摘要：為明確雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程中微生物動態(tài)和多樣性，采用高通量測序技術(shù)，測定了雙孢蘑菇栽培基質(zhì)的二次發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化，并探究群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明：雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程4個發(fā)酵階段真菌分類單元（OTU）總數(shù)999個，包含10個門、26個綱、56個目、126個科、240個屬和403個種，其中嗜熱鏈球菌屬（12.72%～42.63%）、unclassifiedfSordariaceae（0.12%～31.63%）、念球菌屬（1.30%～17.32%）、曲霉屬（2.57%～8.98%）、青霉屬（2.88%～9.76%）和絲殼屬（0.89%～4.18%）等屬真菌占主導地位。發(fā)酵過程中，嗜熱鏈球菌屬、念球菌屬、曲霉屬、青霉屬等屬豐度在發(fā)酵的早、中期呈上升趨勢，后期下降；嗜熱鏈球菌屬和青霉屬真菌相對豐度于發(fā)酵中期達到高峰。氨氣排放與堆體溫度為發(fā)酵終點關(guān)鍵指標，冗余分析真菌群落與氨氣排放和堆體溫度的相關(guān)性表明，嗜熱鏈球菌屬、青霉屬和念球菌屬豐度與發(fā)酵溫度和氨氣排放呈正相關(guān)，其豐度越高，二次發(fā)酵周期短且發(fā)酵質(zhì)量優(yōu)。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇；栽培基質(zhì)；二次發(fā)酵；真菌多樣性

中圖分類號：S646文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）04?0017?08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.04.003

Change Analysis of Fungal Community Structure During the Secondary Fermentation Process ofAgaricusbisporus Cultivation Substrate

CHEN De-ju，CHEN Mei-chun，LAN Jiang-lin，WANG Jie-ping ＊，ZHANG Hai-feng

（Institute of Resources， Environment and Soil Fertilizer， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian350003， China）

Abstract： In order to clarify the microbial dynamics and diversity during the secondary fermentation of Agaricusbisporus cultivation substrate， the high-throughput sequencing technology was used to determine the changes of fungalcommunity structure during the secondary fermentation of Agaricus bisporus cultivation substrate， and to explore therelationship between community composition and environmental factors. The results showed that the total number offungal taxonomic units （OTUs） in the four fermentation stages of the secondary fermentation process of Agaricusbisporus cultivation substrate was 999， including 10 phyla， 26 classes， 56 orders， 126 families， 240 genera， and 403species. Among them， thespeciesof Streptococcusthermophilus （12.72%?42.63%）， unclassifiedfSortariaceae（0.12%?31.63%），Candida （1.30%?17.32%）， Aspergillus （2.57%?8.98%）， Penicillium （2.88%?9.76%）， and Kernia（0.89%?4.18%） occupied the dominant position. During the fermentation process， the abundance of fungi belonging togenera such as Streptococcus thermophilus， Candida， Aspergillus， and Penicillium increased at the early and middle stages of fermentation， and then decreased at the later stage. The relative abundance of Streptococcus thermophilus and Penicillium reached the peak in the middle stage of fermentation. Ammonia emission and pile temperature were the key indicators of fermentation endpoint. The correlation between fungal community and ammonia emission and piletemperaturewasanalyzedbyusingtheredundancyanalysis. Theresultsshowedthattheabundanceof Streptococcus thermophilus， Penicillium and Candida was positively correlated with the fermentation temperature and ammonia emission. The higher the abundance was， the shorter the secondary fermentation cycle was and the better the fermentation quality was.

Key words： Agaricusbisporus；Cultivation substrate ；Secondary fermentation；Fungal diversity

雙孢蘑菇Agaricusbisporus是我國重要的食用菌栽培品種，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)成分，備受人們喜愛[1]。雙孢蘑菇是一種擔子菌門真菌，屬于草腐菌，其栽培基質(zhì)需進行發(fā)酵腐熟后才可被菌絲吸收利用。生產(chǎn)上，常采用發(fā)酵后的麥秸或稻草和畜禽糞等農(nóng)業(yè)廢棄物作為雙孢蘑菇栽培基質(zhì)，這類農(nóng)業(yè)廢棄物經(jīng)過一次腐熟后需要進行二次高溫發(fā)酵后殺滅有害微生物后才能用于雙孢蘑菇的栽培[2?4]。

基質(zhì)二次發(fā)酵是一個自產(chǎn)熱的過程，通過多種微生物的協(xié)同作用來完成生物質(zhì)物料的降解，其中嗜熱真菌、嗜熱細菌和放線菌為優(yōu)勢菌群[5]，這些微生物交替作用于基質(zhì)，細菌在發(fā)酵初期通過破壞木質(zhì)纖維素的外部結(jié)構(gòu)，同時釋放熱量，使基質(zhì)料堆溫度升高；在發(fā)酵后期，真菌及放線菌使木質(zhì)纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分泌木質(zhì)纖維素降解酶，促進基質(zhì)料堆物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造適宜雙孢蘑菇生長的營養(yǎng)環(huán)境[6?7]，從而提高雙孢蘑菇的產(chǎn)量和降低病害。不同發(fā)酵基質(zhì)微生物組成不同，王鴻磊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在麥草雞糞培養(yǎng)料發(fā)酵過程中，細菌數(shù)量最多，高于放線菌和真菌；Sharma 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)料發(fā)酵過程中的中溫菌群包括真菌和單胞細菌，嗜熱菌群包含高豐度的放線菌。然而，雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中真菌群落變化研究較少，尤其是二次發(fā)酵過程中功能真菌研究。

雙孢蘑菇培栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化受發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件影響，明確栽培基質(zhì)發(fā)酵過程中真菌動態(tài)變化和多樣性，有利于指導發(fā)酵過程的補料，選擇性地培養(yǎng)出雙孢蘑菇生長的最佳微生態(tài)環(huán)境。本研究采用高通量測序技術(shù)，測定了雙孢蘑菇栽培基質(zhì)的二次發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)變化，探究群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系，為栽培基質(zhì)的二次發(fā)酵提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1基質(zhì)材料

雙孢蘑菇栽培基質(zhì)一次發(fā)酵料（菇渣︰牛糞=70︰30質(zhì)量比）由漳州角美鎮(zhèn)宏發(fā)公司提供。樣本采集時間為2021年3月。

1.2試劑與儀器

DNA 抽提試劑盒（E.Z.N.A.? Soil DNA Kit，美國 Omega 公司）；FastPfu Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DNA 凝膠回收純化試劑盒（PCRClean-UpKit ，中國逾華）； ABIGeneAmp?9700型 PCR 儀（美國 BIO-RAD 公司）； JY600C 電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；馳誠電氣 GC310復(fù)合式氣體檢測儀（許昌馳誠電氣有限公司）；Illumina PE300/PE250高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3試驗方法

1.3.1雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵制備過程雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵料初始溫度為45℃ ， 每天通風2～3次，每次30 min，發(fā)酵持續(xù)14 d，每天測定發(fā)酵溫度和氨氣濃度。于發(fā)酵開始（第0 d），早期（第3 d）、發(fā)酵中期（第8 d）及發(fā)酵末期（第14 d）分別取樣，每次取樣200 g ，樣品編號為 Day0、Day3、Day8及 Day14。

1.3.2栽培基質(zhì)樣本微生物組宏基因組測序

（1）樣本 DNA 抽提。利用 E.Z.N.A.? soil DNA

kit（Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）說明書進行微生物群落總基因組 DNA 抽提，使用 NanoDrop-2000（美國Thermo Scientific 公司）測定 DNA 濃度和純度。

（2）PCR 擴增、文庫構(gòu)建與測序。以提取的 DNA 為模板，對 ITS 基因（上游引物 ITS1F： CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；下游引物 ITS-2R： GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進行 PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系為20μL ，包括4μL5×Trans- StartFastPfu緩沖液，2μL dNTPs（2.5 mmol·L?1），0.8μL 上游引物（5μmol·L?1），0.8μL 下游引物（5μmol·L?1）， 0.4μL TransStartFastPfu DNA 聚合酶、10 ng 模板 DNA 。擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min ，27個循環(huán)（95℃變性30 s ，55℃退火30 s， 72℃延伸30 s），72℃穩(wěn)定延伸10 min ，最后4℃保存。PCR 產(chǎn)物回收、純化及定量分析后，進行文庫構(gòu)建，進一步利用 Illumina PE300/PE250平臺進行測序。

1.3.3真菌物種注釋、組成在Majorbio平臺上，將測序下機的序列（reads）進行聚類、轉(zhuǎn)化，與相應(yīng)物種數(shù)據(jù)庫比對，獲得樣本中真菌分類學和豐度信息，通過 Rank-abundance 曲線評估樣本中物種的豐度高低和分布的均勻性，利用 Pan-core 物種分析方法來評估所測的樣本量。采用 Alpha 多樣性分析，分析的指數(shù)包括 chao 、shannon、ace、simpson、coverage ，進而評估樣本中真菌群落的豐富度和多樣性等信息。采用VennDiagram軟件生成 Venn 圖，反映各樣品之間的 OTU 數(shù)；進行不同分類學水平上物種群落組成與豐度分析，根據(jù)物種或樣本間豐度的相似性進行聚類，結(jié)果呈現(xiàn)在群落 heatmap 上。

1.3.4真菌群落豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析利用冗余分析（RDA）方法研究基質(zhì)樣本真菌群落與環(huán)境因子（氨氣濃度和發(fā)酵溫度）的關(guān)系，結(jié)合相關(guān)性 Heatmap 表示真菌群落與環(huán)境因子變量的相關(guān)性，分類水平為屬水平，豐度前5的物種。

2結(jié)果與分析

2.1基質(zhì)二次發(fā)酵過程溫度和氨氣濃度的變化

溫度是決定微生物種群相對優(yōu)勢的一個重要因素[10]。由圖1可知，二次發(fā)酵過程基質(zhì)溫度變化幅度較小，范圍在55～63℃?；|(zhì)二次發(fā)酵釋放氨氣濃度整體上隨著發(fā)酵時間先上升后下降，變化范圍為19～76μg·L?1。發(fā)酵早期（0～4 d）氨氣濃度上升迅速（從38μg·L?1上升到72μg·L?1），發(fā)酵中期（5～10 d）氨氣濃度變化平穩(wěn)（72～74μg·L?1），發(fā)酵末期（11～14 d）氨氣濃度迅速下降至19μg·L?1。發(fā)酵早期堆體的氨氣釋放速度快，表明發(fā)酵早期堆體內(nèi)氮素被快速消化，以 NH3的形式釋放出來?；|(zhì)發(fā)酵過程中氮元素的轉(zhuǎn)化與脲酶密切相關(guān)，該酶會促進尿素酰胺鍵的水解，從而產(chǎn)生氨氣[11]。

2.2真菌群落多樣性分析

由表1可知，二次發(fā)酵基質(zhì)樣本16S rDNA 基因序列被檢測的覆蓋率 Coverage 指數(shù)均達到0.99以上，表明測序結(jié)果能夠很好反映樣品的真實情況[12]。隨著發(fā)酵時間延長，Chao 和 ACE 指數(shù)越來越大，表明發(fā)酵14 d 后顯著增加了樣本實際 OTU 數(shù)目，提高了真菌群落豐度。 Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)體現(xiàn)了群落分布多樣性和豐富度[13]。基質(zhì)二次發(fā)酵過程，真菌群落多樣性變化較大。與發(fā)酵初始相比，發(fā)酵末期 Shannon指數(shù)提高了，表明發(fā)酵后真菌群落多樣性變高。

2.3真菌物種組成變化

雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程4個發(fā)酵階段真菌分類單元（OTU）總數(shù)999個，包含10個門、26個綱、56個目、126個科、240個屬和403個種。由表2可知，不同發(fā)酵階段基質(zhì)中真菌分類單元（OTU）數(shù)量存在差異，基質(zhì)發(fā)酵初始階段的有429個 OUT ，發(fā)酵末期有583個 OUT ，表明雙孢蘑菇栽培基質(zhì)經(jīng)過二次發(fā)酵，微生物數(shù)目呈現(xiàn)上升趨勢。在門、綱、目、科、屬和種水平上，發(fā)酵末期的物種數(shù)目均高于發(fā)酵其他階段，表明發(fā)酵末期雙孢蘑菇栽培基質(zhì)中真菌種類最為豐富。

2.4真菌物種豐度變化

由表3可知，雙孢蘑菇栽培基質(zhì)發(fā)酵過程中豐度較高的真菌群落包括念球菌屬（1.30%～17.32%）、嗜熱鏈球菌屬（12.72%～42.63%）、曲霉屬（2.57%～8.98%）、青霉屬（2.88%～9.76%）、絲殼屬（0.89%～963ea51298eb74803cbc7fb7f64236524.18%）、unclassifiedf Sordariaceae（0.12%～31.63%）、鬼傘屬（0.05%～2.82%）、Apiotrichum（0.15%～2.11%）等屬真菌。熱圖直觀分析4個不同發(fā)酵時期的樣品中 Top 優(yōu)勢物種在不同樣本中分布情況，探索發(fā)酵過程中物種變化趨勢。結(jié)果顯示，4個不同發(fā)酵時期的樣品根據(jù)物種分布可聚為2類，一類為發(fā)酵初始和發(fā)酵早期，一類為發(fā)酵中期和發(fā)酵晚期（圖2）。整個發(fā)酵過程中，念球菌屬、嗜熱鏈球菌屬、曲霉屬、青霉屬等屬真菌豐度隨著發(fā)酵時間延長，豐度先上升后下降，嗜熱鏈球菌屬和青霉屬真菌豐度于發(fā)酵中期達到高峰。unclassifiedfSordariaceae真菌在發(fā)酵第3 d ，相對豐度急劇下降，表明發(fā)酵溫度上升后部分常溫真菌被殺滅。與發(fā)酵初始相比，發(fā)酵末期真菌菌落組成更為豐富，增加了小鏈粘孢屬、附球菌屬和鏈格孢屬等屬真菌。

2.5真菌群落豐度與環(huán)境因子相關(guān)性

由圖3可知，真菌群落中Hormographiella、耐干霉菌屬（Xeromyces）、Arachnomyces、unclasified_ f_Sporormiaceae豐度與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)（P<0.05），Thermomyces與發(fā)酵溫度呈負相關(guān)；Mal- branchea與氨氣濃度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

冗余分析（RDA）結(jié)果（圖4）顯示，氨氣濃度和溫度所代表的紅色箭頭連線都很長，二者長度一樣長，表明氨氣濃度和溫度這兩個環(huán)境因子與雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性高。氨氣濃度與發(fā)酵溫度之間夾角為銳角，表示二者之間呈正相關(guān)，發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵過程釋放的氨氣量就越大。進一步分析了真菌物種豐度與環(huán)境因子氨氣濃度和發(fā)酵溫度的關(guān)系，結(jié)果顯示嗜熱鏈球菌屬Mycothermus、青霉屬 Penicillium 、念球菌屬 Candida 豐度與2個環(huán)境因子的夾角均為銳角，說明這3類真菌的豐度與氨氣釋放和溫度環(huán)境因子呈正相關(guān)，嗜熱鏈球菌屬、青霉屬和念球菌屬豐度越大，發(fā)酵溫度越高；而 unclassifiedf Sordariaceae與環(huán)境因子的夾角為鈍角，表明發(fā)酵溫度越高，unclassifiedfSordariaceae豐度越低。

3討論與結(jié)論

本研究對雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程4個階段發(fā)酵溫度、氨氣濃度和真菌群落結(jié)構(gòu)進行了分析。二次發(fā)酵過程堆體溫度變化小，變化范圍為55～63℃ ， 表明高溫真菌代謝穩(wěn)定發(fā)酵質(zhì)量好；氨氣濃度在發(fā)酵中期釋放濃度達到高峰（76μg·L?1），發(fā)酵末期下降至19μg·L?1，氨氣的釋放量是發(fā)酵進展的重要的指示指標。利用高通量測序技術(shù)對4個發(fā)酵階段的真菌群落及多樣性差異進行分析，共檢測出10個門、26個綱、56個目、126個科、240個屬和403個種。真菌群落豐度較高的屬主要包括嗜熱鏈球菌屬（12.72%～42.63%）、unclassi- fiedfSordariaceae（0.12%～31.63%）、念球菌屬（1.30%～17.32%）、曲霉屬（2.57%～8.98%）、青霉屬（2.88%～9.76%）和絲殼屬（0.89%～4.18%）。嗜熱鏈球菌屬、念球菌屬、曲霉屬、青霉屬等屬真菌豐度隨著發(fā)酵進展先上升后下降，嗜熱鏈球菌屬和青霉屬真菌豐度于發(fā)酵中期達到高峰，unclassifiedfSordariaceae真菌在發(fā)酵后豐度快速下降；物種與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果顯示嗜熱鏈球菌屬、青霉屬和念球菌屬與發(fā)酵溫度和氨氣濃度呈正相關(guān)，表明嗜熱鏈球菌屬、念球菌屬、曲霉屬、青霉屬等為基質(zhì)二次發(fā)酵的功能微生物。

雙孢蘑菇栽培基質(zhì)發(fā)酵過程各類物質(zhì)在不同微生物的作用下發(fā)生降解。念球菌屬是一類對糖類和油脂有較高降解能力的菌屬[14]，其相對豐度于發(fā)酵初期達到高峰（17.32%），而后隨著發(fā)酵時間的延長相對豐度開始下降，到發(fā)酵末期念球菌屬相對豐度僅為1.30%，表明念球菌屬對基質(zhì)中糖類和油脂的降解主要發(fā)生于發(fā)酵初始階段。曲霉屬真菌與半纖維素的降解有關(guān)[15]，本研究中發(fā)酵初期和中期階段的曲霉屬豐度高于發(fā)酵末期，表明雙孢蘑菇栽培基質(zhì)中半纖維素的降解主要發(fā)生在發(fā)酵初期和中期。嗜熱鏈球菌屬被報道為牛糞堆肥發(fā)酵過程的典型菌屬，該屬會產(chǎn)生多種酶分解大分子物質(zhì)，為后期發(fā)酵提供能量[16]。Wang 等發(fā)現(xiàn)在為期60 d 的牛糞堆肥中嗜熱鏈球菌屬的相對豐度在第10d 和30 d 達到90%以上，為優(yōu)勢菌群[17]；葛勉慎等報道的牛糞好氧發(fā)酵腐熟階段嗜熱鏈球菌屬相對豐度達到80%以上，為優(yōu)勢菌群[11]。本研究中雙孢蘑菇栽培基質(zhì)是由牛糞和菇渣組成，發(fā)酵過程中嗜熱鏈球菌屬屬真菌豐度在發(fā)酵中期達到高峰（相對豐度42.63%）為優(yōu)勢菌群，與文獻報道相一致。雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程Apiotrichum相對豐度從初始的0.15%提高到2.11%（發(fā)酵中期），該菌屬中某些物種被認為具有同化乙酸、丙酸、丁酸積累微生物油脂及將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的多種碳源轉(zhuǎn)化為微生物油脂的能力[18]。本研究明確了雙孢蘑菇栽培基質(zhì)二次發(fā)酵過程中的優(yōu)勢功能真菌菌群，探究了優(yōu)勢菌與環(huán)境因子的關(guān)系，為栽培基質(zhì)二次發(fā)酵提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

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（責任編輯：柯文輝）