李海燕 范彬 白雯靜 尹盼盼 彭騰騰 石曉峰

【摘 要】???目的： 以“藥食兼用”的香薷為主要原料，研究中藥香薷揮發(fā)油空氣清新劑的制備工藝，以期為后續(xù)香薷防瘟疫系列產(chǎn)品的注冊(cè)和工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法： 以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌，抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用紙片抑菌試驗(yàn)方法結(jié)合析因設(shè)計(jì)篩選空氣清新劑最佳制備工藝，通過(guò)試管二倍稀釋法測(cè)定香薷空氣清新劑的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。 結(jié)果： 精油含量和含醇量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果具有顯著性影響（ P＜ 0.05），兩因素間交互作用不明顯，經(jīng)析因設(shè)計(jì)確定香薷空氣清新劑最佳制備工藝：香薷精油與雪松精油的配比為8∶?2，精油與吐溫-80的配比為1∶?4，精油含量為6%、含醇量為40%。制得的香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為 ?7.81 μL/mL ，最低殺菌濃度為62.5 μL/mL。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)制得了一種抑菌效果良好的中藥空氣清新劑。

【關(guān)鍵詞】 ?香薷精油；空氣清新劑；紙片抑菌試驗(yàn)；析因設(shè)計(jì)

【中圖分類號(hào)】R285

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2024）08-0044-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.08.zgmzmjyyzz202408010

Preparation Technology and Antibacterial Effect Evaluation of Mosla Chinensis Air Freshener

LI Haiyan ?1，2 ?FAN Bin 2 BAI Wenjing 3 YIN Panpan ?1，2 ?PENG Tengteng ?1，2 ?SHI Xiaofeng ?1，2，3*

1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China;

2. Gansu Academy of Medical Sciences， Lanzhou 730000， China;

3. Lanzhou Institute of Food and Drug Control， Lanzhou 730000， China

Abstract：

Objective ?To study the preparation technology of Mosla chinensis essential oil air freshener with “medicinal and edible” Mosla Chinensis as the main raw material， in order to provide laboratory basis for the subsequent registration and industrial production of Mosla Chinensis pestilence prevention series products. ?Methods ?Using S. aureus as test bacteria and the diameter of inhibition zone as evaluation index， the paper antibacterial test method combined with factorial design was used to screen the optimal preparation process of air freshener. The minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of Elsa chinensis air freshener were determined by tube double dilution method. ?Results ?The content of essential oil and alcohol had a significant effect on the antibacterial effect of S. aureus （ P＜ 0.05）， and the interaction between the two factors was not obvious. The optimal preparation process of Elsuch air freshener was determined by factorial design： The ratio of Elmosla essential oil to cedar essential oil is 8∶?2， the ratio of essential oil to Tween-80 is 1∶?4， the content of essential oil is 6%， and the content of alcohol is 40%. The minimum inhibitory concentration of the prepared Eltzla chinensis air freshener against S. aureus was 7.81 μL/mL， and the minimum bactericidal concentration was 62.5 μL/mL. ?Conclusion ?A Chinese medicine air freshener with good antibacterial effect was prepared in this experiment.

Key words：

Elsholtzia Essential Oil;Air Freshener;Disk Antibacterial Test;Factorial Design

中藥空氣清新劑一般選用富含揮發(fā)油和具有廣譜抗菌、抗病毒功效的中藥材作為原料 ?［1］ ，或選用藥食兩用藥材組成的中藥組方制成。依中藥空氣清新劑的外觀形態(tài)可分為固體、液體和氣霧型三種，其安全性高，用途廣泛，可用于清新空氣、環(huán)境消毒、預(yù)防疾病、驅(qū)蚊、防止暈車等。香薷作為常用的芳香中藥，揮發(fā)油是其主要的藥效成分，現(xiàn)代研究 ?［2-4］ 發(fā)現(xiàn)，香薷揮發(fā)油有良好的廣譜抗菌抗病毒作用，可作為抗菌防疫產(chǎn)品的原料，此外，還具有消炎解熱、鎮(zhèn)靜止痛和調(diào)節(jié)免疫等功效。故本實(shí)驗(yàn)選擇以香薷揮發(fā)油為主要原料，旨在研發(fā)氣味清香、空氣消毒效果良好的中藥空氣清新劑，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 詳見(jiàn)表1。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 詳見(jiàn)表2。

1.1.3 供試菌 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC （B） 26 003］，購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院， 并定期采用國(guó)標(biāo)的鑒定方法進(jìn)行鑒定和確認(rèn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香薷空氣清新劑的制備 如圖1所示。

1.2.2 抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1 培養(yǎng)基的制備 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：加蒸餾水煮沸溶解，pH為（7.3±0.2），121 ℃高壓滅菌15 min， 備用。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：加蒸餾水煮沸溶解，pH為（7.5±0.2），分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.2.2.2 菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌菌株保藏斜面，將斜面培養(yǎng)物用無(wú)菌生理鹽水洗下，并稀釋至5.0×10 5 ～5.0×10 6 CFU/mL備用。

1.2.2.3 紙片抑菌試驗(yàn) 用打孔器制備直徑6 mm的定性濾紙片，經(jīng)高壓滅菌器滅菌后，置于160 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干。取干燥的無(wú)菌濾紙片，每片滴加10 μL精油/香薷混合液，將該含藥濾紙片平放于無(wú)菌平皿內(nèi)，置室溫下自然干燥后備用。

按《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（WS/T 650-2019） ?［5］ 的要求，在生物安全柜中移取金黃色葡萄球菌菌懸液100 μL于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上，用L棒涂布均勻，使菌懸液均勻分布到TSA平板的表面，靜置5 min，待菌液完全被平板吸收后，用無(wú)菌敷料鑷取含藥濾紙片貼放于平板表面，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片（各樣片中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距 ?15 mm ?以上），1片陰性對(duì)照樣片（置于平板中心）。并用無(wú)菌敷料鑷輕壓樣片，使其緊貼于平板表面后，蓋好平皿，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。平行3次試驗(yàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄，取平均值作為最終試驗(yàn)結(jié)果。

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定：陰性對(duì)照樣片應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生，試驗(yàn)樣品抑菌環(huán)直徑＞7 mm者，判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑≤7 mm者，判為無(wú)抑菌作用。

1.2.3 香薷精油與雪松精油配比的篩選 將香薷精油和雪松精油以9∶?1、8∶?2、7∶?3、6∶?4（v/v）的比例進(jìn)行復(fù)配，通過(guò)紙片抑菌試驗(yàn)，以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同配比下的香薷精油與雪松精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果，確定香薷精油和雪松精油的最佳配比。

1.2.4 香薷、雪松混合精油與吐溫-80配比的篩選 取一定量混合精油6份，將其與吐溫-80以 1∶?1 、1∶?2、1∶?3、1∶?4、1∶?5、1∶?6（v/v）的比例混勻，加適量無(wú)水乙醇后，再加蒸餾水至總量混勻，觀察藥液外觀形態(tài)，確定香薷、雪松混合精油與吐溫-80的最佳配比。

1.2.5 析因設(shè)計(jì)結(jié)合紙片抑菌試驗(yàn)確定香薷空氣清新劑最佳配方

1.2.5.1 單因素試驗(yàn) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精油含量和含醇量是影響香薷空氣清新劑抑菌性的的最主要因素，采用紙片抑菌試驗(yàn)，以金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取精油含量和含醇量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5.1.1 精油含量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定含醇量為40%，以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察精油含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%時(shí)的香薷混合液對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果。

1.2.5.1.2 含醇量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 固定精油含量為6%，以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察含醇量為 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%時(shí)的香薷混合液對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果。

1.2.5.2 析因設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，A因素（精油含量）設(shè) 2水平，B因素（含醇量）設(shè)4水平。見(jiàn)表3。根據(jù)2×4析因設(shè)計(jì)法制備8種香薷空氣清新劑（表4），通過(guò)紙片抑菌試驗(yàn)，比較各組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

1.2.6 香薷空氣清新劑最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測(cè)定

1.2.6.1 香薷空氣清新劑最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法，用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基對(duì)香薷空氣清新劑進(jìn)行倍比稀釋，使香薷空氣清新劑濃度分別為500 μL/mL、250 μL/mL、125 μL/mL、62.5 μL/mL、31.25 μL/mL、15.63 μL/mL、7.81 μL/mL、3.91 μL/mL、1.95 μL/mL、0.98 μL/mL、0.49 μL/mL、0.25 μL/mL。按無(wú)菌操作要求，向各試管中分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照管（含菌懸液及液體培養(yǎng)基，不含藥液）、培養(yǎng)基對(duì)照管（只含液體培養(yǎng)基）、空白藥液-陰性對(duì)照管（只含藥液）。將各試管放在36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

結(jié)果判斷：在陽(yáng)性對(duì)照管細(xì)菌呈渾濁狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)基對(duì)照管、藥液對(duì)照管無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)且呈透明狀的前提下，觀察不同濃度香薷空氣清新劑試管的渾濁情況，以細(xì)菌不生長(zhǎng)（肉眼觀察試管為透明狀）的最低濃度為香薷空氣清新劑的最低抑菌濃度。

1.2.6.2 香薷空氣清新劑最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 在“1.2.6.1”試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從無(wú)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基試管中吸取200 μL混和液，涂布于TSA平板上，置于36 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小濃度為香薷空氣清新劑的最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定香薷精油與雪松精油的最佳配比 通過(guò)考察香薷精油與雪松精油在4種不同配比（9∶?1、8∶?2、7∶?3、6∶?4）下對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果，發(fā)現(xiàn)4種不同配比的香薷、雪松混合精油均對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用且抑菌效果相差不大，并且顯示香薷精油：雪松精油為8∶?2時(shí)抑菌效果好，抑菌圈直徑達(dá)11.19 mm，其次考慮以香薷精油為主要原料，故確定香薷精油與雪松精油配比為8∶?2。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2 確定香薷、雪松混合精油與吐溫-80的最佳配比 本品是以精油為原料制成的空氣清新劑，防止精油在制劑中溶解不充分，故加入乳化劑吐溫-80。通過(guò)觀察香薷、雪松混合精油與吐溫-80在不同配比下的藥液外觀形態(tài)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)香薷、雪松混合精油：吐溫-80為1∶?4、1∶?5、1∶?6時(shí)可使藥液澄清，按照藥用輔料最小的藥用原則，確定香薷、雪松混合精油與吐溫-80的最佳配比為1∶?4。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3 析因設(shè)計(jì)結(jié)合紙片抑菌試驗(yàn)確定香薷空氣清新劑最佳配方

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 精油含量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 固定含醇量為40%，以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)考察精油含量為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%時(shí)的香薷混合液對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)精油含量大于3%時(shí)香薷混合液開(kāi)始對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用，并隨精油含量的增加抑菌效果有所增加，且當(dāng)精油含量為6%、7%時(shí)，抑菌效果較好，抑菌圈直徑可達(dá)7.24 mm和7.52 mm。故選取精油含量為6%和7%的兩個(gè)水平。結(jié)果見(jiàn)表7，如圖2所示。

2.3.1.2 含醇量對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 固定精油含量為6%，以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)考察含醇量為 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%時(shí)的香薷混合液對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果，發(fā)現(xiàn)香薷混合液對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果隨含醇量的增加而有所增加（除含醇量在20%時(shí)無(wú)抑菌效果外，其余含醇量的香薷混合液均對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑制作用），并且當(dāng)含醇量≥40%時(shí)抑菌效果較明顯，抑菌圈直徑均大于8.00 mm，但各含醇量間的抑菌效果差別不大，考慮到乙醇作為溶劑的原因，故選取含醇量為35%、40%、45%、50%的4個(gè)水平。結(jié)果見(jiàn)表8，如圖3所示。

2.3.2 析因設(shè)計(jì)結(jié)果 通過(guò)考察8種香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌的紙片抑菌效果，發(fā)現(xiàn)8種香薷空氣清新劑均對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好抑菌效果，并且其抑菌效果大小排序?yàn)锳2B4＞A2B3＞A1B4＞A2B2＞A1B3＞A2B2＞A1B2＞A1B1。由SPSS兩因素方差分析可知，在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，精油含量（A）和含醇量（B）對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的影響都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［ P＜ 0.05，P（A）為0.012，P（B）為0.007］。兩因素間無(wú)明顯交互作用（ P= 0.484＞0.05）。見(jiàn)表9。

綜上及考慮到精油成本及乙醇用量安全性問(wèn)題確定香薷空氣清新劑最佳配方為A1B2（精油含量為6%，含醇量為40%）。

2.4 確定香薷空氣清新劑的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC） 通過(guò)觀察金黃色葡萄球菌在不同濃度香薷空氣清新劑下的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)香薷空氣清新劑濃度為7.81 μL/mL時(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，濃度為3.91 μL/mL時(shí)細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)，故確定香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為7.81 μL/mL。見(jiàn)表10；通過(guò)觀察TSA平板上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)香薷空氣清新劑的濃度為62.5 μL/mL時(shí)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，濃度為 ?31.25 μL/mL ?時(shí)細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)，故確定香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為 ?62.5 μL/mL 。見(jiàn)表11。

2.5 確定香薷空氣清新劑的最佳制備工藝 根據(jù)析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定香薷空氣清新劑制備工藝為：吸取一定量按8∶?2配比的香薷、雪松混合精油，以精油與乳化劑吐溫-80為1∶?4的比例加入吐溫-80，混勻，加入無(wú)水乙醇適量，混勻，再加蒸餾水使含醇量達(dá)40%，精油含量達(dá)6%，滴加適量薰衣草精油調(diào)香，分裝，即得。

2.6 香薷空氣清新劑的制備工藝驗(yàn)證 重復(fù)上述“2.5”項(xiàng)下香薷空氣清新劑制備工藝，制備三批香薷空氣清新劑，采用紙片抑菌試驗(yàn)考察其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。見(jiàn)表12，結(jié)果顯示三批香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用較好，且紙片抑菌圈直徑均大于9 mm，證明上述制備工藝可行，重復(fù)性好。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)確定香薷空氣清新劑的最佳制備工藝：香薷精油與雪松精油的配比比例為8∶?2（v/v），精油與乳化劑吐溫-80的加入比例為1∶?4（v/v），精油含量為6%、含醇量為40%。確定香薷空氣清新劑的最低抑菌濃度為7.81 μL/mL，最低殺菌濃度為62.5 μL/mL。本研究制備的空氣清新劑具清新和抑菌雙重功效，并且其安全性高、綠色環(huán)保，也無(wú)對(duì)衣物的藥液染色現(xiàn)象，有很好的推廣價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中紙片抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是很平行，考慮主要有三方面的原因：①用打孔器制備直徑6 mm的定性濾紙片時(shí)，由于打孔器使紙片彎折等原因，各紙片直徑大小會(huì)存在差異，對(duì)抑菌結(jié)果的測(cè)定會(huì)產(chǎn)生一定的影響；②由于精油穩(wěn)定性的原因，對(duì)紙片抑菌結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的影響；③用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)存在人為的測(cè)量誤差，導(dǎo)致結(jié)果存在一定的差異。

實(shí)驗(yàn)制得的香薷空氣清新劑對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，但抑制程度不高，而從“2.3.1.2”項(xiàng)下結(jié)果可知醇濃度的增加會(huì)使該制劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果增加，由于本實(shí)驗(yàn)將無(wú)水乙醇作為溶劑加入，故沒(méi)有考慮將該制劑中的醇濃度加大，如果后期想讓該制劑能有更好的抑菌效果，考慮將含醇量加大到75%可能會(huì)實(shí)現(xiàn)其抑菌效果的增強(qiáng)。

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［5］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn). 抗菌和抑菌效果評(píng)價(jià)方法：WS/T 650—2019［S］. 北京：國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)，2019.

（收稿日期：2023-07-29 編輯：劉 斌）