外殺菌作用研究陳玲霞 鄒雪寒 張曉璠 李曦 潘紅英

摘要：目的 頭孢他啶/阿維巴坦（CZA）是治療碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌（CRPA）的一種有效的替代抗生素，在臨床上被廣泛應(yīng)用，然而CZA耐藥CRPA菌株的出現(xiàn)使得治療銅綠假單胞菌感染的難度不斷增加。本研究旨在通過體外時間殺菌分析，探討多黏菌素（COL）對攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的CZA耐藥銅綠假單胞菌菌株的體外殺菌活性，為銅綠假單胞菌感染的臨床治療提供科學依據(jù)。方法 從浙江省的一家三甲醫(yī)院收集了CZA耐藥的銅綠假單胞菌菌株。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和全基因組測序篩選了攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的5株代表性銅綠假單胞菌菌株，包括攜帶blaKPC-2的PA4696、攜帶blaKPC-90的PA2207、攜帶blaKPC-33的PA1308、攜帶blaVIM的PA2070、攜帶blaIMP-45的PA6227。通過微量肉湯稀釋法確認了實驗菌株的抗生素敏感性。對COL敏感的菌株進行重復(fù)的時間殺菌實驗。結(jié)果 5株CRPA菌株均對CZA耐藥（MIC≥16/4 mg/L），對COL敏感（MIC≤2 mg/L）；

其中攜帶blaIMP-45的菌株P(guān)A6227表現(xiàn)出特殊的藥敏表型（ISMR），對亞胺培南（IPM）敏感（MIC=2 mg/L）而對美羅培南（MEM）（MIC=128 mg/L）等其他碳青霉烯類藥物耐藥。時間殺菌曲線顯示，5株CZA耐藥的銅綠假單胞菌菌株在前2～8 h被不同濃度的COL完全抑制，但隨后恢復(fù)生長。結(jié)論 COL對CZA耐藥的CRPA菌株具有體外殺菌活性，但不能單獨使用。不同類型的碳青霉烯耐藥基因會影響CZA的作用效果，但與COL的殺菌活性無關(guān)，攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的分離株均在不同時間恢復(fù)生長。在治療銅綠假單胞菌感染時，可以調(diào)整給藥間隔或藥物濃度，以維持COL的濃度，從而獲得更好的治療效果。同時應(yīng)注意具有ISMR這一特殊藥敏表型的CRPA在臨床上的出現(xiàn)，避免抗生素的不合理應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：多黏菌素；頭孢他啶/阿維巴坦；碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌；時間殺菌曲線

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Antibacterial activity of colistin against Pseudomonas aeruginosa isolates co-resistant to carbapenem and ceftazidime-avibactam in vitro

Chen Lingxia1， Zou Xuehan1， Zhang Xiaofan 2， Li Xi2， and Pan Hongying1

（1 Center for General Practice Medicine， Department of Infectious Diseases， Zhejiang Provincial People's Hospital， Affiliated People's Hospital， Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014; 2 Laboratory Medicine Center， Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial People's Hospital， Affiliated People's Hospital， Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014）

Abstract Objective Ceftazidime-avibactam （CZA） is an effective alternative antibiotic for the clinical treatment of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa （CRPA） strains. However， the emergence of CZA-resistant CRPA in clinics has increased the difficulty of treating P. aeruginosa infections. The objective of our study was to investigate the in vitro bactericidal activity of colistin （COL） against CZA-resistant P. aeruginosa isolates carrying different carbapenemase genes using time-kill analysis， which provided a scientific basis for the clinical treatment of P. aeruginosa infections. Methods CZA-resistant P. aeruginosa isolates were collected from a tertiary hospital in Zhejiang Province， China. Five representative P. aeruginosa isolates carrying carbapenemase genes， including P. aeruginosa PA 4696 carrying blaKPC-2， P. aeruginosa PA 2207 carrying blaKPC-90， P. aeruginosa PA 1308 carrying blaKPC-33， P. aeruginosa PA 2070 carrying blaVIM， P. aeruginosa and PA 6227 carrying blaIMP-45 were selected by polymerase chain reaction （PCR） and whole genome sequencing. Antibiotic susceptibility was confirmed by broth microdilution. Time-kill experiments were performed in duplicates for each isolate. Results All five isolates were resistant to CZA （MIC≥16/4 mg/L） and sensitive to COL （MIC≤2 mg/L）. And P. aeruginosa PA 6227， which carried blaIMP-45， showed a specific drug-sensitive phenotype （ISMR） and was sensitive to IPM （MIC=2 mg/L） but resistant to other carbapenems such as MEM （MIC=128 mg/L）. Time-killing curves showed that the five CZA-resistant P. aeruginosa isolates were completely inhibited for the first 2～8 hours at different concentrations of COL， but then resumed regrowth. Conclusion COL had in vitro bactericidal activity against CZA-resistant CRPA isolates but could not be used alone. The presence of different carbapenem resistance genes affected the efficacy of CZA， but was not related to the bactericidal activity of COL， and isolates carrying different carbapenem resistance genes all showed regeneration at different times. In the treatment of P. aeruginosa infections， the dosing interval or drug concentration can be adjusted to maintain the concentration of COL to achieve a better treatment effect. Attention should also be paid to the clinical presence of CRPA with this particular phenotype of ISMR to avoid the irrational application of antibiotics.

Key words Colistin; Ceftazidime-avibactam; Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa; Time-kill curves

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一種機會性病原體，與高發(fā)病率和死亡率有關(guān)[1]。2022年，歐洲疾病預(yù)防控制中心（European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC）表示，多重耐藥或廣泛耐藥（multidrug-resistant or extensively drug-resistant， MDR/XDR）PA占所有被測菌株的17.3%，且其耐藥性正在上升[2-3]。MDR/XDR-PA的日益出現(xiàn)已成為全球公共衛(wèi)生威脅。此外，PA基因組中的可變毒力因子和抗生素抗性導(dǎo)致多種復(fù)雜的耐藥機制，使常規(guī)療法可能無效[4-6]。MDR/XDR-PA感染的主要后果之一是難以選擇適當?shù)目股刂委煛?/p>

頭孢他啶/阿維巴坦（ceftazidime-avibactam，CZA）在大型監(jiān)測研究中對MDR/XDR-PA分離株表現(xiàn)出很高的體外活性[7]。它是廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦和第三代頭孢菌素頭孢他啶的組合，可通過與革蘭陰性桿菌的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）結(jié)合來抑制細胞壁合成[8]。它對產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamase，MBLs）的分離株無效，對產(chǎn)A類、C類和D類β-內(nèi)酰胺酶的分離株有效[9]。增強合理使用抗菌藥物抗碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（the enhancing rational antimicrobials against carbapenem-resistant P. aeruginosa，ERACE-PA）全球研究小組發(fā)現(xiàn)，CZA對大多數(shù)碳青霉烯類敏感和碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistant P. aeruginosa，CRPA）均具有活性，敏感率分別為91%和72%[10]。然而由于耐藥機制和表型的區(qū)域差異，已經(jīng)出現(xiàn)了對碳青霉烯和CZA共耐藥的PA分離株[11-12]，且CRPA對CZA的耐藥率已達到25.5%。產(chǎn)不同碳青霉烯酶CRPA的CZA耐藥率存在顯著差異，產(chǎn)KPC菌株的CZA耐藥率為35.7%，產(chǎn)NDM菌株的CZA耐藥率為97%[13]。由于CZA在臨床上使用時間并不久，關(guān)于CZA耐藥PA感染的替代療法的臨床研究很少。

隨著MDR/XDR-PA分離株的增多，多黏菌素（colistin，COL）在某些情況下仍然是治療多重耐藥革蘭陰性菌（Gram-negative bacterial，GNB）感染的最后一道防線[14]。自1959年以來，COL已被批準用于治療各種類型的感染，包括感染性腹瀉和尿路感染。目前，它仍被臨床用于治療由頑固性GNB引起的感染。COL在體內(nèi)外對重癥宿主中產(chǎn)碳青霉烯酶的XDR微生物均有效[15]，它通過破壞細菌的外膜和內(nèi)膜導(dǎo)致細胞死亡[16]，且對易感菌株具有快速的濃度依賴性殺菌作用[17]。

在本研究中，用時間殺菌曲線實驗研究不同濃度的COL對攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的CZA耐藥PA分離株的體外殺菌活性。COL是一種殺菌劑，具有腎毒性和神經(jīng)毒性，時間殺菌實驗提供了有關(guān)COL殺菌效果的信息，有助于調(diào)整重癥患者的治療劑量，為銅綠假單胞菌感染的臨床治療提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

所有菌株均收集自浙江省一家三甲醫(yī)院，保存于-80 ℃冰箱中。銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌株，購買于美國 Microbiologics公司。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

用于藥敏實驗的抗菌藥物包括亞胺培南（imipenem，IPM）、美羅培南（meropenem，MEM）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、頭孢吡肟（cefepime，F(xiàn)EP）、阿米卡星（amikacin，AK）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、CZA和COL，均購自美國MedChem Express公司；CAMHB培養(yǎng)基干粉、MHA培養(yǎng)基干粉購自美國賽默飛世爾科技公司；Mueller-Hinton（MH）瓊脂平板購自溫州康泰生物科技有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）相關(guān)試劑購自北京擎科生物科技公司；凝膠染色試劑（GelRed）購自南京諾維贊公司；藥敏紙片：colistin （0.016～256 mg/L），購自意大利利飛馳公司（LOT：012320020）；碳青霉烯酶檢測試劑盒：NG-Test CARBA 5購自上海復(fù)星診斷科技有限公司（LOT：W22010111）；碳青霉烯酶五型卡購自北京金山川科技發(fā)展有限公司（LOT：230429）。

1.3 儀器

通過VITEK MS質(zhì)譜儀（生物梅里埃公司Marcy l'Etoile，法國）對實驗菌株進行分析和鑒定；恒溫搖床為美國精騏公司大容量SYC-2105型水平搖床；WGZ-XT型細菌濁度儀購自杭州齊威公司；96孔微量稀釋板購自美國康寧公司；電泳儀為美國BIO RAD公司PowerPac型電泳儀。

2 方法

2.1 碳青霉烯類耐藥基因檢測

采用PCR法用特定引物檢測實驗菌株的碳青霉烯類耐藥基因型[18]（表1），同時采用膠體金免疫層析法檢測實驗菌株的碳青霉烯酶。PCR擴增參數(shù)如下：初始變性95 ℃ 10 min，36個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，最后72 ℃延伸6 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。PCR陽性產(chǎn)物測序委托杭州有康生物科技有限公司進行，二代測序委托杭州天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司完成，利用基因組流行病學中心的ResFinder 4.1查找抗生素耐藥基因（http：//www.genomicepidemiology.org/）。

2.2 抗菌藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法測試抗菌藥物敏感性。用無菌生理鹽水將過夜培養(yǎng)的菌株調(diào)整至1.5×108 CFU/mL，并稀釋20倍獲得最終接種菌液。取最終接種菌液10 μL接種到含抗生素（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 mg/L）100 μL的96孔微量肉湯稀釋板，于37 ℃孵育16～18 h后進行讀數(shù)，未出現(xiàn)細菌生長的最低濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）。本研究的實驗結(jié)果根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2022版進行解釋[19]。

2.3 時間殺菌曲線實驗

對所選菌株進行重復(fù)的COL時間殺菌曲線實驗[20]。根據(jù)菌株的MIC，將COL的濃度設(shè)定為1/4×MIC、1/2×MIC和1×MIC。將過夜培養(yǎng)的菌液1： 100稀釋到4 mL CAMHB肉湯中，并在37 ℃下進一步培養(yǎng)1 h以達到早期對數(shù)生長期（A600=0.2～0.4）。使用含4 mL CAMHB的10 mL無菌離心管，加入相應(yīng)的抗生素。培養(yǎng)物在3000 r/min下離心5 min并用生理鹽水稀釋，最終的細菌接種濃度約為1.5×108 CFU/mL。

取40 μL懸菌液接種至4 mL的含藥肉湯中，作為實驗組；取一管無菌CAMHB肉湯4 mL加入40 μL

1.5×108 CFU/mL的懸菌液，作為生長組（不含藥）；取一管無菌CAMHB肉湯4 mL作為空白對照。培養(yǎng)物在37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h（200 r/min）。隨后，分別在0、2、4、8和24 h取出培養(yǎng)物樣品，從每個管中取50 μL培養(yǎng)物，與450 μL生理鹽水混合進行連續(xù)十進制稀釋，以減少藥物殘留，取100 μL接種在MH瓊脂平板上，并在37 ℃下培養(yǎng)16～18 h。過夜培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)，計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30～300之間的平板，結(jié)果取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值，選取一個最佳的稀釋梯度，使用稀釋系數(shù)計算原始樣品中的細菌密度，原始菌液濃度=平均菌落個數(shù)×稀釋倍數(shù)×體積（CFU/mL）。使用Graphpad Prism 8.0.1繪制時間殺菌曲線。當細菌負荷降低到至少3log10 CFU/mL時，表示COL在該濃度下對測試細菌具有殺菌作用。

2.4 紙片擴散法

采用紙片擴散法對實驗菌株進行COL異質(zhì)性耐藥初篩，用無菌生理鹽水將培養(yǎng)過夜的菌株調(diào)整至0.5×

108 CFU/mL，此時菌懸液的濃度約為1.5×108 CFU/mL，采用KB法用無菌棉簽將菌懸液接種至MH瓊脂平板，貼上COL藥敏紙片，37 ℃孵育16～18 h，觀察抑菌圈內(nèi)有無菌落生長，抑菌圈內(nèi)有菌落生長則認為該菌株存在COL異質(zhì)性耐藥。

3 結(jié)果

3.1 碳青霉烯類抗生素耐藥基因

篩選出5株攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的銅綠假單胞菌（表2），其中PA2070來源未知，其他4株均來源于不同患者。菌株P(guān)A2207攜帶blaKPC-90，不表達碳青霉烯酶，KPC-90會賦予菌株CZA抗性，但不表達碳青霉烯酶，可能是由于oprD基因的表達而產(chǎn)生碳青霉烯耐藥性[12]。菌株P(guān)A6227碳青霉酶檢測為IMP陽性，但PCR檢測為陰性，二代測序發(fā)現(xiàn)該菌株攜blaIMP-45。菌株P(guān)A4696（blaKPC-2）、菌株P(guān)A1308（blaKPC-33）、菌株P(guān)A2070（blaVIM）、菌株P(guān)A2207（blaKPC-90）PCR擴增陽性產(chǎn)物測序片段見圖1。

3.2 抗菌藥敏感性

5株P(guān)A均為多重耐藥菌株，均對CZA耐藥，對COL（MIC≤2 mg/L）敏感（表3）。其中菌株P(guān)A6227對IPM的MIC為2 mg/L，對MEM的MIC為128 mg/L，表現(xiàn)出特殊的藥敏表型（ISMR），即對IPM敏感而對MEM等其他碳青霉烯類藥物耐藥。

3.3 時間殺菌曲線實驗

時間殺菌曲線顯示了不同濃度COL對菌株的作用趨勢，對5株CZA耐藥的PA分離株均進行了重復(fù)3次的時間殺菌曲線測定（圖2）。1×MIC、1/2×MIC下COL在前2～8 h內(nèi)對所有菌株都顯示出明顯的殺菌作用，但隨后都出現(xiàn)了再生長現(xiàn)象，除菌株P(guān)A1308在1×MIC濃度下24 h內(nèi)未出現(xiàn)再生長，其他菌株在1×MIC濃度COL下的生長速率均比生長對照組略低。1/4×MIC濃度的COL對于菌株P(guān)A4696、PA2207在前2 h內(nèi)僅顯示出抑菌作用，而在前4～8 h內(nèi)將菌株P(guān)A1308、PA6227和PA2070完全抑制后以更快的速度出現(xiàn)再生長。COL對于CZA耐藥PA分離株的殺傷作用具有濃度依賴性，1×MIC濃度下作用效果最好但大部分菌株仍會出現(xiàn)再生長現(xiàn)象，碳青霉烯耐藥基因的存在并未影響其作用效果。

3.4 異質(zhì)性耐藥

KB法觀察5株實驗菌株的抑菌圈大小，圈內(nèi)均無散在菌落生長（圖3），表明5株實驗菌株均不存在異質(zhì)性耐藥情況，均為COL敏感表型。

4 討論

PA對碳青霉烯類抗生素的耐藥性通常與其他抗菌藥物類別相關(guān)，本研究中的PA分離株均產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，包括3種A類β-內(nèi)酰胺酶（KPC-2、KPC-33、KPC-90）和兩種B類β-內(nèi)酰胺酶（VIM和IMP-45），藥敏結(jié)果顯示這些菌株均為多重耐藥，對頭孢菌素類（FEP、CAZ）、碳青霉烯類（IPM、MEM）等均耐藥。其中菌株P(guān)A6227表現(xiàn)出特殊的藥敏表型，對IPM敏感而對MEM等其他碳青霉烯類藥物耐藥（ISMR），通過二代測序發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)A6227攜帶blaIMP-45。IMP-45是IMP-9的氨基酸突變體（G214S），于2014年在北京的犬源性PA中首次報道，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)IMP-45的PA對MEM的耐藥性高于對IPM的耐藥性[21]。此外，另一項研究收集了17株攜帶blaIMP-45的MDR-PA，其中菌株GZ18-2a對IPM敏感（MIC=2 mg/L），對MEM耐藥（MIC=8 mg/L）[22]，與本研究結(jié)果相似。IPM作為碳青霉烯類的代表性藥物，ISMR導(dǎo)致IMP賦予菌株的碳青霉烯耐藥性檢測不到，因此具有這種特殊藥敏表型的菌株在臨床上容易被忽視。

本研究中攜帶blaKPC-33、blaKPC-90、blaVIM和blaIMP-45的分離株均表現(xiàn)出對CZA的高度抗性，不同類型的碳青霉烯耐藥基因會影響CZA的療效。據(jù)報道，KPC編碼基因突變等不同耐藥機制的發(fā)展都會威脅到CZA的療效[23-24]，如由野生型KPC-2點突變衍生的KPC-90和KPC-33，均使菌株對CZA產(chǎn)生抗性[12，25]。在CZA治療下，越來越多的KPC突變體出現(xiàn)。此外，CZA對產(chǎn)MBLs的分離株并不活躍，攜帶MBLs可能導(dǎo)致菌株對CZA產(chǎn)生高水平抗性[9，26]，這進一步限制了CRPA感染的治療選擇。在臨床治療MDR-PA感染時，應(yīng)注意分離株攜帶的碳青霉烯耐藥基因。

在時間殺菌曲線中，發(fā)現(xiàn)這些分離株在不同濃度的COL下2、4和8 h后恢復(fù)生長，這與之前的研究結(jié)果一致[27]。這可能是由于COL功能喪失或出現(xiàn)異質(zhì)性耐藥分離株造成的，目前關(guān)于PA對COL異質(zhì)性耐藥的報道較少，也有研究表明COL對異質(zhì)性耐藥PA的殺菌作用會減弱[28]，而在本研究中不存在PA對COL異質(zhì)性耐藥的情況。細菌再生可能表明抗生素治療的臨床失敗，所以單一使用COL處理存在局限性。已有研究證明，CZA、AK、氨曲南和COL的組合對MDR-PA分離株有效，包括對CZA耐藥分離株和流行的高?？寺≈闧27，29-30]，需要進一步的研究來評估這些可能性。此外，根據(jù)COL的藥動學和藥效學研究，COL的給藥方案應(yīng)適應(yīng)患者的腎功能，在臨床實踐中通常每8 h或每24 h給藥1次[31-33]。然而本研究在探究體外COL對攜帶blaKPC-2、blaKPC-90、blaKPC-33和 blaVIM的CZA耐藥PA分離株的殺菌作用時，提示應(yīng)適當縮短給藥間隔至每2或4 h一次，以避免細菌恢復(fù)生長。攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的分離株均在不同時間恢復(fù)生長，不同類型碳青霉烯耐藥基因會影響CZA的作用效果，但與COL的殺菌活性無關(guān)。

通過比較不同濃度COL的時間殺菌曲線，我們還發(fā)現(xiàn)1×MIC的COL對PA4696、PA2207、PA1308、PA2070具有最佳殺菌活性，1/2×MIC的對PA6227具有殺菌活性。先前的研究表明，低劑量不足以治療MDR/XDR-PA感染，較高劑量會導(dǎo)致腎毒性[34]。時間殺菌曲線提供了COL殺菌作用的信息，由于COL具有高度腎毒性，這可能有助于調(diào)整重癥患者的治療劑量。本研究選取的實驗菌株數(shù)量較少，且缺乏體內(nèi)實驗證據(jù)，這些模型的結(jié)果只能為臨床藥物使用提供參考，后續(xù)需要進一步的實驗來證實COL對攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的CZA耐藥CRPA菌株的殺菌作用。

5 結(jié)論

本研究證明COL在體外對CZA耐藥CRPA分離株具有殺菌活性，但不能單獨使用。不同類型的碳青霉烯耐藥基因會影響CZA的作用效果，但與COL的殺菌活性無關(guān)，攜帶不同碳青霉烯耐藥基因的分離株均在不同時間恢復(fù)生長。在COL治療CZA耐藥CRPA感染的臨床應(yīng)用中，可以調(diào)整給藥間隔或藥物濃度，以維持COL的血液濃度，從而使用更少的抗生素達到更好的治療效果。同時應(yīng)注意具有ISMR這一特殊藥敏表型的CRPA在臨床上的出現(xiàn)。

參 考 文 獻

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