龔雪琳 鄒通 宋淼 劉呈楊 張清 孫鈺 邢士超

［摘要］ 目的

探討高尿酸血癥（HUA）對(duì)雌性大鼠生殖功能的影響及其機(jī)制。

方法 雌性Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組各6只。高尿酸組（HUA組）和高尿酸恢復(fù)組（HR組）大鼠每天灌胃50 mg/kg尿酸及腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸鉀，至第9周時(shí)，HR組大鼠改用等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃和腹腔注射，HUA組不變，再繼續(xù)處理7周；對(duì)照組（N組）大鼠給予相同體積的生理鹽水灌胃及腹腔注射，持續(xù)16周。第16周時(shí)，測(cè)量三組大鼠體質(zhì)量和子宮、卵巢質(zhì)量，并計(jì)算子宮、卵巢系數(shù)；蘇木精-伊紅染色法觀察3組大鼠子宮、卵巢組織的病理變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)3組大鼠血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）含量；使用陰道脫落細(xì)胞涂片法觀察3組大鼠動(dòng)情周期；采用比色法檢測(cè)3組大鼠子宮組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平；采用免疫熒光法檢測(cè)3組大鼠子宮組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的熒光強(qiáng)度。

結(jié)果 與N組大鼠相比，HUA組大鼠子宮系數(shù)降低、卵泡數(shù)量減少、子宮內(nèi)膜厚度變薄，動(dòng)情間期縮短，血清FSH水平增加，子宮組織中SOD、GSH水平降低，而MDA含量增加（F=7.80～111.40，t=3.95～12.37，P<0.05），子宮組織中TNF-α熒光強(qiáng)度增高；與HUA組大鼠相比，HR組卵泡數(shù)量顯著增多、子宮內(nèi)膜顯著變厚，血清中FSH水平增高，子宮組織中SOD、GSH水平顯著增高，而MDA水平顯著降低（t=3.40～11.56，P<0.05），子宮組織中TNF-α熒光強(qiáng)度降低。

結(jié)論 HUA可致雌性大鼠生殖功能下降，其可能機(jī)制與大鼠血清尿酸水平升高，致性激素分泌紊亂、機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 高尿酸血癥；動(dòng)情期；性腺甾類激素；細(xì)胞因子類；炎癥；氧化性應(yīng)激；女（雌）性；大鼠，Wistar

［中圖分類號(hào)］ R589.7；R711.5??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

尿酸是人體嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，次黃嘌呤和黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化下最終形成尿酸。尿酸主要產(chǎn)生于肝臟、腸道、肌肉、腎臟、血管內(nèi)皮等，其他部位也少量產(chǎn)生。約2/3的尿酸由腎臟排泄，其余1/3由腸道排泄或被腸道細(xì)菌吸收[1]。高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于尿酸產(chǎn)生增加或排泄減少而導(dǎo)致血清尿酸水平異常升高的一種代謝性疾病。研究表明，血液中尿酸水平與女性生殖健康間存在密切聯(lián)系，比如PCOS患者血液中尿酸水平及HUA患病率明顯高于非PCOS患者[2-3]。關(guān)于HUA對(duì)女性生殖功能的直接影響方面，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究旨在通過(guò)觀察HUA雌性大鼠動(dòng)情周期、血液中各性激素水平、子宮組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)及炎癥因子的表達(dá)情況，探究HUA對(duì)雌性大鼠生殖功能的影響，為HUA女性患者的生殖健康提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6周齡健康成年雌性Wistar大鼠18只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。尿酸、氧嗪酸鉀以及亞甲藍(lán)染色劑購(gòu)買于上海生工生物工程股份有限公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于上海愛萌優(yōu)寧生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所有限公司；兔抗鼠一抗、二抗抗體及蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及分組 18只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為高尿酸組（HUA組）、高尿酸恢復(fù)組（HR組）和對(duì)照組（N組），每組各6只。HUA組和HR組大鼠每天灌胃50 mg/kg尿酸及腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸鉀，至第9周時(shí)，HR組大鼠改用等體積生理鹽水分別進(jìn)行灌胃和腹腔注射，HUA組不變，再持續(xù)處理7周。N組大鼠給予相同體積的生理鹽水灌胃以及腹腔注射，共16周。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠每隔2 d測(cè)量一次體質(zhì)量，每2周內(nèi)眥采血0.2 mL，采血前大鼠先空腹6 h，采集的血液室溫靜置 2 h后，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，采用血清生化儀檢測(cè)大鼠血清當(dāng)中尿酸水平，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）及雌二醇（E2）的含量。

1.2.2 動(dòng)情周期觀察 各組大鼠均于每日8：00和20：00時(shí)，用生理鹽水濕潤(rùn)醫(yī)用棉簽后，伸入大鼠陰道中收集脫落的組織，制作細(xì)胞涂片，經(jīng)亞甲藍(lán)染色5 min后，置于普通光鏡下觀察，記錄涂片中白細(xì)胞和上皮細(xì)胞形態(tài)和各類型細(xì)胞比例，并根據(jù)文獻(xiàn)[4]中的標(biāo)準(zhǔn)判斷大鼠的動(dòng)情周期（動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期）。

1.2.3 子宮、卵巢系數(shù)計(jì)算 第16周時(shí)，各組大鼠經(jīng)異氟烷深度麻醉后處死，測(cè)量體質(zhì)量，完整剝離大鼠一側(cè)的子宮、卵巢，吸除表面水分后測(cè)量子宮、卵巢的質(zhì)量，計(jì)算子宮、卵巢系數(shù)。

1.2.4 HE染色及觀察 分別取各組大鼠的一側(cè)子宮和卵巢組織，依次行固定、脫水、透明、石蠟包埋處理后，制作成石蠟切片。每組各取1/2的子宮和卵巢組織切片行HE染色，以中性樹膠封片后，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。其余組織切片備用。

1.2.5 大鼠子宮組織中MDA、SOD及GSH水平的測(cè)定 分別稱取各組大鼠的子宮組織100 mg，放入冷凍研磨儀中加入生理鹽水制備10%組織勻漿，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液，按照MDA、SOD、GSH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求的操作步驟，檢測(cè)子宮組織中MDA、SOD及GSH的水平。

1.2.6 免疫熒光染色 取各組大鼠剩余的子宮、卵巢組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、封閉后，與稀釋一抗4 ℃孵育過(guò)夜；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次，室溫20 ℃下與二抗（1%牛血清白蛋白）避光孵育1 h，PBS避光洗滌3次，用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片后，在全自動(dòng)正置熒光顯微鏡下觀察子宮組織中TNF-α熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并制圖。各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的各項(xiàng)計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)? 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和血清中尿酸水平比較

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，在干預(yù)處理的16周內(nèi)，各組大鼠間體質(zhì)量比較差異無(wú)顯著性（P>0.05），見圖1A。三組大鼠的血清中尿酸檢測(cè)結(jié)果顯示，時(shí)間、組別、時(shí)間與組別的交互作用對(duì)血清中尿酸水平均有明顯影響（F時(shí)間=112.20，F(xiàn)組別=14.82，F(xiàn)時(shí)間*組別=47.18，P<0.05）；其中，N組大鼠血清中尿酸水平隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著性差異（P>0.05）；HUA組大鼠血清中尿酸水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)（F=8.17～12.33，P<0.05）；HR組大鼠8周前血清中尿酸水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)（F=6.48～7.24，P<0.05），第10周較第8周顯著降低（F=23.68，P<0.05），第10周后隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯差異（P>0.05）；HUA組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平均明顯高于N組大鼠（F=23.78～142.80，P<0.05）；前8周，HR組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平均顯著性高于N組（F=27.62～62.31，P<0.05），與HUA組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），在后8周，HR組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平明顯低于HUA組（F=33.41～131.75，P<0.05），與N組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。見圖1B。

2.2 各組大鼠子宮、卵巢系數(shù)比較

第16周時(shí)，N組、HUA組、HR組大鼠子宮系數(shù)分別為0.23±0.02、0.17±0.02、0.19±0.02，各組大鼠比較差異有顯著性（F=10.98，P<0.05），其中與N組相比，HUA組子宮系數(shù)明顯降低（t=4.78，P<0.05），HR組與N組、HUA組相比均無(wú)明顯差異（P>0.05）。N組、HUA組、HR組大鼠卵巢系數(shù)分別為0.02±0.02、0.02±0.01、0.02±0.01，各組間比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.3 各組大鼠卵泡數(shù)量及子宮內(nèi)膜厚度比較

第16周時(shí)，HUA組大鼠的卵泡數(shù)量與N組相比明顯減少，HR組與HUA組相比明顯增多，與N組相比明顯減少；第16周時(shí)， HUA組大鼠的子宮內(nèi)膜厚度與N組相比明顯變薄，HR組與HUA組相比明顯增厚，與N組相比無(wú)明顯差異。見圖2。

2.4 各組大鼠血清中性激素水平比較

第16周時(shí)，三組大鼠血清中GnRH、LH、E2水平比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）；三組大鼠血清中FSH水平整體比較差異具有顯著意義（F=24.47，P<0.05），三組間兩兩比較差異均具有顯著性（t=3.95～10.12，P<0.05）。見表1。

2.5 各組大鼠動(dòng)情周期比較

第16周時(shí)，三組大鼠的動(dòng)情前期、動(dòng)情期和動(dòng)情后期比較差異無(wú)顯著性（P>0.05），動(dòng)情間期比較差異有顯著性（F=7.80，P<0.05），其中HUA組大鼠的動(dòng)情間期比N組大鼠顯著縮短（t=4.95，P<0.05），HR組與N組、HR組與HUA組比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。見表2。

2.6 各組大鼠子宮組織中SOD、GSH和MDA水平比較

第16周時(shí)，三組大鼠子宮組織中SOD、GSH和MDA水平比較差異均有顯著意義（F=8.94～111.40，P<0.05）；其中HUA組與另外兩組比較，上述三個(gè)指標(biāo)均有顯著差異（t=3.40～12.37，P<0.05）；HR組大鼠與N組上述三個(gè)指標(biāo)比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。見表3。

2.7 三組大鼠子宮組織中TNF-α熒光強(qiáng)度比較

第16周時(shí)，HUA組大鼠子宮組織中TNF-α熒光強(qiáng)度較N組和HR組明顯增強(qiáng)，HR組與N組比較無(wú)明顯差異。見圖3。

3 討? 論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，我國(guó)人群中HUA和痛風(fēng)的患病率逐年上升，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5]。既往有研究表明，HUA患病率在患有妊娠期高血壓的孕婦中高發(fā)[6]，并且患有子癇前期的孕婦常常同時(shí)伴有HUA[7]。血液中高尿酸水平還可通過(guò)促進(jìn)炎癥、氧化應(yīng)激來(lái)影響母體胎盤發(fā)育和功能，以及通過(guò)引發(fā)內(nèi)皮功能障礙來(lái)影響母體血管健康[8]。

本研究在設(shè)立HUA組大鼠的基礎(chǔ)上，還設(shè)立了HR組大鼠，通過(guò)觀察HR組大鼠血清尿酸水平恢復(fù)至正常水平后，與N組及HUA組大鼠相比，各待測(cè)指標(biāo)是否得以恢復(fù)，由此進(jìn)一步明確血液中高尿酸水平對(duì)于生殖功能的影響。結(jié)果顯示，在干預(yù)處理的16周內(nèi)，三組大鼠體質(zhì)量比較無(wú)明顯差異，各組大鼠生長(zhǎng)狀況均良好；HUA組大鼠血液中尿酸水平隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯升高趨勢(shì)；HR組從第9周開始，只灌胃等體積生理鹽水，大鼠因體內(nèi)尿酸酶的作用，第10周血液中尿酸水平恢復(fù)至正常水平，與N組比較無(wú)顯著差異。器官系數(shù)能在一定程度上反應(yīng)器官生長(zhǎng)發(fā)育情況，本研究中HUA組大鼠子宮系數(shù)較N組明顯降低，子宮組織HE染色結(jié)果也提示，HUA組大鼠較N組子宮內(nèi)膜變薄，當(dāng)血液中尿酸水平恢復(fù)至正常水平后，HR組大鼠子宮內(nèi)膜厚度出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)。研究表明，小鼠子宮內(nèi)膜過(guò)薄會(huì)導(dǎo)致受精卵無(wú)法良好著床，無(wú)法維持正常妊娠[9]。因此，本研究結(jié)果提示HUA會(huì)引發(fā)大鼠子宮內(nèi)膜萎縮或其他退行性變，進(jìn)一步影響受精卵著床。

本研究對(duì)大鼠卵巢組織切片進(jìn)行HE染色，觀察結(jié)果顯示，HUA組大鼠較N組正常卵泡數(shù)量顯著減少，而當(dāng)血液中尿酸水平恢復(fù)至正常水平后，HR組大鼠卵泡數(shù)量得以恢復(fù)，提示HUA可導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備能力降低。有研究顯示，雌性大鼠卵巢的生殖功能與分泌功能可影響大鼠動(dòng)情周期[10]。本研究又進(jìn)一步觀察各組大鼠的陰道涂片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HUA大鼠較N組動(dòng)情周期出現(xiàn)紊亂，提示HUA會(huì)引發(fā)大鼠出現(xiàn)排卵異常。

血液中高尿酸水平除了對(duì)子宮、卵巢器質(zhì)性的影響外，性激素在血液尿酸的調(diào)節(jié)中也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)前的健康女性血液尿酸水平在月經(jīng)周期中存在顯著差異，卵泡期血液中尿酸水平最高，黃體期血液中尿酸水平下降[11]；同時(shí)，血液中E2與尿酸水平呈負(fù)相關(guān)[11-12]。然而，本研究結(jié)果顯示，HUA組大鼠血液中E2水平較N組無(wú)顯著差異。研究顯示，痛風(fēng)女性的血液中FSH水平與尿酸水平呈正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，HUA組大鼠血液中FSH水平較N組明顯增高，而當(dāng)血液中尿酸水平恢復(fù)至正常水平后，HR組血液中FSH水平較HUA組進(jìn)一步增高。這表明血液中FSH水平的增高與血液中高尿酸水平的關(guān)聯(lián)不是獨(dú)立的。因此，關(guān)于血液中FSH與尿酸之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究，以澄清與臨床發(fā)現(xiàn)不一致的情況。

在生理?xiàng)l件下，血液中尿酸是機(jī)體重要的抗氧化劑，可以清除體內(nèi)的氧自由基，防止血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[13]；但當(dāng)血液中尿酸水平過(guò)高時(shí)，反而會(huì)促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成機(jī)體損傷[14]。氧化應(yīng)激可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致某些炎癥因子基因的差異表達(dá)[15]。研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)是誘發(fā)子宮疾病的機(jī)制之一[16]，可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥及相關(guān)腫瘤的發(fā)展[17]。本研究結(jié)果顯示，HUA組大鼠較N組子宮組織中SOD、GSH水平顯著性降低，MDA水平增高，炎癥因子TNF-α表達(dá)增加；而血液中尿酸水平恢復(fù)至正常水平后，HR組大鼠子宮組織中以上指標(biāo)均得以逆轉(zhuǎn)，提示血液中高尿酸水平導(dǎo)致了大鼠子宮出現(xiàn)氧化應(yīng)激，并促進(jìn)了炎癥發(fā)生，進(jìn)而降低大鼠的生殖功能。

綜上所述，HUA可導(dǎo)致雌性大鼠子宮內(nèi)膜變薄、卵泡數(shù)量減少，動(dòng)情周期及性激素水平出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而影響排卵和受精卵著床；血液中高尿酸水平還會(huì)導(dǎo)致子宮出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，誘導(dǎo)子宮出現(xiàn)炎癥，從而降低大鼠生殖功能。本研究為后續(xù)的臨床研究提供了一定的數(shù)據(jù)參考。但關(guān)于血液中高尿酸水平導(dǎo)致氧化應(yīng)激及炎癥因子產(chǎn)生之間的具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入探討。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)AHQU-MAL20220520）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的條例進(jìn)行。

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