基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（322RC766）；湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022A01050）；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630102023007）；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院公益項(xiàng)目（1630052019012）。

作者簡(jiǎn)介：張秀霞（1982-），女，助理研究員，研究方向：海洋生物資源調(diào)查與評(píng)估， 水產(chǎn)健康養(yǎng)殖。E-mail： zhangxiuxia@itbb.org.cn。

通訊作者：鄧曉東（1969-），男，研究員，研究方向：藻類生理生化。E-mail： dengxiaodong@itbb.org.cn。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.003

摘" 要：為篩選適應(yīng)熱帶海水養(yǎng)殖環(huán)境并能高效凈化養(yǎng)殖廢水的優(yōu)勢(shì)藻種，分析比較五種微藻去除化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、總磷（TP）和亞硝酸鹽氮（NO-2-N）的能力。選擇海南本土篩選的藻種小球藻（Chlorella sp.）、微擬球藻（Nannochloropsis sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）、牟氏角毛藻（Chaetoceros sp.）和外購(gòu)藻種四尾柵藻（Scenedesmus sp.），在以對(duì)蝦養(yǎng)殖水為底液配制的富營(yíng)養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)6 d。結(jié)果表明，綠藻在養(yǎng)殖廢水中生長(zhǎng)速率快，硅藻生長(zhǎng)速率慢，小球藻在富營(yíng)養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中生長(zhǎng)最好，OD680值、葉綠素a含量和細(xì)胞密度均最高，并與其他藻種有顯著性差異。5種藻種中COD去除效果好的藻種是菱形藻和小球藻，去除率分別為71.6%、70.4%；總氮去除效果好的藻種是菱形藻、小球藻、牟氏角毛藻和微擬球藻，去除率分別為50.36%、47.96%、46.41%、42.79%；總磷去除效果好的藻種是菱形藻，去除率為71.43%；亞硝酸鹽氮去除效果好的藻種是菱形藻、四尾柵藻和牟氏角毛藻，2 d去除率分別為96.60%、95.63%和95.40%；綜合所有指標(biāo)，菱形藻對(duì)養(yǎng)殖廢水綜合凈化效果最好。

關(guān)鍵詞：微藻；養(yǎng)殖廢水；凈化；總氮；總磷

為了滿足市場(chǎng)需求，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來越向高密度、規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，在這種養(yǎng)殖模式下，形成了高投入量和高生物負(fù)載量的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖密度遠(yuǎn)大于水體環(huán)境可承載容量。水產(chǎn)動(dòng)物攝食后的殘餌、排泄的糞便以及養(yǎng)殖過程中施用的各類藥物殘留在水體中并逐漸富集，引起養(yǎng)殖水體化學(xué)需氧量（COD）、總氮（TN）、總磷（TP）等污染水平嚴(yán)重超標(biāo)，最終使得養(yǎng)殖水體進(jìn)入富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)。微藻亦稱浮游植物，能夠以光照為能源，利用水中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行光合作用，合成自身生長(zhǎng)所需有機(jī)物質(zhì)，進(jìn)而降低水中的氮、磷和COD。

微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用主要集中在幾個(gè)方面：作為生物餌料、作為飼料添加劑、養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控、水產(chǎn)動(dòng)物病害防控及新型水產(chǎn)疫苗研發(fā)。利用微藻處理污水之前已有大量報(bào)道，王昱等利用小球藻來凈化村鎮(zhèn)的生活污水，對(duì)污水中TP的去除率達(dá)92.22%，污水滅菌后小球藻對(duì)COD和NH+4-N去除率分別達(dá)93.41%和86.21%。李興涵等也探索了幾種微藻處理天然橡膠加工廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)廢水中TN、TP、COD濃度越高，微藻對(duì)其去除效果越好。大量的研究表明微藻應(yīng)用于污水處理，能有效降低COD、TN、TP。綠藻在養(yǎng)殖廢水凈化中的使用也有相應(yīng)研究，劉慶輝等研究表明，小球藻類和柵藻類在養(yǎng)殖尾水中的氮磷吸收效果較好，氮磷去除率達(dá)85%以上；商洪國(guó)等利用鈍頂螺旋藻結(jié)合膜光合反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了海水養(yǎng)殖循環(huán)水高效的碳、氮、磷同步去除，無(wú)亞硝酸鹽累積；但是綠藻的其他藻種和硅藻在養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用研究不多，本試驗(yàn)選取4種藻種為海南本土篩選的藻種，包含兩種綠藻兩種硅藻，評(píng)估其對(duì)養(yǎng)殖廢水的凈化效果，為進(jìn)一步將微藻應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

試驗(yàn)用小球藻（Chlorella sp.）、微擬球藻（Nannochloropsis sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）、牟氏角毛藻（Chaetoceros sp.）均為本實(shí)驗(yàn)室分離純化鑒定保存的藻種；四尾柵藻（Scenedesmus sp.）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)（FACHB）。

1.2" 方法

1.2.1" 藻種培養(yǎng)" 小球藻用TAP培養(yǎng)基培養(yǎng)，微擬球藻、菱形藻、牟氏角毛藻用海水F/2培養(yǎng)基，四尾柵藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基按配方配制后121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫，藻種按20%的接種量接種。小球藻、微擬球藻、四尾柵藻放光照恒溫?fù)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min；菱形藻、牟氏角毛藻置于人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時(shí)間24 h，每天早、中、晚各搖瓶一次。藻種培養(yǎng)一周后，離心收集藻泥各1 g，用30 mL培養(yǎng)基重新懸浮備用。

1.2.2" 富營(yíng)養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水配制" 飼料浸出液：用中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所自制對(duì)蝦飼料50 g加500 mL水，浸泡1 h，用雙層400目篩網(wǎng)過濾，121 ℃，滅菌20 min，備用。取對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水，加上飼料浸出液30 mL/L、氯化銨15 mg/L、尿素15 mg/L、磷酸二氫鉀5 mg/L、磷酸氫二鉀3 mg/L、亞硝酸鈉60 mg/L，配制成富營(yíng)養(yǎng)化的養(yǎng)殖廢水，分裝至三角瓶中，每瓶加入400 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.3" 微藻在模擬養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)" 將藻種10 mL接種到350 mL滅菌模擬廢水中，每個(gè)藻種設(shè)三個(gè)重復(fù)，小球藻、微擬球藻、四尾柵藻放光照搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min，光照時(shí)間24 h；菱形藻、牟氏角毛藻放光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，光照時(shí)間24 h，早、中、晚人工各搖藻一次。每48 h取樣檢測(cè)一次，共培養(yǎng)6 d。

1.2.4" 微藻生物量的測(cè)定" 取各藻類培養(yǎng)液5 mL，檢測(cè)680 nm處的吸光值，同時(shí)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞密度的計(jì)數(shù)。取各藻類培養(yǎng)液10 mL，6 000 r/min離心5 min，用生理鹽水重懸浮洗滌離心3次，棄上清液，用萃取液（丙酮∶無(wú)水乙醇=1∶1）重懸藻細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中并定容，室溫避光浸提24 h，每3 h進(jìn)行顛倒混合。將萃取液轉(zhuǎn)入離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上清液。以萃取液調(diào)零，在642.5 nm和665 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣液的吸光值。按下列公式計(jì)算葉綠素a含量。 葉綠素a含量（mg/L）=9.99A665-0.0867A642.5

1.2.5" 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定" "取各藻類培養(yǎng)液50 mL，5 000 r/min離心5 min，用上清液稀釋后檢測(cè)水質(zhì)指標(biāo)，各指標(biāo)的檢測(cè)操作按試劑說明書的步驟進(jìn)行，各水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)儀器、試劑及方法見表1。

1.2.6" 統(tǒng)計(jì)分析" 結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANVOA），P＜0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2" 結(jié)果

2.1" 微藻在模擬富營(yíng)養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中的生長(zhǎng)情況

5種藻在富營(yíng)養(yǎng)化養(yǎng)殖廢水中的OD680、細(xì)胞密度和葉綠素a含量見圖1—圖3。小球藻第6天OD680為0.518，細(xì)胞密度為108×106 CFU/mL，葉綠素a含量為2.462 mg/L，均在5種微藻中最高，顯著高于其它4種微藻（P＜0.05）。菱形藻第6天OD680為0.298，葉綠素a含量為0.898 mg/L，在5種微藻中最低，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）。四尾柵藻的細(xì)胞密度最低，為3.2×106 CFU/mL，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）。

同組圖柱上標(biāo)不同字母表示差異顯著（Plt;0.05），下同。

2.2" 微藻對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的影響

2.2.1" COD去除效果" 如圖4和圖5所示，5種微藻均具有降低COD的作用，從第2天開始，各微藻組的COD已顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在接種第6天，5種微藻的COD去除率由高到低分別為菱形藻、小球藻、微擬球藻、牟氏角毛藻、四尾柵藻。小球藻和菱形藻在第6天的COD去除效果最優(yōu)，COD分別從初始值的485.9 mg/L和489.21 mg/L降至138.00 mg/L和144.67 mg/L，去除率分別為71.6%和70.4%；四尾柵藻的COD去除率最低，為61.50%。

2.2.2" 總氮去除效果" 5種微藻對(duì)總氮的去除效果如圖6和圖7所示，5種微藻對(duì)養(yǎng)殖廢水中的總氮均具有去除作用，接種小球藻、菱形藻、牟氏角毛藻和微擬球藻的總氮含量均在第2天開始顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），接種四尾柵藻的總氮含量在第4天開始顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。在接種的第6天，5種微藻的總氮去除率由高到低分別是小球藻、菱形藻、牟氏角毛藻、微擬球藻、四尾柵藻。四尾柵藻的第6天總氮去除率最低，為37.74%，顯著低于其它4種微藻（P＜0.05）；第6天總氮去除率最高為小球藻，為50.36%，總氮從初始的99.08 mg/L降至49.18 mg/L；在第6天時(shí)，除四尾柵藻以外的其它4種微藻種之間的總氮去除率沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3" 總磷去除效果" 5種微藻對(duì)總磷的去除效果見圖8和圖9，5種微藻均能降低養(yǎng)殖廢水中的總磷，接種小球藻、微擬球藻、四尾柵藻的總磷含量在第2天開始顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），接種菱形藻和牟氏角毛藻的總磷含量在第4天開始顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。接種的第6天，5種微藻的總磷去除率由高到低分別是菱形藻、牟氏角毛藻、小球藻、微擬球藻、四尾柵藻。小球藻在前4天的總磷去除量最大，到第6天時(shí)，菱形藻的總磷去除率最高，為72.45%，總磷從初始的20.25 mg/L降至5.79 mg/L，與其它4種微藻之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.4" 亞硝酸鹽氮去除效果" 5種微藻的亞硝酸鹽的去除效果見圖10和圖11，5種微藻均具有降低亞硝酸鹽的作用，其中接種四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻的第2天，亞硝酸鹽氮的去除率分別達(dá)到95.63%、96.60%和95.40%，亞硝酸鹽氮含量顯著低于小球藻和微擬球藻組（P＜0.05），在第4天以后，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻組的亞硝酸鹽氮含量均在檢測(cè)值以下；微擬球藻和小球藻組的亞硝酸鹽氮含量均在第6天達(dá)到檢測(cè)值以下。

3" 討論

3.1" 不同微藻的生長(zhǎng)情況

OD680主要通過測(cè)定微藻細(xì)胞內(nèi)色素在680 nm波長(zhǎng)處的光密度來反映微藻的生物量，葉綠素a含量是反映浮游植物生物量乃至水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的最直接有效的指標(biāo)。小球藻中總色素含量約占細(xì)胞干重的4%～5%，其中葉綠素占總色素的60%～80%。硅藻中除了葉綠素a外，巖藻黃素含量約占干重的0.22%～2.17%，故硅藻培養(yǎng)液顏色與綠藻不同，為黃褐色。由于不同種類微藻細(xì)胞內(nèi)色素組成的不同以及含量的差異，僅用OD680和葉綠素a含量來比較生物量并不準(zhǔn)確，必須結(jié)合細(xì)胞密度來進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，四尾柵藻的初始細(xì)胞密度較低，且在試驗(yàn)過程中增殖較慢，實(shí)際生物量增加較少，但持續(xù)升高的OD680值和葉綠素a含量均反映了其胞內(nèi)色素含量在持續(xù)積累。兩種硅藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量均增長(zhǎng)較慢，雖然四尾柵藻的細(xì)胞密度顯著低于兩種硅藻，但其OD680值和葉綠素a含量則顯著高于兩種硅藻。小球藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量均增長(zhǎng)最快，微擬球藻次之。另外發(fā)現(xiàn)，在第6天時(shí)，四尾柵藻和牟氏角毛藻的OD680值沒有顯著差異，但四尾柵藻的葉綠素a含量顯著高于牟氏角毛藻，表明牟氏角毛藻在試驗(yàn)后期積累了更多的葉綠素a以外的其它色素。

圖11" 微藻的亞硝酸鹽氮去除率

3.2" 不同微藻的水質(zhì)凈化能力

COD反映了水體中有機(jī)物污染水平，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，殘餌和水產(chǎn)動(dòng)物糞便是養(yǎng)殖水體中有機(jī)污染物的主要來源。本研究選用的5種微藻，對(duì)COD的降解活力均較強(qiáng)，COD初始值達(dá)到480 mg/L，在6 d后的去除率均能達(dá)到61%以上，其中小球藻和菱形藻還達(dá)到了70%以上。王亞潔等利用微擬球藻處理生活污水，處理13 d的COD 去除率為72.9%。在選用的5種微藻中，小球藻對(duì)COD的降解速度最快，這可能與小球藻的生長(zhǎng)速度較快有關(guān)；菱形藻在前期對(duì)COD的降解速度較慢，到后期的降解效果達(dá)到了小球藻的水平。值得關(guān)注的是，綜合OD680、細(xì)胞密度和葉綠素a含量來看，相對(duì)小球藻，菱形藻的生物量較低，但到第6天時(shí)也能達(dá)到小球藻的COD降解水平，表明菱形藻對(duì)COD的個(gè)體降解能力要高于小球藻，而小球藻對(duì)COD的降解主要是其生物量快速增加的總體效果。

氮磷濃度是藻類生長(zhǎng)的限制性因素，氮磷濃度過高反而會(huì)限制藻類的生長(zhǎng)活動(dòng)，從而影響氮磷的去除。本研究中，初始總氮約為100 mg/L，在此條件下總氮的6 d去除率為37.70%～50.36%，菱形藻、小球藻、牟氏角毛藻和微擬球藻均表現(xiàn)出較好的總氮去除能力，四尾柵藻總體差于其它4種微藻；菱形藻在前期略優(yōu)于其它微藻，但到第6天時(shí)小球藻降解效果最好，表明菱形藻對(duì)總氮的個(gè)體降解速率快，而小球藻對(duì)總氮的降解主要是其生物量快速增加的總體效果，與COD降解結(jié)果一致。本研究中，初始總磷濃度約20 mg/L，在此條件下總磷的6 d去除率為49.37%～72.45%，在試驗(yàn)前期，小球藻、微擬球藻和四尾柵藻的降磷效果優(yōu)于菱形藻和牟氏角毛藻，試驗(yàn)后期，菱形藻的降磷效果最佳，其次是牟氏角毛藻和小球藻。

針對(duì)亞硝酸鹽氮，5種微藻均有很強(qiáng)的降解能力，在初始濃度為10 mg/L的情況下，在試驗(yàn)前期，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻均已去除95%以上的亞硝酸鹽氮，擬微球藻的降解效果最差；試驗(yàn)中期，四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻均已將亞硝酸鹽氮全部降解，擬微球藻的降解速度提高，超過了小球藻；試驗(yàn)后期，5種微藻均將亞硝酸鹽氮全部降解。不同微藻對(duì)不同形態(tài)氮的吸收利用順序不同，張向陽(yáng)等研究了小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的吸收順序，發(fā)現(xiàn)小球藻對(duì)不同形態(tài)氮的吸收速率依次為：氨氮＞簡(jiǎn)單有機(jī)氮＞硝酸鹽氮＞亞硝酸鹽氮。本研究中，小球藻對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率差于四尾柵藻、菱形藻和牟氏角毛藻，這可能與小球藻對(duì)亞硝酸鹽氮的吸收順序有關(guān)。

錢磊對(duì)污水處理優(yōu)勢(shì)微藻群落進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示菱形藻和小環(huán)藻組成的實(shí)驗(yàn)組對(duì)污染物總氮、總磷的去除率最高，菱形藻為污水處理的優(yōu)勢(shì)微藻。在本研究中，綜合COD、總氮、總磷、亞硝酸鹽氮的去除效果，菱形藻也體現(xiàn)了最佳的綜合凈化效果，該菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

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Purification effect of several microalgae on aquaculture wastewater

ZHANG Xiuxia，XU Jiarui，HU Yonghua，DENG Xiaodong

（1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-Resources， Haikou 571101， China;2.Zhanjiang Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Zhanjiang 524013， China）

Abstract：In order to screen the dominant algae that can adapt to the tropical marine aquaculture environment and purify aquaculture wastewater efficiently， the ability of five microalgae to remove chemical oxygen demand （COD）， total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP） and nitrite nitrogen（NO-2N） was analyzed and compared. Chlorella sp.， Nannochloropsis sp.， Nitzschia sp.， Chaetoceros sp.， which were locally screened in Hainan， and purchased species Scenedesmus sp. were selected and cultured in eutrophic aquaculture wastewater with shrimp aquaculture water as bottom solution for 6 days. The results showed that Chlorophyta grew faster and diatom grew slower in aquaculture wastewater. Chlorella sp. grew best in eutrophic aquaculture wastewater， with the highest OD680 value， chlorophyll-a content and cell density， which were significantly different from other algae species （Plt;0.05）. Among the five kinds of algae， the ones with good COD removal effect were Nitzschia sp. and Chlorella sp.， and the removal rates were 71.6% and 70.4% respectively. The algae species with good removal efficiency of total nitrogen were Nitzschia sp.， Chlorella sp.， Chaetoceros sp. and Nannochloropsis sp.， and the removal rates were 50.36%， 47.96%， 46.41% and 42.79% respectively. Nitzschia sp. was the best algae to remove total phosphorus， and the removal rate was 71.43%.The algae species with good removal effect of nitrite nitrogen were Nitzschia sp.，Scenedesmus sp.and Chaetoceros sp. ，The removal rates in two days were 96.60%， 95.63% and 95.40% respectively. Nitzschia sp. had the best comprehensive purification effect on aquaculture wastewater.

Key words：microalgae; aquaculture wastewater; purification; total nitrogen; total phosphorus

（收稿日期：2024-03-22）