吳穎穎 文小玲 夏玉芳 于嘯 婁艷輝

［摘要］ 目的

探討miR-181c-5p對卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（OCS-LCs）腫瘤血管生成擬態(tài)（VM）的作用及其機(jī)制。

方法 采用無血清懸浮培養(yǎng)法將人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3細(xì)胞誘導(dǎo)形成OCS-LCs。將OVCAR3細(xì)胞分為A～C組，各組分別轉(zhuǎn)染NC-miR-181c-5p、siRNA-miR-181c-5p和pRNA-miR-181c-5p。通過成球?qū)嶒炘u估A～C組細(xì)胞成球能力。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測A～C組細(xì)胞miR-181c-5p的相對表達(dá)量，采用Western blot實驗檢測A～C組細(xì)胞Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)量。采用CCK-8實驗檢測A～C組細(xì)胞的活性，采用三維立體培養(yǎng)實驗檢測A～C組的血管形成率。

結(jié)果 OVCAR3細(xì)胞成功被誘導(dǎo)形成OCS-LCs。RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，B組細(xì)胞的miR-181c-5p相對表達(dá)量顯著低于A組，C組高于A組（t=2.25、8.68，P<0.05）。成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，B組與A組、A組與C組相比，細(xì)胞的成球周期顯著縮短，最大的細(xì)胞球直徑顯著增大，成球率顯著增加（t=5.56～33.66，P<0.05）。Western blot實驗結(jié)果表明，B組與A組、A組與C組相比，Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)量顯著升高（t=4.51～56.15，P<0.05）。CCK-8實驗結(jié)果顯示，B組的細(xì)胞活性高于A組，C組低于A組（F=97.70～281.80，P<0.05）。三維立體培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，B組與A組、A組與C組相比較，血管形成率顯著性提高（t=3.70、18.67，P<0.05）。

結(jié)論 miR-181c-5p可能通過降低細(xì)胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)，從而抑制OCS-LCs的VM形成。

［關(guān)鍵詞］ 卵巢腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；微RNAs；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；血管內(nèi)皮生長因子類；新生血管化，病理性；體外培養(yǎng)技術(shù)

［中圖分類號］ R737.31;R364.3??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

腫瘤血管生成擬態(tài)（VM）是一種依賴于腫瘤細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤血管生成形式，能促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[1-2]，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是VM形成的重要標(biāo)志物[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控VM方面發(fā)揮著非常重要的作用，參與介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞中HIF-1α以及VEGF等多種血管生成因子的表達(dá)[4]。MiR-181屬于miRNA中的一員，包括miR-181a-5p以及miR-181c-5p。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織和輸卵管組織，且具有抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181家族中的另一重要成員miR-181c-5p，在卵巢癌組織中表達(dá)水平也低于正常卵巢組織[6]，但miR-181c-5p是否具有抑制卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（OCS-LCs）增殖的作用尚不清楚，其是否可以通過介導(dǎo)OCS-LCs中HIF-1α、VEGF的表達(dá)調(diào)節(jié)VM形成也未見相關(guān)報道。因此，本研究擬探究miR-181c-5p對OCS-LCs VM的作用及其機(jī)制，為卵巢癌的治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3細(xì)胞（美國模式培養(yǎng)物集存庫），胰島素（美國Sigma公司），表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，美國Peprotech公司），小干擾RNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），鼠抗人CD133（抗CD133-APC）流式抗體及同型鼠IgG抗體（美國Biolegend公司），兔源HIF-1α單克隆一抗（美國CST公司），Prime Script RT Reagent Kit試劑盒以及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司），兔源GAPDH單克隆一抗（武漢賽維爾生物科技有限公司），兔源VEGF單克隆一抗、兔源Oct-4多克隆一抗、兔源Nanog多克隆一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將OVCAR3細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素-鏈霉素雙抗溶液和體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適密度后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 無血清懸浮培養(yǎng)法誘導(dǎo)OCS-LCs形成 將處于對數(shù)生長期的OVCAR3細(xì)胞，以1×106個/L密度接種于超低吸附6孔板中，用無血清培養(yǎng)基（含有DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)0.04 BSA、5 g/L胰島素、0.02 g/L EGF、0.01 g/L bFGF）培養(yǎng)7～10 d，隔天換液一次，直至細(xì)胞生長成球形。當(dāng)細(xì)胞球直徑＞70 μm時，即為OCS-LCs。觀察并記錄OCS-LCs的成球周期、最大的細(xì)胞球直徑和成球率。成球周期為自O(shè)VCAR3細(xì)胞開始培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)直徑為70 μm的細(xì)胞球時的最短培養(yǎng)時間，成球率=直徑＞70 μm的細(xì)胞球數(shù)量/接種的OVCAR3細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.2.3 OCS-LCs鑒定 ①二次成球?qū)嶒灒喝≈睆剑?0 μm的細(xì)胞球，吹散成單細(xì)胞懸液以后，重新接種于超低吸附6孔板中，使用無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)7～14 d，觀察是否可二次成球。②貼壁再分化實驗：將吹散成單細(xì)胞的懸液培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)基中，24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況。③流式分析技術(shù)檢測細(xì)胞CD133陽性率：取處于對數(shù)生長期OVCAR3細(xì)胞和直徑＞70 μm的細(xì)胞球，分別置于1.5 mL的EP管中，再向其內(nèi)分別加入1 μg抗CD133-APC抗體，以IgG為同型對照，避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀檢測OVCAR3細(xì)胞和OCS-LCs的CD133陽性細(xì)胞數(shù)，并計算各自相應(yīng)的CD133陽性率。

1.2.4 細(xì)胞的分組和處理 將處于對數(shù)生長期的OVCAR3細(xì)胞分為A～C組，分別轉(zhuǎn)染NC-miR-181c-5p、siRNA-miR-181c-5p和pRNA-miR-181c-5p，于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 d，隔天換液一次。

1.2.5 細(xì)胞成球?qū)嶒?在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的21 d內(nèi)，記錄A～C組細(xì)胞的成球周期，測量各組最大的細(xì)胞球直徑，并計算成球率，以此評估各組細(xì)胞的成球能力。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測OCS-LCs中miR-181c-5p相對表達(dá)量 取培養(yǎng)21 d的各組細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，采用Prime Script RT Reagent Kit試劑盒以及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒，分別按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。引物序列分別為，U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，miR-181c-5p-F：5′-CGAACATTCAACGCTGTCG-3′，miR-1-81c-5p-R：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。以U6為內(nèi)參，采用2－△△CT法計算各組細(xì)胞當(dāng)中miR-181c-5p相對表達(dá)量。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡實驗（Western blot）檢測OCS-LCs中Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)量 取培養(yǎng)21 d的各組細(xì)胞，用RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞。加入5×loading buffer煮沸后變性處理，BCA法檢測蛋白濃度。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒制備SDS-PAGE凝膠，在凝膠小孔中加入10～20 μL各組細(xì)胞提取的蛋白樣品。調(diào)節(jié)電泳儀，先用80 V電泳30 min以后更改為110 V恒壓60 min分離細(xì)胞裂解物，280 mA轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，一抗4 ℃下孵育過夜。加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下緩慢搖動孵育2 h。最后使用化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑進(jìn)行免疫印跡顯色，在顯影儀下拍照，并使用Image J軟件對條帶進(jìn)行量化分析，計算Oct-4、Nanog、HIF-1α以及VEGF蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.8 CCK-8實驗檢測OCS-LCs的細(xì)胞活性 取A～C組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋成細(xì)胞密度為1×107個/L的細(xì)胞懸液，按1 000個/孔分別接種于96孔板。各組分別在培養(yǎng)第24、48、72、96小時時，加入CCK-8試劑，然后避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各組細(xì)胞吸光度值，并計算細(xì)胞活性。

1.2.9 三維立體培養(yǎng)實驗檢測OCS-LCs的血管形成率 將Matrigel基質(zhì)膠與DMEM混合液（1∶1）200 μL混合后均勻鋪于提前預(yù)冷的24孔板上，于培養(yǎng)箱中放置45 min，以促進(jìn)凝固。取A～C組處于對數(shù)生長期細(xì)胞，稀釋成細(xì)胞密度1×108個/L的細(xì)胞懸液，按照每孔1×104個細(xì)胞的數(shù)量分別接種于24孔板當(dāng)中。每隔2 h用倒置相差顯微鏡觀察VM的形成情況，并拍照，同時記錄血管形成數(shù)，計算血管形成率。血管形成率=血管形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；多組不同時間點的比較采用重復(fù)測量設(shè)計方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 OCS-LCs形成和鑒定結(jié)果

在將OVCAR3細(xì)胞誘導(dǎo)形成OCS-LCs過程中，4～7 d時OVCAR3細(xì)胞聚集形成細(xì)胞球，形態(tài)呈圓形串珠樣，8～10 d后細(xì)胞球持續(xù)增大，形狀逐漸呈規(guī)則球形，密度更加緊密。二次成球?qū)嶒烇@示，單細(xì)胞懸液在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時，能再次聚集形成細(xì)胞球，并克隆生長（圖1A）。在貼壁再分化實驗中，培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)基中的單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后可重新分化，并可貼壁生長（圖1B）。流式分析技術(shù)檢測結(jié)果顯示，OCS-LCs和OVCAR3細(xì)胞的CD133陽性率分別為（18.00±1.60）%、（7.10±1.10）%，兩者比較差異有顯著性（t=14.20，P<0.05）。

2.2 MiR-181c-5p RNA對OCS-LCs成球能力的影響

A～C組細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中均能夠繼續(xù)成球生長，成球周期分別為（13.00±0.58）、（8.30±0.33）、（17.00±0.58）d；最大的細(xì)胞球直徑平均值分別為（121.00±4.04）、（172.00±4.41）、（78.30±3.84）μm；成球率分別為（3.13±0.18）%、（9.03±0.19）%、（1.38±0.11）%。各組間上述三項指標(biāo)比較差異均有顯著性（F=72.57～621.90，P<0.05），同時各組間兩兩比較，上述三項指標(biāo)也均差異有顯著性（t=5.56～33.66，P<0.05）。

2.3 MiR-181c-5p對OCS-LCs中Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A～C組的細(xì)胞內(nèi)miR-181c-5p相對表達(dá)量依次為1.01±0.14、0.24±0.06、3.20±0.71，各組之間整體上比較差異具有顯著性（F=40.61，P<0.05），各組之間兩兩比較也均差異具有顯著性（t=2.25～8.68，P<0.05）。Western blot實驗的結(jié)果顯示，各組之間細(xì)胞內(nèi)Oct-4、Nanog、HIF-1α以及VEGF蛋白相對表達(dá)量比較差異具有顯著性（F=89.54～1 597.00，P<0.05），各組之間兩兩比較上述4個蛋白相對表達(dá)量差異也均具有顯著意義（t=4.51～56.15，P<0.05）。見表1、圖2。

2.4 MiR-181c-5p對OCS-LCs的細(xì)胞活性和血管形成率的影響

CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，時間、分組和時間與分組的交互作用對細(xì)胞活性均具有顯著性影響（F時間=553.80，F(xiàn)組別=543.30，F(xiàn)交互=38.57，P<0.05）；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長，每組細(xì)胞的細(xì)胞活性均逐漸增高，差異有顯著性（F組內(nèi)=118.80～281.80，P<0.05），在培養(yǎng)第24、48、72和96小時時，各組間兩兩比較，細(xì)胞活性均差異有顯著性（F組間=97.70～211.10，P<0.05）。見表2。三維立體培養(yǎng)實驗檢測結(jié)果顯示，A～C組細(xì)胞的血管形成率依次為（100.00±13.48）%、（385.30±35.66）%、（29.41±13.48）%，各組比較差異具有顯著性（F=195.40，P<0.05），同時各組間兩兩比較也均差異具有顯著性（t=3.70～18.67，P<0.05）。見圖3。

3 討? 論

腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是一類具有自我更新和多向分化能力的異質(zhì)性細(xì)胞，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細(xì)胞的化療抗性，參與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[7-8]。研究認(rèn)為OCS-LCs增加了卵巢癌浸潤和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，同時也是導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和化療耐藥的原因之一[8]。因此，深入研究OCS-LCs的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找卵巢癌治療的新靶點是目前卵巢癌臨床治療的研究熱點之一。本研究首先對誘導(dǎo)形成的懸浮細(xì)胞球進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，將細(xì)胞球重懸成單細(xì)胞后，在無血清培養(yǎng)基中可再次聚集成細(xì)胞球，在含血清培養(yǎng)基中則可以重新分化，并能夠貼壁生長。CD133是一種糖基化膜蛋白，是目前比較公認(rèn)的OCS-LCs表面標(biāo)志物之一，本研究的流式分析技術(shù)檢測結(jié)果顯示，OCS-LCs的CD133陽性率明顯高于OVCAR3細(xì)胞。以上三種驗證方法均表明，本研究成功誘導(dǎo)形成了OCS-LCs。

MiRNA能調(diào)節(jié)CSCs的發(fā)生發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌干細(xì)胞中，上調(diào)miR-526b-3p表達(dá)能抑制乳腺癌干細(xì)胞形成；用上調(diào)miR-526b-3p的乳腺癌干細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)裸鼠的移植瘤體積縮小、質(zhì)量減輕，說明移植瘤生長被抑制[10]。YU等[11]發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs中，上調(diào)miR-181c-5p能抑制SFRP1/Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)干細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，B組與A組、A組與C組相比，細(xì)胞內(nèi)miR-181c-5p相對表達(dá)量顯著減少，提示小干擾RNA轉(zhuǎn)染成功。成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與A組細(xì)胞相比，B組細(xì)胞的成球周期縮短、最大的細(xì)胞球直徑增大、成球率提高，C組細(xì)胞的成球周期延長、最大的細(xì)胞球直徑減小、成球率降低。Oct-4、Nanog是CSCs的轉(zhuǎn)錄因子，是識別CSCs的生物標(biāo)志物[12]。本研究結(jié)果顯示，B組細(xì)胞的Oct-4、Nanog蛋白的相對表達(dá)量高于A組，C組細(xì)胞的Oct-4、Nanog的蛋白相對表達(dá)量低于A組。上述結(jié)果提示miR-181c-5p可降低OVCAR3細(xì)胞的成球能力，抑制OCS-LCs的形成。研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌H460細(xì)胞中，上調(diào)miR-181c-5p能提高細(xì)胞活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[13]；上調(diào)宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa細(xì)胞內(nèi)miR-181c-5p表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到顯著抑制[14]。本研究結(jié)果顯示，A～C組細(xì)胞的細(xì)胞活性隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增高；在培養(yǎng)第24、48、72和96小時時，B組細(xì)胞的細(xì)胞活性均高于A組，C組細(xì)胞的細(xì)胞活性低于A組，提示miR-181c-5p可抑制OCS-LCs的增殖。

VM是腫瘤血管生成形式之一，通過腫瘤細(xì)胞變形和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用等方式模擬內(nèi)皮細(xì)胞，環(huán)繞形成管腔[15]。YI等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在體外模型和裸鼠移植瘤模型中，高水平的miR-374b-5p可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和VM的形成；上調(diào)miR-181c-5p表達(dá)可通過調(diào)節(jié)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成，促進(jìn)VM形成[11]，均提示miRNA參與了調(diào)控腫瘤VM的形成。本研究三維立體培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，與A組相比，B組的血管形成率顯著提高，C組的血管形成率顯著降低。HIF-1α和VEGF是影響VM形成的重要因子，其在腫瘤組織中的表達(dá)水平增高通常意味著VM形成增多[17-18]。由于腫瘤細(xì)胞生長迅速，腫瘤內(nèi)部血供不足，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧。當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺氧時，細(xì)胞中HIF-1α含量會明顯增高，進(jìn)而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和VM形成[19]，因此可以通過降低腫瘤細(xì)胞中HIF-1α的水平來抑制VM形成，延緩腫瘤進(jìn)展[20]，如Hsp90抑制劑AT-533就是通過阻斷HIF-1α/VEGF/VEGFR-2通路，抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長和VM的形成[21]。VEGF是一種與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)的血管生成啟動子。而通過降低卵巢癌細(xì)胞中的VEGF水平是卵巢癌治療的重要手段之一，具有良好的應(yīng)用前景[22]。最新研究發(fā)現(xiàn)，貝伐珠單抗能改善低表達(dá)VEGF-A165b（一種抗血管生成VEGF-A剪接變異體）的晚期卵巢癌患者的預(yù)后，而對高表達(dá)VEGF-A165b的晚期卵巢癌患者的預(yù)后沒有影響，這對指導(dǎo)晚期卵巢癌患者的治療決策具有重要臨床意義[23]。本研究結(jié)果顯示，B組與A組、A組與C組相比，OCS-LCs中HIF-1α和VEGF蛋白相對表達(dá)量增加，提示miR-181c-5p對OCS-LCs的VM形成具有抑制作用，可能是通過下調(diào)HIF-1α以及VEGF的表達(dá)實現(xiàn)的，但具體機(jī)制仍有待深入探究。

綜上所述，本研究成功誘導(dǎo)形成了OCS-LCs，上調(diào)OCS-LCs內(nèi)的miR-181c-5p表達(dá)，可顯著抑制其增殖和VM的形成，其機(jī)制可能是miR-181c-5p降低了細(xì)胞內(nèi)Oct-4、Nanog、HIF-1α和VEGF的蛋白水平。這為尋找卵巢癌的抗血管治療的新靶點提供了理論支持。

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