鄧明銣 鐘萍 許靖 劉俊汝 熊星星 袁海成

［摘要］ 目的

探討生長激素促分泌受體1a（GHS-R1a）敲除對小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響。

方法

選取12只6月齡GHS-R1a-/-雄性小鼠設(shè)為GHS-R1a-/-組，12只同月齡野生型（WT）雄性小鼠設(shè)為WT組。采用高架十字迷宮（EPM）實(shí)驗(yàn)測試兩組小鼠的焦慮水平，采用組織免疫熒光技術(shù)檢測兩組小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測兩組小鼠下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子1（Iba1）、小膠質(zhì)細(xì)胞活化蛋白CD68和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（Trem2）基因的表達(dá)水平。

結(jié)果 兩組小鼠EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著差異（P>0.05）；組織免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著多于WT組小鼠（t=4.61，P<0.05）；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦Iba1和Trem2 mRNA表達(dá)水平顯著高于WT組小鼠（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA水平表達(dá)顯著低于WT組小鼠（t=3.79，P<0.05）。

結(jié)論

GHS-R1a基因敲除不影響小鼠的焦慮水平，但會(huì)導(dǎo)致小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加；GHS-R1a可能在抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及吞噬功能、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

［關(guān)鍵詞］ 受體，胃促生長素；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；鈣結(jié)合蛋白質(zhì)類；基因表達(dá)調(diào)控；下丘腦

［中圖分類號］ R392.11；R338.27；R394??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦抵御病原體入侵的重要防線，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）免疫中發(fā)揮著重要作用，其分布于整個(gè)大腦和脊髓中，約占大腦細(xì)胞總數(shù)的5%～20%[1]。生理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞通常呈現(xiàn)小胞體、高度分支的狀態(tài)，發(fā)揮監(jiān)測大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用[2]。除監(jiān)視功能之外，小膠質(zhì)細(xì)胞還能吞噬有害物質(zhì)以維持CNS正常功能及調(diào)節(jié)大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡[3]。生長激素促分泌受體1a（GHS-R1a）是一種由366個(gè)氨基酸殘基及7次跨膜結(jié)構(gòu)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]，尤其在下丘腦和垂體廣泛表達(dá)[5]。GHS-R1a受體通常定位于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上[6]，發(fā)揮相應(yīng)的生物活性作用。GHS-R1a受體除了影響機(jī)體生長發(fā)育、能量代謝，還參與調(diào)節(jié)人體學(xué)習(xí)記憶、食欲、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理過程，對多種疾病也具有重要影響[7]。研究顯示，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核不僅參與外周代謝調(diào)控，其自身還能作為杏仁核的下游“效應(yīng)器”調(diào)控焦慮相關(guān)行為[8]，但目前有關(guān)GHS-R1a是否參與調(diào)節(jié)下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞增殖過程未見報(bào)道，同時(shí)GHS-R1a參與調(diào)節(jié)焦慮發(fā)生的具體機(jī)制亦尚不明確。本研究利用GHS-R1a敲除（GHS-R1a-/-）小鼠檢測GHS-R1a對于小鼠焦慮水平和下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞及其相關(guān)因子表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料來源

GHS-R1a+/-小鼠購買于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子1（Iba1）一抗購自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，兔AF488二抗購買于美國Cell Signaling Technology公司，山羊血清、無酶水、RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于美國英杰生命技術(shù)有限公司，去RNA酶試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，SYBR Green熒光定量試劑盒購自日本寶生物工程有限公司，氯化鈉、氨基甲酸乙酯、蔗糖購自美國西格瑪奧德里奇公司，包埋劑購自北京普利萊公司，多聚甲醛購自天津瑞金公司。

1.2 小鼠的來源及分組

GHS-R1a+/-小鼠遺傳背景為C57BL6J，非同窩GHS-R1a+/-雌雄小鼠間交配繁殖，待小鼠出生1個(gè)月以后基因鑒定，保留GHS-R1a-/-小鼠及野生型（WT）小鼠，分別設(shè)為GHS-R1a-/-組和WT組，每組各12只。兩組小鼠在溫度（21±2）℃、濕度（50±10）%、12/12 h晝夜交替光照、可自由飲水與取食的環(huán)境下飼養(yǎng)至6月齡。所有小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前至少適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)境需保證光線適度、整潔無異味、安靜無噪音干擾，適應(yīng)期間每天將小鼠放置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中1 h左右。

1.3 高架十字迷宮（EPM）實(shí)驗(yàn)檢測小鼠焦慮水平

EPM由1個(gè)中心區(qū)、2個(gè)封閉臂、2個(gè)開放臂五部分組成，將兩組小鼠頭朝向開放臂放入中心區(qū)，攝像記錄5 min小鼠自由活動(dòng)過程。利用MATLAB 2018軟件分析并記錄小鼠在開放臂、封閉臂自由探索的時(shí)間及跑動(dòng)平均速度等參數(shù)，以此為據(jù)判斷小鼠焦慮水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 免疫熒光染色測定小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞分布密度

使用10%氨基甲酸乙酯麻醉各組小鼠后，固定于泡沫板上，切開小鼠胸腔，充分暴露心臟，將準(zhǔn)備好的注射器插入左心室，剪開右心房，推入50 mL生理鹽水，待從右心房流出的液體變澄清后拔出針頭。將小鼠開顱，完整取出腦組織，沿矢狀面切取一半腦組織置于裝有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，次日將溶液換為質(zhì)量濃度300 g/L的蔗糖溶液。待腦組織沉到EP管底后取出，用冰凍切片機(jī)將腦組織沿冠狀面40 μm厚切片，置于含有PBS緩沖液的24孔板中。將切片用PBS緩沖液清洗3次（每次10 min）后，使用封閉液常溫封閉1 h，再將Iba1一抗（1∶1 000）加入小鼠腦組織切片中，4 ℃下?lián)u床孵育過夜后再用PBS緩沖液清洗3次（每次10 min）后，加入兔AF488二抗（1∶500）室溫孵育1 h，PBS緩沖液清洗2次（每次10 min）后貼片，將含DAPI的封片液滴于載玻片，緩慢蓋上蓋玻片，于顯微鏡下拍照并保存。使用Image J軟件分析照片圖像從而得出小膠質(zhì)細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測小鼠下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子（Iba1）、CD68和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2（Trem2）mRNA表達(dá)水平

將1.4中剩余部分下丘腦組織置于1.5 mL的無酶離心管中，加入裂解液研磨至混懸液后，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液加入新無酶EP管中，并加入體積分?jǐn)?shù)0.7的乙醇溶液700 μL，渦旋振蕩后將液體加入分離柱，待洗脫蛋白質(zhì)及無機(jī)鹽后加入30 μL無酶水，將液體離心轉(zhuǎn)移至新無酶EP管中。用Nanodrop分光光度計(jì)測定RNA濃度后按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR Green熒光定量試劑盒說明書配制反應(yīng)體系后擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算Iba1、CD68及Trem2的相對表達(dá)水平。引物名稱及其序列見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 兩組小鼠焦慮水平比較

EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組及WT組小鼠開放臂探索時(shí)間占總時(shí)間之比分別為（9.53±3.47）%、（8.73±5.65）%，平均速度分別為（4.56±0.77）、（4.69±0.87）cm/s，兩組小鼠上述指標(biāo)比較無顯著差異（P>0.05）。

2.2 兩組小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞密度比較

組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組與WT組下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞密度分別為（10.71±3.25）%和（4.38±0.87）%，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞密度顯著高于WT組小鼠（t=4.61，P<0.05）。見圖1。

2.3 兩組小鼠下丘腦Iba1、CD68及Trem2 mRNA表達(dá)水平比較

qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠Iba1、CD68及Trem2 mRNA相對表達(dá)量分別為1.18±0.06、0.65±0.18、1.24±0.20，WT組小鼠上述指標(biāo)分別為1.01±0.04、1.43±0.47、0.92±0.16。GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦Iba1和Trem2 mRNA表達(dá)水平顯著高于WT組（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA表達(dá)水平顯著低于WT組（t=3.79，P<0.05）。

3 討? 論

GHS-R1a作為G蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員，是胃饑餓素ghrelin的功能性受體，具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、參與學(xué)習(xí)記憶等生物學(xué)功能[6，9]。研究顯示，ghrelin在下丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，在下丘腦注射ghrelin可引起小鼠短期內(nèi)的焦慮行為[10]，但目前GHS-R1a調(diào)節(jié)情緒的具體機(jī)制尚不明確。此外，作為腦組織中GHS-R1a含量最高的部位，下丘腦除了在控制機(jī)體進(jìn)食、新陳代謝和能量平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還參與了伴隨情感活動(dòng)而出現(xiàn)的機(jī)體自主性活動(dòng)、軀體活動(dòng)及內(nèi)分泌活動(dòng)，與情緒反應(yīng)有著密切關(guān)系[11]。研究顯示，在慢性壓力刺激下，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的簇狀放電也同時(shí)參與了焦慮與能量代謝的調(diào)控過程[12]。但本研究結(jié)果表明，GHS-R1a敲除對小鼠自發(fā)活動(dòng)及焦慮情緒無明顯影響。推測原因可能是由于焦慮的產(chǎn)生通常在短期實(shí)驗(yàn)中較易觀察，而本研究實(shí)驗(yàn)周期較長，小鼠對環(huán)境已經(jīng)適應(yīng)，因此小鼠的焦慮狀況不明顯。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS中最重要的組織特異性巨噬細(xì)胞，可動(dòng)態(tài)檢測腦組織環(huán)境變化中的病原體及危險(xiǎn)信號，保護(hù)正常細(xì)胞的生理功能[13]。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞還能與神經(jīng)元交互作用，在神經(jīng)元早期發(fā)育過程中修剪多余突觸，去除神經(jīng)元之間的多余連接[14]。當(dāng)CNS受到急性損傷時(shí)，發(fā)揮防御保護(hù)功能的小膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)分鐘內(nèi)被激活，然后增殖、遷移到病變部位[15]，從分支較多的形態(tài)變?yōu)閳A形或阿米巴樣形態(tài)[16]，同時(shí)釋放相關(guān)炎癥因子，使得自身進(jìn)一步被激活，吞噬能力增強(qiáng)。但是在阿爾茨海默?。ˋD）和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病過程中，慢性持續(xù)性炎癥會(huì)使小膠質(zhì)細(xì)胞被過度激活，造成機(jī)體正常組織受損[17-18]。研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元樹突棘的吞噬有助于消除由急性應(yīng)激引起的焦慮樣行為，但是目前對神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)機(jī)制及其在急性應(yīng)激所致焦慮的恢復(fù)中的作用機(jī)制仍未明確[8]。本研究中組織免疫熒光染色及qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果均顯示，下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量因GHSR-1a敲降而明顯上調(diào)，這可能與GHSR-1a缺失造成的小膠質(zhì)細(xì)胞重編程有關(guān)，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。

Trem2屬于免疫球蛋白超家族成員，為一種單次跨膜受體，在CNS中特異性表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面[19]，其配體包括陰離子、兩性離子、磷脂、糖脂、凋亡細(xì)胞、脂質(zhì)化顆粒和脂蛋白等[20-21]。研究顯示，Trem2缺乏與AD早期β-淀粉樣蛋白負(fù)荷的降低有關(guān)，Trem2在AD代謝穩(wěn)態(tài)當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用[22]。另有研究顯示，Trem2的缺失可降低小膠質(zhì)細(xì)胞對凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)菌的吞噬作用[23]。

Iba1是一種相對分子量為17 000的鈣結(jié)合蛋白，在CNS中特異表達(dá)，通常在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增加，是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。

CD68是一種相對分子質(zhì)量為110 000跨膜糖蛋白，主要在小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞溶酶體中表達(dá)，不僅能作為小膠質(zhì)細(xì)胞被激活的標(biāo)志，還在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)及預(yù)后中起重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示，GHS-R1a敲除可使Iba1、Trem2基因表達(dá)水平上調(diào)，CD68基因表達(dá)水平下調(diào)，表明GHS-R1a受體可能抑制小鼠下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。盡管GHS-R1a在CNS中廣泛分布，但是目前在小膠質(zhì)細(xì)胞中未檢測到其表達(dá)[25]。因此我們猜測GHS-R1a敲除可能通過影響神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，造成小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的上調(diào)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，GHS-R1a敲除對小鼠的自發(fā)焦慮水平無明顯影響，但能引起下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及Iba1、CD68及Trem2表達(dá)水平的變化，GHS-R1a可能在抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖及吞噬功能、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號20220701Ghs-R1aKO2620231120101）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)》條例進(jìn)行。

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