介導氣道的修復從而發(fā)揮保護作用[28]。下面將重點綜述AREG在哮喘中的研究進展。

2. 雙調蛋白與哮喘中的炎癥反應

白介素33(Interleukin-33, IL-33)是白介素1(IL-1)家族的一員,在屏障組織的內皮細胞和上皮細胞的細胞核中表達,它通過激活表達其ST2受體的各種靶細胞,如肥大細胞和ILC2,在2型先天免疫反應和過敏性炎癥的啟動和擴增中發(fā)揮核心作用[29]。在遺傳學研究中,IL-33基因已被鑒定為哮喘的易感基因。遺傳學研究表明,一個等位基因的突變會導致IL-33功能的喪失,從而減少血液中嗜酸性粒細胞的數(shù)量,并預防哮喘的發(fā)生[30]。研究表明IL-33可以通過誘導ILC2分泌AREG參與組織的修復和穩(wěn)態(tài)[28]。ILC2既是AREG的先天來源,也是M2巨噬細胞分化的重要因素。M2巨噬細胞通過表達精氨酸酶和上皮有絲分裂原IGF-1來限制急性炎癥、促進組織修復從而減輕蠕蟲感染期間的急性肺損傷。IGF-1單獨并不誘導上皮細胞增殖,但在EGF家族成員存在的情況下可以增強EGFR信號傳導和增殖反應[31]。因此上皮細胞的有效有絲分裂刺激可能是由AREG和IGF-1的協(xié)調表達誘導的。而AREG誘導上皮細胞增殖和分化的能力可以在2型反應的情況下促進蠕蟲的排出,并增強感染或損傷后的傷口愈合和組織修復從而抑制炎癥損傷。

多種蛋白酶介導的蛋白酶水解也參與了哮喘發(fā)病過程,各種免疫細胞在過敏原刺激下釋放內源性蛋白酶并參與炎癥介質的產生、氣道炎癥細胞的浸潤及氣道高反應性[32]。人氣道類胰蛋白酶(Human airway trypsin-like protease , HAT)是一種存在于慢性氣道疾病患者痰液中的絲氨酸蛋白酶,是蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptor 2, PAR-2)的激動劑[33]。研究表明,HAT通過PAR-2介導的ERK信號途徑誘導AREG的產生,然后通過TACE依賴性機制促進雙調蛋白的釋放[34]。在氣道上皮細胞系NCI-H292中,HAT通過AREG-EGFR 途徑引起粘蛋白MUC5AC基因的表達,該基因表達的增加以及隨后粘蛋白產生的增加可能導致粘液高分泌引起氣道阻塞[35]。同時研究表明EGFR激活可降低claudin1基因的表達,增加MUC5AC的表達,同時造成更嚴重的氣道炎癥,以及氣道高反應性增加[36]。綜上所述,AREG廣泛的參與哮喘過程中的氣道粘液增加以及炎癥發(fā)生。

3. 雙調蛋白與哮喘中的氣道重塑

氣道重塑是指可能影響氣道功能特性的氣道結構變化。這些結構變化包括氣道平滑肌質量增加、粘液腺肥大、細胞外基質成分沉積、網狀基底膜增厚和血管生成。隨著病情的進展,哮喘患者的肺功能會加速喪失,一些患者會發(fā)展為進行性固定氣流阻塞。氣道重塑通常發(fā)生于哮喘的早期階段,伴隨著炎癥狀態(tài)。Yukinori Enomoto等研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者在急性發(fā)作后痰中EGF和AREG濃度暫時升高。哮喘支氣管上皮中表皮生長因子受體(EGFR,也稱為ErbB1)酪氨酸激酶的表達與疾病嚴重程度相關[37]。在哮喘患者的肥大細胞中也可觀察到AREG表達上調,但在正常對照組中未觀察到。當氣道受到過敏原刺激時,肥大細胞通過脫顆粒的方法釋放組胺,增加血管通透性、粘液分泌和氣道平滑肌收縮而導致過敏反應。同時組胺通過刺激AREG的釋放誘導氣道平滑肌細胞和上皮細胞的增殖和遷移參與氣道重塑[38]。因此干預肥大細胞釋放組胺與AREG的過程可能成為治療氣道重塑的新方法。

研究表明AREG有助于過敏性疾病有關的細胞因子GM-CSF的釋放,塵螨激活氣道上皮細胞中的p38-MAPK信號傳導途徑誘導TACE和金屬蛋白酶家族的另一成員裂解相鄰細胞或其自身細胞表面上的AREG,從而驅動GM-CSF的產生[39]。GM-CSF通過活化巨噬細胞產生先天性免疫介質對氣道直接作用而促成哮喘。GM-CSF還可以招募α-平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細胞,這可能有助于氣道平滑肌增厚和氣道高反應性,但GM-CSF是否直接刺激氣道平滑肌細胞增殖或增生和AHR尚不清楚。肺纖維化是嚴重哮喘的常見病理學特征,其導致成纖維細胞增殖、細胞外間質沉積(例如纖連蛋白(FN)和膠原) ,以及肺泡上皮-間質轉化[40]。AREG可誘導成纖維細胞增殖和纖維化基因(如膠原蛋白1-α1、α-SMA和FN)的表達?？偠灾?AREG通過影響各種細胞因子的表達廣泛的參與氣道重塑過程,進一步研究AREG與氣道重塑的關系有利于為哮喘的治療提供新思路。

三、展望

雙調蛋白在組織中發(fā)揮修復作用,調節(jié)修復機制對于避免組織損傷發(fā)揮重要作用。更深入的了解AREG基因表達與調控,以及與其他因子相互作用對于疾病的發(fā)生、發(fā)展、調控均具有重要作用。在目前的研究中AREG可以通過調節(jié)免疫反應參與多種疾病進程,例如研究發(fā)現(xiàn)AREG的表達上調會限制腸道的炎癥以及促進組織的修復使其可能作為克羅恩病的纖維化治療的新靶點[41]。同時AREG 還可以通過廣泛下調致病性 T 細胞免疫而成為狼瘡性腎炎的抗炎介質,進一步強調了 AREG/EGFR 軸作為潛在治療靶點的重要意義[42]。雖然AREG已被證明既能在急性炎癥反應中發(fā)揮抑炎作用,又能在慢性炎癥中通過下調適應性T細胞免疫發(fā)揮強大的免疫對抗作用。但AREG 在哮喘中的相關研究較少,其具體抑炎或組織修復機制尚不明確。因此,在未來的研究中,我們將進一步集中AREG 在哮喘中的機制研究,探索AREG作為一種生物標志物在識別對靶向治療有潛在反應的患者以及作為預后標志物的價值。