劉文杰 張俊峰 何夢凡 唐佳慧 姜淑玲 郭文強

摘要： 目的 了解井岡山地區(qū)苔蘚內(nèi)生真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特點，為特殊生境來源內(nèi)生真菌抗生素研究打下基礎(chǔ)。方法 本文采用可培養(yǎng)方法分離內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS-rDNA分子生物學(xué)數(shù)據(jù)對所分離的菌株進(jìn)行鑒定，利用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌活性篩選與分析。結(jié)果 從4種苔蘚樣品中共分離純化232株可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，其分離頻率和定殖率分別在1.84～2.88和95.65%～100%之間。分子生物學(xué)特征顯示內(nèi)生真菌歸于38個分類屬，其中青霉屬是4種苔蘚植物的優(yōu)勢內(nèi)生真菌屬，但各類苔蘚的優(yōu)勢種存在差異，部分內(nèi)生真菌顯示出宿主專一性。生物活性篩選結(jié)果顯示其中50株內(nèi)生真菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性，綜合活性率為21.55%。結(jié)論 本研究表明井岡山地區(qū)苔蘚內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，其次級代謝產(chǎn)物良好的抗菌活性，預(yù)示著潛在的抗生素類天然產(chǎn)物研究價值。

關(guān)鍵詞：井岡山地區(qū)；苔蘚植物；內(nèi)生真菌；多樣性；抗菌活性

中圖分類號：R915文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Diversity and antibacterial activity of endophytic fungi

from bryophyte species in Jinggangshan area

Liu Wenjie1， 2， Zhang Junfeng1， He Mengfan1， Tang Jiahui1， Jiang Shuling1， and Guo Wenqiang1

（1 Department of Medicine， Jinggangshan University， Ji'an 343009; 2 Office of Academic Research， Jinggangshan University， Ji'an 343009）

Abstract Objective To understand the diversity and community structure characteristics of endophytic fungi in mosses in the Jinggangshan area， and lay a foundation for the study of antibiotics for endophytic fungi from special habitat sources. Methods Culturable methods were used to isolate endophytic fungi. The isolated strains were identified based on morphological characteristics and ITS-rDNA， and the paper diffusion method was applied for antibacterial activity screening. Results A total of 232 cultivable endophytic fungi were purified from four bryophyte species， with isolation frequencies and colonization rates ranging from 1.84～2.88 and 95.65%～100%， respectively. Molecular biology characteristics showed that the endophytic fungi belonged to 38 species， among which penicillium was the dominant endophytic fungi genera of the four bryophyte species. However， the dominant species of each type in bryophytes were different， demonstrating host specificity. The biological activity results showed that the static fermentation products exhibited antibacterial activity， with a comprehensive activity rate of 21.55%. Conclusion This study indicated that the endophytic fungi had generous species diversities， and their secondary metabolites showed great antibacterial activity and potential research value for antibiotic products.

Key words Jinggangshan area; Bryophyte species; Endophytic fungi; Diversities; Antibacterial activity

苔蘚植物作為一類獨特的小型高等植物，沒有真正的根、莖、葉的分化，主要由孢子進(jìn)行繁殖，多生長于陰濕環(huán)境之中。在植物界演化進(jìn)程中，它代表著從水生逐漸過渡到陸生的典型物種[1]。苔蘚植物對環(huán)境有較強的適應(yīng)能力，分布生態(tài)環(huán)境較為廣泛，全世界約有苔蘚植物189科1284屬22175種，中國已報道發(fā)現(xiàn)150科591屬3021種，是世界上苔蘚植物多樣性程度最高的國家之一[2]。研究表明苔蘚植物中廣泛定殖有內(nèi)生菌，作為苔蘚適應(yīng)陸生環(huán)境的一個重要過渡類型，內(nèi)生菌在苔蘚植物的環(huán)境適應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，能夠顯著提升對各種生物和非生物脅迫的抗性[3-4]。

有關(guān)苔蘚植物內(nèi)生菌的研究多聚焦于極端環(huán)境，如沙漠和極地等[5-6]，而對溫帶和亞熱帶雨林等非極端環(huán)境苔蘚內(nèi)生菌的研究報道卻相對較少[7-8]。因此全面了解各種生態(tài)環(huán)境來源內(nèi)生真菌的多樣性組成及其次級代謝產(chǎn)物的生物活性，是苔蘚內(nèi)生真菌來源藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)研究的基礎(chǔ)。

井岡山國家級自然保護(hù)區(qū)位于江西省中南部的井岡山市，是以中亞熱帶濕潤常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)及其生物多樣性為主的自然保護(hù)區(qū)[9]。保護(hù)區(qū)內(nèi)峽谷瀑布眾多，并具有豐富的地表水徑流和地下水資源。獨特、優(yōu)越的自然地理條件為苔蘚植物的生長提供了豐富多變的環(huán)境?，F(xiàn)知共有苔蘚67科183屬418種8亞種6變種，其苔蘚植物種類繁多，生活型與群落類型豐富多樣，是井岡山自然保護(hù)區(qū)豐富的自然資源和生物多樣性的特色之一。因此，以該地區(qū)苔蘚來源內(nèi)生真菌為挖掘?qū)ο蟮目咕钚蕴烊划a(chǎn)物研究具有巨大的潛力。

本研究對井岡山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)4種苔蘚來源內(nèi)生真菌多樣性和次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘，研究結(jié)果不僅可以豐富不同生境苔蘚來源內(nèi)生真菌的多樣性，還可為特殊生境來源內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性及生物活性研究提供可靠的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

4種苔蘚樣品（直葉曲尾蘚Dicranum orthophylloides、小火蘚Schlotheimia pungens、中華細(xì)枝蘚Lindbergia sinensis和中華細(xì)指苔Kurzia sinensis）于2021年7月采集于江西省井岡山國家級自然保護(hù)區(qū)。每種苔蘚選擇5個采樣點，每個采樣點隨機(jī)采集苔蘚的光合作用部分和根部樣品，共得到100個樣本。樣品采集置于密封袋后4 °C冰箱保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，g/L）：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0，氯霉素0.1，去離子水1.0 L；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（RBC，g/L）：蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氫鉀1.0，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂20.0，1/3000孟加拉紅溶液 100.0 mL，氯霉素0.1，去離子水1.0 L。

菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基（2#，g/L）：甘露醇20.0，麥芽糖20.0，葡萄糖10.0，谷氨酸鈉10.0，KH2PO4 0.5，玉米漿1.0，酵母浸粉3.0，MgSO4·7H2O 0.3，去離子水1.0 L。

1.1.3 抗菌活性指示菌

枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，BNCC109047）、草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，BNCC359483）、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，BNCC134980）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335）、大腸埃希菌（Escherichia coli，BNCC336902）均購于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器

高壓蒸汽滅菌鍋（XFH-100CA，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；超凈工作臺（SN-CJ-2FD，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SN-SPX-350B，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；低溫冷卻液循環(huán)泵（DLSB-5/20，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；循環(huán)水真空泵（SHZ-DIII四氟型，上海力辰儀器科技有限公司）分析天平（FA224，上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離純化

每種苔蘚沖洗表面泥土后，依次經(jīng)過75%酒精漂洗3 min、無菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉溶液漂洗2 min、無菌水沖洗3次。加水充分研碎并吸取上清液，分別置于PDA和RBC培養(yǎng)基上于24 ℃恒溫孵育5～25 d，從中分離出具有不同形態(tài)的真菌菌落，將其重新接種至PDA培養(yǎng)基上再孵育培養(yǎng)5～7 d。根據(jù)在PDA平板上的菌落形態(tài)特征（依據(jù)單菌落形態(tài)表面特征、菌絲顏色、菌絲生長速率、產(chǎn)孢方式、孢子形態(tài)特征和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特點等），將其分為不同的形態(tài)類型，最終得到內(nèi)生真菌純菌株。

1.2.2 內(nèi)生真菌種屬鑒定

實驗采用ITS通用引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]：ITS1（5'-AGAA GTCGTAACAAGGTTTC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'）擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)[10-12]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖膠電泳檢測合格后，由北京睿博生物科技有限公司完成后續(xù)菌株測序工作。通過對其BLAST數(shù)據(jù)分析后，將鑒定出的菌株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的其他真菌序列進(jìn)行比較分析，并在ClustalW中進(jìn)行比對[13]。利用Godinho的標(biāo)準(zhǔn)來分析驗證GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST結(jié)果：對于覆蓋率和序列同一性大于98%，內(nèi)生真菌種屬被確定；對于覆蓋率和序列同一性為95%～97%確定到種，而覆蓋率和序列同一性小于95%，則暫定為新菌[14]。

1.2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)與抗菌活性測試

將內(nèi)生真菌繼代培養(yǎng)后接種至2#液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，參考文獻(xiàn)[15]中的菌株發(fā)酵條件和提取方法獲得粗提物。采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌活性篩選，以2 mg/mL氯霉素為陽性對照藥。制備含提取物紙片的方法參照文獻(xiàn)[15]，將藥敏紙片放置在指示菌瓊脂表面上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。通過測量抑菌圈直徑來評價其抗菌活性強弱?？咕钚栽u價標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于11.0 mm代表活性較弱；抑菌圈直徑11.0～15.0 mm代表中等活性；抑菌圈直徑15.0～

20.0 mm代表活性較強；抑菌圈直徑大于20.0 mm代表活性顯著。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物分離純化

菌株JW-15-2在2#培養(yǎng)基條件下實驗室靜置發(fā)酵30 d，菌體甲醇浸泡，超聲破碎；發(fā)酵液乙酸乙酯萃取，減壓蒸餾，合并獲得粗浸膏6.8 g。粗浸膏采用甲醇為流動相的葡萄糖凝膠LH-20進(jìn)行分離，所得6個組分進(jìn)行抗菌活性測定。其中組分3表現(xiàn)出較好的抗菌活性且化合物較為單一，進(jìn)一步利用正相硅膠柱（流動相為二氯甲烷：甲醇=10：1）其進(jìn)行純化，并采用ODS-C18半制備柱（YMC-Pack ODS-A， 10 mm×

250 mm， 5 μm， 4 mL/min），采用流動相：甲醇/水=55/45進(jìn)行制備，獲得化合物1（tR=18.0 min）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

內(nèi)生真菌的分離頻率（isolation rate， IR）和定殖率（colonization rate， CR）可以衡量苔蘚組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和組織塊受侵染的頻率，相對分離頻率（relative frequency，RF）則可以衡量苔蘚組織中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢度[16]，其分別按以下公式（1～3）計算得出。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生真菌種屬分析與鑒定

通過組織研磨分離法從井岡山地區(qū)來源苔蘚的各個樣品中獲得內(nèi)生真菌232株，對其歸類分析發(fā)現(xiàn)涵蓋子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)青霉屬和曲霉屬真菌為占比最高，分別為39.66%和6.47%（圖1）。

基因序列對比結(jié)果顯示部分菌株與數(shù)據(jù)庫最接近的種屬具有較高的相似度，初步推斷其中225株內(nèi)生真菌分別隸屬于13個目26個科38個屬（表1），其中7株內(nèi)生真菌因與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列覆蓋率和序列同一性小于95%，因而暫時不能確定其種屬歸類。

2.2 內(nèi)生真菌的分離頻率和定殖率

從井岡山地區(qū)來源的直葉曲尾蘚、小火蘚、中華細(xì)枝蘚和中華細(xì)指苔的100個樣本中分別得到內(nèi)生真菌72、46、60和54株，分離結(jié)果顯示其內(nèi)生真菌分離頻率在1.84～2.88之間，平均分離頻率為2.32（圖2）。其中直葉曲尾蘚內(nèi)生真菌的分離頻率最高為2.88，小火蘚內(nèi)生真菌的分離頻率最低為1.84。內(nèi)生真菌的定殖率在不同苔蘚種類間存在一定的差異性，其分布在95.65%～100%之間（圖3）。實驗結(jié)果顯示，不同種類苔蘚內(nèi)生真菌的分離率和定殖率趨勢一致，但存在各自的種群差異性，其中直葉曲尾蘚的分離率和定殖率都最高，小火蘚的分離率和定殖率最低。

2.3 內(nèi)生真菌的相對分離頻率

苔蘚樣品中優(yōu)勢菌屬為青霉屬，其相對頻率分別為39.66%。各種苔蘚植物中不僅內(nèi)生真菌的種類不同，其優(yōu)勢內(nèi)生真菌種群也存在差異。其中直葉曲尾蘚樣品中內(nèi)生真菌種類最多，有31種；小火蘚樣品中內(nèi)生真菌種類最好，僅有22種。中華細(xì)枝蘚和中華細(xì)指苔樣品中內(nèi)生真菌分別有26種和28種。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢霉屬（Cladosporium）、木霉屬（Trichoderma）是該地區(qū)苔蘚來源內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，其相對分離頻率分別為39.66%、6.47%、5.60%和4.74%（圖1）。由此可見，不同苔蘚的內(nèi)生真菌群落組成各不相同，且內(nèi)生真菌群落的多樣性因苔蘚種類差別而異。

2.4 內(nèi)生真菌的抗菌活性評價

將所有菌株采用真菌2號培養(yǎng)基靜置發(fā)酵30 d后，獲得232個代謝粗提物。在對其進(jìn)行5種鑒定菌的抗菌活性篩選后，發(fā)現(xiàn)50株內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的抗菌活性，綜合活性率為21.55%。其中部分菌株表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌顯示出顯著的抑制活性（表2），預(yù)示潛在的活性代謝產(chǎn)物研究價值。

2.5 內(nèi)生真菌代謝主產(chǎn)物分析

結(jié)合抗菌活性篩選與代謝產(chǎn)物分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)活性菌株JW-15-2（Penicillium sp.）具有較好的研究潛力，逐對其的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性追蹤分離純化研究，從中獲得了1個代謝主產(chǎn)物（化合物1），其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的已知化合物一致[17]，確定化合物1為苯二氮卓類生物堿circumdatin B（圖4）。

化合物1 ?淡黃色粉末；ESI-MS： m/z 388.3 [M+Na]+（C20H19N3O4Na）；UV（MeOH）λmax（log ε）230（3.15），270（3.23），320（3.68）nm；1H NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ： 7.83，7.65，7.59，6.41，5.74，5.71，4.54，3.63，2.03，1.97，1.76，1.23； 13C NMR（100 MHz， DMSO-d6）δ： 163.7，162.4，158.7，157.7，157.1，145.6，132.9，132.3，130.9，129.6，129.4，129.1，115.8，110.4， 95.6，58.4，55.5，46.7，26.6和23.7。

3 討論

3.1 內(nèi)生真菌的物種多樣性

井岡山國家級自然保護(hù)區(qū)氣候?qū)儆趤啛釒駶櫳降貧夂?，地表水和地下水資源非常豐富，水質(zhì)良好，森林土壤類型豐富，孕育著豐富的生物資源。苔蘚植物對水分、礦質(zhì)營養(yǎng)等特殊的體表吸收方式，利用孢子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播的能力和多樣化的營養(yǎng)繁殖方式，使其能廣泛地分布于保護(hù)區(qū)的絕大部分生境中，形成大片極具地域特色的苔蘚群落[9]。

有研究表明，許多苔蘚植物具有特殊的芳香氣味，且不易被微生物、昆蟲等侵蝕破壞，且其中的化學(xué)成分也表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性，比如植物生長調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗真菌和細(xì)胞毒活性等，這些現(xiàn)象表明苔蘚中存在著活性物質(zhì)來參與化學(xué)防

御[18]。由于苔蘚植物所形成的特殊內(nèi)部微環(huán)境，生活在其中的微生物迫于多種因素的壓力，同時經(jīng)過與宿主植物的長期協(xié)同進(jìn)化，可能存在獨特的生物合成代謝途徑，能夠產(chǎn)生擁有新穎結(jié)構(gòu)骨架的天然產(chǎn)物。內(nèi)、外生存環(huán)境的特殊性，極有可能造就井岡山自然保護(hù)區(qū)來源苔蘚內(nèi)生真菌異于普通生境下真菌的特殊基因簇及合成特殊化合物的能力，是抗生素類活性天然產(chǎn)物潛在的資源庫。

本研究從井岡山地區(qū)4種苔蘚中分離獲得232株苔蘚內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌的分離頻率分布在 1.84～2.88之間，與研究報道的熱帶和溫帶生態(tài)環(huán)境中的提燈蘚、地錢、鞭苔及合葉苔的內(nèi)生真菌分離頻率具有一定的相似度，但遠(yuǎn)高于極端生態(tài)環(huán)境苔蘚植物內(nèi)生真菌的分離頻率，如發(fā)現(xiàn)于極端干熱環(huán)境的白發(fā)蘚和角齒蘚內(nèi)生真菌分離頻率僅為0.15和0.21[6，19-20]。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果表明，苔蘚植物來源內(nèi)生真菌的豐富程度不僅與宿主植物種類密切相關(guān)，其所處的生態(tài)環(huán)境也是造成豐度差異的一個潛在因素，說明相對適宜的氣候溫度和營養(yǎng)環(huán)境能夠顯著提升苔蘚來源內(nèi)生微生物的數(shù)量和種群類型。與此同時，本研究中4種苔蘚植物內(nèi)生真菌的定殖率在95.65%～100%之間，也遠(yuǎn)高于極端低溫環(huán)境來源苔蘚植物內(nèi)生真菌8.7%～12.3%的定殖率[21]。由此表明，井岡山地區(qū)濕潤多雨的亞熱帶季風(fēng)氣候環(huán)境，造就了其苔蘚來源內(nèi)生真菌豐富的物種多樣性。

3.2 內(nèi)生真菌良好的生物活性和代謝潛力

近幾十年來，植物內(nèi)生真菌作為特殊生境來源的微生物受到越來越多的關(guān)注，已成為生物活性物質(zhì)重要的資源庫[22]。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌已經(jīng)進(jìn)化出適應(yīng)植物微環(huán)境的遺傳和代謝機(jī)制，這意味著該特殊生境的真菌具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型獨特的代謝產(chǎn)物的潛力[23]。本研究利用紙片擴(kuò)散法對井岡山地區(qū)苔蘚來源內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗菌生物活性進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)了50株具有抗菌活性的菌株，綜合活性率為21.55%。生物活性結(jié)果顯示，該來源的內(nèi)生真菌具有較好的研究潛力，是抗生素研發(fā)潛在的資源庫。

通過對活性菌株JW-15-2次級代謝產(chǎn)物研究獲得了苯二氮卓類生物堿類化合物1。苯二氮卓類藥物作為一類臨床使用廣泛的鎮(zhèn)靜類處方藥物，許多該類型的化合物已被全合成獲得，而大多數(shù)天然存在的苯二氮卓類藥物則主要來自于絲狀真菌，如青霉屬和曲霉屬真菌[24]?；衔?抗菌活性篩選發(fā)現(xiàn)其具有較弱的抑菌活性，但該類化合物具有復(fù)雜的生物合成途徑，后續(xù)利用基因調(diào)控策略（如OSMAC、表觀遺傳修飾等）激活活性菌株沉默的生物合成基因簇，可能能夠獲得結(jié)構(gòu)更為多樣的活性抗生素類天然產(chǎn)物。

綜上研究表明，井岡山地區(qū)來源苔蘚內(nèi)生真菌具有豐富的物種多樣性，表現(xiàn)出良好的抗菌活性，其潛力菌株為后續(xù)抗生素類藥物先導(dǎo)化合物的開發(fā)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

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