張夏夏 白銀雪 吳丹丹 孫龍飛 任珊 安冬青

摘要? 目的：基于葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）/NOD樣受體蛋白3（NLRP3）信號通路探討天香丹通過調控內質網(wǎng)應激抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法：將雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠隨機分為模型組、阿托伐他汀組、天香丹組，每組11只，給予高脂飼料誘導動脈粥樣硬化模型；另取10只雄性C57BL/6J小鼠作為正常組。于造模10周后給予相應藥物治療，連續(xù)干預12周。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀法察胸主動脈病理特點；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）含量；免疫組織化學法（IHC-P）檢測胸主動脈中GRP78和NLRP3蛋白陽性表達水平。結果：各實驗組存活6只。與模型組比較，阿托伐他汀組和天香丹組IL-1β、IL-18、ROS表達含量均降低（P＜0.05或P＜0.01）；GRP78、NLRP3蛋白陽性表達均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。結論：天香丹能有效改善動脈粥樣硬化性心血管疾病小鼠炎癥反應，其作用機制可能與調控內質網(wǎng)應激GRP78/NLRP3信號通路抑制炎癥小體活化、減輕動脈粥樣硬化炎癥損傷有關。

關鍵詞? 動脈粥樣硬化；天香丹；內質網(wǎng)應激；葡萄糖調節(jié)蛋白78；NOD樣受體蛋白3；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.006

The Anti-atherosclerosis Mechanism of Tianxiangdan by Regulating Endoplasmic Reticulum Stress Through GRP78/NLRP3 Signaling Pathway

ZHANG Xiaxia， BAI Yinxue， WU Dandan， SUN Longfei， REN Shan， AN Dongqing

Xinjiang Medical University Institute of TCM， Urumqi 830011， Xinjiang， China

Corresponding Author? AN Dongqing， E-mail： 995079431@qq.com

Abstract? Objective：Based on the glucose-regulatory protein 78（GRP78）/NOD-like receptor protein 3（NLRP3） signaling pathway to explore the anti-atherosclerosis mechanism of Tianxiangdan through regulation of endoplasmic reticulum stress.Methods：A total of 35 male apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice were randomly divided into model group，atorvastatin group and Tianxiangdan group，with 6 mice in each group.Atherosclerosis model was induced by high fat diet.Another 10 male C57BL/6J mice were selected as the normal group.After 10 weeks of modeling，the corresponding drug treatment was given.The intervention lasted for 12 weeks.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological features of thoracic aorta.Serum interleukin-1β（IL-1β），interleukin-18（IL-18） and reactive oxygen species（ROS） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The positive expression levels of GRP78 and NLRP3 proteins in thoracic aorta were detected by immunohistochemistry（IHC-P）.Results：Compared with model group，the expression levels of IL-1β，IL-18 and ROS in atorvastatin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05 or P＜0.01），the positive expressions of GRP78 and NLRP3 decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Tiangdan can effectively improve the inflammatory response of mice with atherosclerotic cardiovascular disease，and its mechanism may be related to the regulation of endoplasmic reticulum stress GRP78/NLRP3 signaling pathway to inhibit the activation of inflammasome and reduce the inflammatory damage of arteriosclerotic disease.

Keywords? arteriosclerotic cardiovascular disease; Tianxiangdan; endoplasmic reticulum stress; glucose-regulatory protein 78; NOD-like receptor protein 3; experimental study

基金項目? 國家自然科學基金項目（No.8206150791）；新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室開放課題（No.2023D04052）；新疆維吾爾自治區(qū)研究生創(chuàng)新項目（No.XJ2023G198）；新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室項目（No.2020D04006）；新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項（No.2022A03019）

通訊作者? 安冬青，E-mail：995079431@qq.com

引用信息? 張夏夏，白銀雪，吳丹丹，等.天香丹通過GRP78/NLRP3信號通路調控內質網(wǎng)應激抗動脈粥樣硬化的作用機制研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（11）：1955-1960.

動脈粥樣硬化性心血管疾?。╝rteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球死亡的主要原因之一［1］，其中血脂異常是關鍵的致病因素。據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2022概要》［2］報道，在我國因ASCVD導致的死亡人數(shù)高達1 139萬例，其不適癥狀的延綿性、長期性和醫(yī)療昂貴等方面，已成為全球亟待解決的社會和醫(yī)學問題。

動脈粥樣硬化的發(fā)病機制已被廣泛研究，其中炎癥反應被認為貫穿于其整個發(fā)病過程，由此，抑制炎癥反應也被稱為“曙光初現(xiàn)”［3］。目前，常規(guī)治療動脈粥樣硬化的方法包括調節(jié)血脂、抗炎、擴血管、抗凝等藥物，病變管腔發(fā)生明顯狹窄或堵塞時，以介入或手術治療為主。然而長期聯(lián)合服用以上藥物多伴有肌溶解和肝損傷等副作，目前醫(yī)學影像技術也具有一定局限性，并且介入手術易影響血管阻力指數(shù)導致肌細胞死亡［4-6］。然而，在我國，中醫(yī)藥治療動脈粥樣硬化療效顯著且副作用較?。?-14］。復方天香丹已取得臨床成果轉化與專利申請，本方由紅景天、丹參、新塔花、降香組成，全方共奏行氣活血、化瘀止痛之功，經(jīng)長期臨床研究發(fā)現(xiàn)，天香丹具有抗動脈粥樣硬化的療效［15］。

研究者發(fā)現(xiàn)，隨著對動脈粥樣硬化機制的深入研究，炎癥反應與內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）之間的串擾機制可能是揭示動脈粥樣硬化發(fā)病機制的新途徑。ERS標志物葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）已在多種心血管疾病中表達，其介導的炎癥反應和細胞凋亡與動脈粥樣硬化的形成和斑塊的脫落密切相關［16-21］。ERS發(fā)生時，解離后的GRP78能夠介導多種下游信號通路激活炎癥小體（nod-likereceptorprotein 3，NLRP3）加重動脈粥樣硬化的進展［22-23］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，NLRP3可能是天香丹治療動脈粥樣硬化的關鍵靶標［24-25］。但ERS是如何通過調控激活NLRP3介導天香丹發(fā)揮其心肌保護作用的機制未明確。由此，本研究擬在成功干預動脈粥樣硬化動物模型的基礎上，探討天香丹通過GRP78/NLRP3信號通路調控ERS抗動脈粥樣硬化的作用機制，為天香丹防治動脈粥樣硬化提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 藥物與試劑

天香丹顆粒購自新奇康藥業(yè)股份有限公司（規(guī)格：每包9 g，批號：210540，藥物專利號：200910210063.9）；阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥有限公司（批號：EE0898）。白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司（批號：YX-E28912、YX-E21218、YX-E28857）；蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京蘭杰柯科技有限公司（批號：BL700B）；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑、封閉用羊血清購自北京中杉金橋生物技術有限公司（批號：PV-6001、ZLI-9022）；3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、抗體GRP78、NLRP3購自艾博抗貿(mào)易有限公司（批號：ab64238、ab21685、ab214185）；通用型抗體稀釋液購自北京索萊寶科技有限公司（批號：A1800）。

1.2? 儀器

低溫高速離心機、全自動組織脫水機、EG1150型包埋機、RM2235型切片機、恒溫水浴鍋均購自德國Leica；自動恒溫烤片儀（湖北泰雅醫(yī)療科技），恒溫干燥箱（上海博訊），酶標儀（美國Thermo Fisher），正置光學顯微鏡（日本Nikon）。

1.3? 實驗動物

43只無特定病原體（SPF）級雄性8周齡小鼠，其中載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠33只，C57BL/6J小鼠10只，體質量（18±2）g，購于北京維通利華實驗動物科技有限公司和新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)環(huán)境于人工晝夜循環(huán)空氣清潔房內，溫度為22～28 ℃，明暗時間為12 h/12 h，自由飲水、進食。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗動物經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學倫理委員會審批（批號：IACUC-20200331-47）。

1.4? 造模、分組及給藥方法

檢疫適應1周后，將33只8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為模型組（高脂飼料＋純化水）、阿托伐他汀組（高脂飼料＋阿托伐他汀鈣片沖泡液）、天香丹組（高脂飼料＋天香丹顆粒沖泡液），每組11只，予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)；10只C57BL/6J小鼠作為正常組，予以基礎飼料喂養(yǎng)（基礎飼料＋蒸餾水）。飼養(yǎng)第11周，隨機處理3只ApoE-/-小鼠檢驗斑塊形成后，給予藥物灌胃干預。藥物以成人臨床用藥劑量同效換算小鼠實驗用藥量灌胃，將干預藥品溶于500 μL純化水中，阿托伐他汀組與天香丹組分別按照3.0 mg/（kg·d）、2.7 g/（kg·d）的劑量進行治療，模型組和正常組以同比例體積的純化水進行灌胃，每日1次，每周根據(jù)小鼠體重變化調整藥物灌胃量，繼續(xù)喂養(yǎng)12周。造模及給藥期間各組均有死亡，最終統(tǒng)計樣本量各為6只。

1.5? 標本留取

末次灌胃后，術前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，觸及心尖搏動最強處后進行胸腹部區(qū)域消毒，沿膈肌下緣剖開腹腔，取1 mL注射器與心尖搏動處呈30°角刺入5～10 mm處采集血液后取上清，置于－80 ℃低溫保存用于檢測血清指標。后剝離頸、胸、腹主動脈組織分裝于4%多聚甲醛固定液中，用于HE、免疫組織化學法（IHC-P）病理觀察。

1.6? IL-18、IL-1β、ROS水平檢測

按照ELISA試劑盒說明書，采用雙抗夾心法檢測各組血清IL-18、IL-1β、ROS水平。

1.7? IHC-P法檢測胸主動脈組織中GRP78、NLRP3蛋白表達量

切片放入60 ℃烘箱中1 h后置于室溫10 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡20 min，各梯度乙醇中浸泡5 min，高溫抗原修復20 min，放置室溫1 h，滴加H2O2酶遮光放置15 min，滴加山羊血清并放入37 ℃烘箱孵育30 min，滴加一抗于4 ℃冰箱過夜，復溫30 min，滴加二抗并放入37 ℃烘箱孵育30 min，DAB、蘇木精染液染色后進行分化與脫水處理，二甲苯溶液透明并封片，鏡下采集圖像并分析蛋白表達量。

1.8? 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 27.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。定量資料滿足正態(tài)分布用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結? 果

2.1? 各組小鼠胸主動脈組織HE染色結果

HE染色結果顯示，模型組可見明顯斑塊，阿托伐他汀組與天香丹組斑塊較模型組減小，正常組無斑塊出現(xiàn)。詳見圖1。

2.2? 各組血清IL-1β、IL-18、ROS水平比較

與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18、ROS水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與天香丹組血清IL-1β、IL-18、ROS水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖2。

（A為各組IL-1β水平比較；B為各組IL-18水平比較；C為各組ROS表達比較）

2.3? 各組胸主動脈中GRP78、NLRP3蛋白陽性表達比較

與正常組比較，模型組GRP78、NLRP3蛋白陽性表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與天香丹組GRP78、NLRP3蛋白陽性表達明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖3、圖4、表1。

3? 討? 論

動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展可引起心肌梗死、心肌纖維化等急性臨床事件［26］，是導致病人死亡的重要危險因素。動脈粥樣硬化本質是一類慢性炎癥性疾病，血管內膜中沉積的不溶性膽固醇晶體常積累在溶酶體中并破壞其膜結構，溶酶體裂解后釋放的組織蛋白酶可促進NLRP3炎癥小體活化、激活NLRP3蛋白，啟動下游炎性因子IL-1β、IL-18持續(xù)加重炎癥反應，促使壞死核心形成和纖維帽變薄，最終導致斑塊破裂和血栓形成，引起急性血管性病變［27］。因此，靶向抑制NLRP3炎癥小體是治療動脈粥樣硬化的關鍵一環(huán)。

自炎癥小體首次發(fā)現(xiàn)以來，有關NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化性疾病的研究較多，目前動脈粥樣硬化中NLRP3炎癥小體活化的學說包含氧化應激、線粒體功能障礙、ERS、溶酶體破裂等，其中包含多類別、多形式的分子信號傳遞，如K＋、Ca2＋的流離，三磷酸腺苷（ATP）、ROS及蛋白分子的釋放［28-30］。ERS介導動脈粥樣硬化發(fā)病的多種病理過程中涉及多條信號通路，ERS水平持續(xù)升高會激活NLRP3炎癥小體，本研究在上述作用機制的基礎上進一步探索ERS與NLRP3炎癥小體及信號蛋白在動脈粥樣硬化中的交互作用。ERS是內質網(wǎng)在受刺激后引起自身對蛋白產(chǎn)生錯誤折疊與未折疊蛋白積累的一種反應［31］，在不同物種的動脈粥樣硬化病變處已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ERS標志物［32］。相關研究證實除ERS抑制劑外，相關拮抗藥物也能在動脈粥樣硬化模型或環(huán)境下下調GRP78、NLRP3、IL-18、IL-1β、ROS的表達，其中中藥丹參提取物丹參酸B在GRP78-NLRP3信號傳遞過程中體現(xiàn)出良好的調控效果［33-37］，以上研究結果與本實驗結果相符。近年來，國內外對ERS參與動脈粥樣硬化的查究進展持續(xù)加快，但少有研究探索動脈粥樣硬化性疾病中ERS與NLRP3的交互影響及作用。中醫(yī)藥對動脈粥樣硬化的防治頗有研究且安全效優(yōu)，本研究為中醫(yī)藥調節(jié)ERS抑制NLRP3炎癥小體活化治療動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。

中醫(yī)治療動脈粥樣硬化主要采用化痰、祛瘀、活血、行氣等，并將動脈粥樣硬化歸屬于“真心痛”“胸痹”等范疇。痰涎本由氣血化生，虛留于脈且久息成積則會導致氣虛不推血運形成瘀血，血虛不流則脈道不通，痰飲久而不去則血易成濁，壅于血府，血瘀自成。本虛是動脈粥樣硬化發(fā)病的前提，脈中無氣、血府積濁導致的“痰瘀”阻塞是脈痹發(fā)生與發(fā)展的關鍵，痰瘀互結、損傷脈道是動脈粥樣硬化發(fā)病的病機［38］，其中不通則痛的表現(xiàn)最為常見，痰瘀同治與補益并施是動脈粥樣硬化的治療原則。內質網(wǎng)于穩(wěn)態(tài)下的作用與氣血的功能極其相似，氣血功能的失調與ERS相關，部分學者認為內質網(wǎng)的功能結構與三焦也有相似之處，氣血的疏通和氣機的調暢也與內質網(wǎng)有一定聯(lián)系［39-41］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體、中藥提取物、中成藥、中藥復方能在動脈粥樣硬化中對ERS起到調控作用［42］。復方天香丹以紅景天為君，具有補氣養(yǎng)血、活血化瘀止血之功；丹參為臣，具有益氣養(yǎng)血、活血通絡、祛瘀止痛之功效；新塔花與降香俱為辛香走竄之品，有通陽宣痹作用，全方遵循“本虛標實”的病機，以通而不忘其正虛、補而不忘其邪實的療法達到治療目的。前期臨床及基礎研究證實，天香丹能夠通過降低血清中炎性因子及血脂水平、穩(wěn)定斑塊、改善血管內皮功能等方面達到治療動脈粥樣硬化的作用，其中涉及血流動力學、核因子-κB信號通路、基因組學、細胞凋亡、脂質代謝等研究，然而對ERS學說的探索較少［43-49］。本實驗結果顯示，與模型組相比，天香丹能夠通過減輕ERS，在動脈粥樣硬化模型小鼠胸主動脈和血清中下調ERS起始蛋白GRP78及炎癥蛋白NLRP3、IL-18、IL-1β和促炎物質ROS的表達量。

綜上所述，復方天香丹可能通過調控GRP78/NLRP3信號通路降低GRP78、NLRP3蛋白和ROS的表達，減少下游炎性因子IL-18、IL-1β的釋放，緩解ERS并抑制炎癥反應進程，達到減緩動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和抗動脈粥樣硬化的作用。中醫(yī)藥調控ERS抑制NLRP3炎癥小體在動脈粥樣硬化的作用機制，不僅能夠加深對動脈粥樣硬化起病機制的理解，也可為動脈粥樣硬化的診斷提供新方向。

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（收稿日期：2024-01-21）

（本文編輯郭懷?。?/p>