［摘要］目的分析識(shí)別癌癥中甲基化改變對(duì)增強(qiáng)子活性的影響。方法分別從人類增強(qiáng)子數(shù)據(jù)庫FANTOM5、甲基化DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫MeDReaders及分子特征數(shù)據(jù)庫MSigDB中獲取增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及分子通路數(shù)據(jù)等信息，識(shí)別受甲基化影響的活性增強(qiáng)子、正常與癌癥差異甲基化增強(qiáng)子和探針，并在CpG Island上注釋，根據(jù)增強(qiáng)子和基因的共表達(dá)情況進(jìn)一步識(shí)別增強(qiáng)子甲基化調(diào)控的靶基因并在泛癌模塊中進(jìn)行功能富集分析，最后進(jìn)行COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析與功能分析模式的識(shí)別。結(jié)果共識(shí)別出1 155個(gè)受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子，其對(duì)應(yīng)的探針大部分是在癌癥中表現(xiàn)差異甲基化的探針，少數(shù)在癌癥中受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子所對(duì)應(yīng)的探針沒有表現(xiàn)出差異甲基化。根據(jù)增強(qiáng)子和基因的共表達(dá)篩選出的靶基因和癌癥相關(guān)通路有關(guān)，這些基因還參與到癌癥相關(guān)（P53通路）、轉(zhuǎn)錄相關(guān)（transcript通路）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)以及代謝相關(guān)等重要功能的通路中；在膀胱尿路上皮癌中存在很多三元組合與生存相關(guān)，這些靶基因還分布在癌癥相關(guān)通路以及其他生命健康相關(guān)通路中。結(jié)論本研究系統(tǒng)分析了癌癥中受甲基化影響的增強(qiáng)子調(diào)控，識(shí)別了關(guān)鍵的增強(qiáng)子通過調(diào)控重要的靶基因參與癌癥發(fā)生發(fā)展的功能。

［關(guān)鍵詞］增強(qiáng)子；甲基化；轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；功能富集；生存分析

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.013

Analysis of the Effect of Methylation Alterations on Enhancer Activity in Cancer

Xie Yunxiao1，Ding Na2**

1College of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai200433;2College of Bioinformatics Science and Technology，Harbin Medical University，Harbin150081

**Corresponding author：Ding Na，email：dingnabioinfor@hrbmu.edu.cn

［Abstract］ObjectiveTo analyze and identify the impact of methylation changes on enhancer activity in cancer.MethodsObtain enhancers，transcription factor binding sites，and molecular pathway data from the human enhancer database FANTOM5，methylated DNA binding transcription factor database MeDReaders，and molecular feature database MSigDB，identify active enhancers affected by methylation，normal and cancer differential methylation enhancers，and probes，and annotate them on CpG Island，Based on the co expression of enhancers and genes，further identify the target genes for enhancer methylation regulation and perform functional enrichment analysis in the pan cancer module.Finally，perform COX proportional risk regression analysis and functional analysis pattern recognition.ResultsA total of 1 155 enhancers regulated by methylation were identified，with most of their corresponding probes exhibiting differential methylation in cancer，while a few probes corresponding to enhancers regulated by methylation in cancer did not exhibit differential methylation.The target genes screened based on the co expression of enhancers and genes are related to cancer related pathways，and these genes are also involved in important pathways related to cancer（P53 pathway），transcription（script pathway），signal transduction，and metabolism;There are many ternary combinations associated with survival in bladder urothelial carcinoma，and these target genes are also distributed in cancer related pathways and other life and health related pathways.ConclusionThis study systematically analyzed the enhancer regulation affected by methylation in cancer and identified key enhancers involved in the development of cancer by regulating important target genes.

［Key words］Enhancer;Methylation;Transcriptional regulatory networks;Functional enrichment;Survival analysis

癌癥是導(dǎo)致人口死亡的主要原因之一。有研究顯示，表觀遺傳改變可以通過改變抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而影響惡性腫瘤的發(fā)生［1-3］。表觀遺傳改變是一種可遺傳的性狀，通過干擾與DNA序列無關(guān)的基因表達(dá)而影響表型［4-5］。近幾十年，具有功能影響的表觀遺傳改變已經(jīng)成為人們關(guān)注的目標(biāo)。增強(qiáng)子是一類順式調(diào)控原件，是位于DNA序列上的一段遠(yuǎn)端調(diào)控子。它在轉(zhuǎn)錄因子和一些蛋白質(zhì)的介導(dǎo)下，通過與基因啟動(dòng)子結(jié)合而增強(qiáng)下游靶基因的表達(dá)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌中存在著增強(qiáng)子低甲基化的現(xiàn)象，使用增強(qiáng)子低甲基化抑制劑可顯著改善腫瘤的預(yù)后［7-8］。因此，本研究旨在分析增強(qiáng)子上發(fā)生的甲基化，識(shí)別癌癥中甲基化改變對(duì)增強(qiáng)子活性的影響，并分析活性改變后的增強(qiáng)子所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1一般資料

33種癌癥的增強(qiáng)子RNA（eRNA）、信使RNA（mRNA）表達(dá)數(shù)據(jù)和450K DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）中獲取。選擇之前研究中從人類增強(qiáng)子數(shù)據(jù)庫FANTOM5中篩選的15 808個(gè)功能穩(wěn)定的增強(qiáng)子，將這些hg19格式的增強(qiáng)子通過UCSC Genome Browser中的LiftOver工具轉(zhuǎn)換為hg38格式，共得到15 802個(gè)增強(qiáng)子［9］。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息從甲基化DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫MeDReaders中獲取，分子通路數(shù)據(jù)從分子特征數(shù)據(jù)庫MSigDB中獲?。?0］。

1.2方法

1.2.1識(shí)別受甲基化影響的活性增強(qiáng)子低表達(dá)的增強(qiáng)子提示其作用可能較為有限，因此在本研究中篩選出有活性的增強(qiáng)子進(jìn)行進(jìn)一步分析，即在超過50個(gè)樣本中選擇有表達(dá)（RPKMgt;0）的增強(qiáng)子。對(duì)于每個(gè)eRNA，根據(jù)其表達(dá)與否將樣本分成有表達(dá)組和無表達(dá)組。針對(duì)eRNA對(duì)應(yīng)的甲基化探針，對(duì)兩組樣本進(jìn)行雙樣本的Wilcox秩和檢驗(yàn)，觀察有表達(dá)組樣本的甲基化水平是否顯著低于無表達(dá)組的甲基化水平（檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0.01）。通過提取有表達(dá)組甲基化水平顯著低于無表達(dá)組甲基化水平的增強(qiáng)子-探針關(guān)系對(duì)，并計(jì)算eRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值（Reads Per Kilobase Million，RPKM）和對(duì)應(yīng)探針在DNA 450K甲基化β值的Spearman相關(guān)性（檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為Plt;0.01），進(jìn)而提取負(fù)相關(guān)的增強(qiáng)子-探針關(guān)系對(duì)，并結(jié)合雙樣本的Wilcox秩和檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)的結(jié)果，取兩者結(jié)果的交集，最終得到受甲基化影響的增強(qiáng)子。

1.2.2正常與癌癥差異甲基化增強(qiáng)子和探針的識(shí)別及其在CpG Island上的注釋通過統(tǒng)計(jì)在癌癥中高低甲基化的探針是否落在受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子區(qū)域的情況，衡量在癌癥中差異甲基化的探針和所對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)子是否受甲基化調(diào)控影響。將識(shí)別到的受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子所對(duì)應(yīng)的探針對(duì)CpG位點(diǎn)進(jìn)行注釋，注釋分為以下幾類：CpG Island，shores，shelves，opensea，other［11］。進(jìn)一步計(jì)算OR值，以探究受甲基化影響的增強(qiáng)子和探針在CpG Island上的偏好。

1.2.3識(shí)別增強(qiáng)子甲基化調(diào)控的靶基因從人類轉(zhuǎn)錄因子的注釋文件中提取轉(zhuǎn)錄因子-motif對(duì)應(yīng)關(guān)系對(duì)，并根據(jù)motif和探針在基因組上的位置關(guān)系得到motif-探針關(guān)系對(duì)。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子-motif關(guān)系對(duì)得到候選的增強(qiáng)子-轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系對(duì)，進(jìn)一步對(duì)增強(qiáng)子對(duì)應(yīng)的eRNA的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的mRNA的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

1.2.4泛癌模塊中的功能富集分析從分子特征數(shù)據(jù)庫MSigDB中下載50個(gè)癌癥相關(guān)的HallMark通路，運(yùn)用基因集變異分析計(jì)算50個(gè)HallMark通路的活性改變情況。并進(jìn)一步對(duì)泛癌相關(guān)模塊中各轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的mRNA的表達(dá)和通路的活性變化的相關(guān)性進(jìn)行分析。

在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上下游各取1 kb作為基因的啟動(dòng)子區(qū)后，計(jì)算在同一染色體上的所有受甲基化負(fù)調(diào)控影響的增強(qiáng)子和所有編碼蛋白質(zhì)的基因之間的距離，計(jì)算方式如下：①若增強(qiáng)子位于基因的上游，且同時(shí)位于DNA的+鏈，則增強(qiáng)子和基因的距離為增強(qiáng)子末端到啟動(dòng)子起始端的距離；②若增強(qiáng)子位于基因的下游，且同時(shí)位于DNA的+鏈，則增強(qiáng)子和基因的距離為啟動(dòng)子末端到增強(qiáng)子起始端的距離；③若增強(qiáng)子位于基因的上游，且同時(shí)位于DNA的-鏈，則增強(qiáng)子和基因的距離為啟動(dòng)子末端到增強(qiáng)子起始端的距離；④若增強(qiáng)子位于基因的下游，且同時(shí)位于DNA的-鏈，則增強(qiáng)子和基因的距離為增強(qiáng)子末端到啟動(dòng)子起始端的距離。過濾掉增強(qiáng)子到基因的距離小于1 kb和大于10 Mb的增強(qiáng)子-基因關(guān)系對(duì)，剩下的增強(qiáng)子-基因關(guān)系對(duì)為候選的增強(qiáng)子靶基因。最后，使用Spearman相關(guān)分析增強(qiáng)子對(duì)應(yīng)的eRNA表達(dá)和靶基因?qū)?yīng)的mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性，提取顯著正相關(guān)的關(guān)系對(duì)作為預(yù)測的增強(qiáng)子靶基因（FDRlt;0.05，Corgt;0.3）。

1.2.5COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析與功能分析模式識(shí)別從增強(qiáng)子-靶基因關(guān)系對(duì)及增強(qiáng)子-轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系對(duì)得到增強(qiáng)子-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元組，然后從人類癌癥圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫中下載患者的生存相關(guān)數(shù)據(jù)，對(duì)于每個(gè)增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，對(duì)其RNA的表達(dá)進(jìn)行單因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，eRNA和mRNA的表達(dá)進(jìn)行0-1標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過風(fēng)險(xiǎn)比例（Hazard ratio，HR）計(jì)算出每組增強(qiáng)子-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因三元集合的風(fēng)險(xiǎn)得分（Hazard score，HS）。

2結(jié)果

2.1識(shí)別癌癥中受甲基化調(diào)控的活性增強(qiáng)子

本研究中共識(shí)別了1 155個(gè)受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子均受到甲基化負(fù)調(diào)控。結(jié)果顯示：在癌癥中受甲基化影響的增強(qiáng)子在各種癌癥中的分布不均勻，在部分癌癥中存在大量受甲基化影響的增強(qiáng)子和探針；在乳腺癌（Breast cancer，BRCA）中，有360多個(gè)在癌癥中受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子和近400個(gè)相關(guān)探針；而在急性髓細(xì)胞樣白血病（Acute myeloid leukemia，AML）中，存在極少的受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子和相關(guān)探針，見圖1。受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子在不同癌癥中出現(xiàn)較大的差異，提示受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子具有癌癥特異性。

2.2受甲基化調(diào)控增強(qiáng)子對(duì)應(yīng)的探針在癌癥中的差異表達(dá)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子對(duì)應(yīng)的探針大部分是在癌癥中表現(xiàn)差異甲基化的探針，少數(shù)在癌癥中受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子所對(duì)應(yīng)的探針沒有表現(xiàn)出差異甲基化。但在個(gè)別癌癥中，如膽管癌（Cholangiocarcinoma，CHOL）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（Pheochromocytoma and paraganglioma，PCPG）和肉瘤（Sarcoma，SARC），則存在相反的情況，即大部分受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子所對(duì)應(yīng)的探針沒有表現(xiàn)出差異甲基化，見圖2。提示在大部分癌癥中，受甲基化調(diào)控的增強(qiáng)子可能與甲基化的改變有關(guān)。

2.3功能富集分析

根據(jù)增強(qiáng)子和基因的距離識(shí)別了候選的靶基因，并根據(jù)增強(qiáng)子和基因的共表達(dá)進(jìn)一步識(shí)別靶基因，見表1。對(duì)于識(shí)別到的靶基因進(jìn)行基因集功能富集分析，結(jié)果顯示，篩選出的靶基因和癌癥相關(guān)通路有關(guān)，此外這些基因還參與到人體維持生命健康的很多重要通路中。這些基因參與了癌癥相關(guān)（P53通路）、轉(zhuǎn)錄相關(guān)（transcript通路）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)以及代謝相關(guān)等重要功能的通路，見圖3。

2.4生存分析

每組三元組合根據(jù)HS的高低分組進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)每組轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子-靶基因是否與生存相關(guān)。結(jié)果提示，在BLCA中存在很多三元組合與生存相關(guān)，這些靶基因還分布在癌癥相關(guān)通路以及其他生命健康相關(guān)通路中。在BLCA中，植烷酰輔酶A2-羥化酶基因（Phytanoyl-CoA hydroxylase，PHYH）在轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體gamma（Retinoid X receptor gamma，RXRG）的介導(dǎo)下受增強(qiáng)子chr10：8047717-8048183調(diào)控，參與了過氧化物酶的相關(guān)功能；蛋白酪氨酸磷酸酶非受體6型基因（Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 6，PTPN6）在KLF轉(zhuǎn)錄因子6（KLF factor 6，KLF6）和SP轉(zhuǎn)錄因子2（SP factor 2，SP2）的介導(dǎo)下受增強(qiáng)子chr12：8026536-8026955調(diào)控，同時(shí)參與了激素水平的調(diào)節(jié)和排異反應(yīng)等功能；CD3E基因（CD3 epsilon，CD3E）在轉(zhuǎn)錄因子插頭框A1（Forkhead box A1，F(xiàn)OXA1）的介導(dǎo)下受增強(qiáng)子chr11：123069371-123069813調(diào)控，參與了異體移植排斥等功能，見圖4。

3討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，隨著人口老齡化的發(fā)展，我國近30年來的癌癥負(fù)擔(dān)持續(xù)增長，其中45%的癌癥死亡歸因于可改變的危險(xiǎn)因素，包括生活方式、疾病和環(huán)境變化等［12］。腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化是一個(gè)多步驟共同參與的過程，是基因異常遺傳及表觀遺傳共同作用的結(jié)果，惡性腫瘤的發(fā)生過程積累了大量的分子變化［13］。這些分子變化促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，并影響腫瘤細(xì)胞的分子功能。然而，許多種惡性腫瘤的發(fā)生過程中，基因的變化不足以解釋癌癥中普遍存在的基因表達(dá)改變和細(xì)胞功能改變［14］。研究表明，甲基化介導(dǎo)表觀遺傳調(diào)控，進(jìn)而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行異常調(diào)節(jié)，其中增強(qiáng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與靶基因表達(dá)的相關(guān)性更強(qiáng)［15-16］。然而目前大多數(shù)研究均聚集在啟動(dòng)子甲基化上，而對(duì)增強(qiáng)子甲基化的研究較少。

本研究在識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子過程中，構(gòu)建了一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在靶基因的識(shí)別過程中，在滿足距離要求的條件下，用增強(qiáng)子和基因的共表達(dá)識(shí)別了增強(qiáng)子的靶基因，從4DGenome數(shù)據(jù)庫中獲取所有增強(qiáng)子和靶基因結(jié)合的Hi-C數(shù)據(jù)，下一步將結(jié)合甲基化數(shù)據(jù)和Hi-C數(shù)據(jù)，對(duì)識(shí)別的靶基因做進(jìn)一步的驗(yàn)證［17］。

在功能分析過程中，本文對(duì)所有癌癥相關(guān)的靶基因進(jìn)行了功能富集分析，這樣更能從泛癌層面尋找泛癌相關(guān)的靶基因所參與的功能，但是這樣并不能體現(xiàn)每個(gè)癌癥的特異性，下一步將對(duì)不同的癌癥進(jìn)行分開處理和分析，探究不同癌癥相關(guān)的靶基因的功能是否相同或相異，或是否存在組織特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)，受甲基化影響的增強(qiáng)子在不同癌癥和染色體上的分布具有較大差異，具有癌癥和基因組位置特異性；此外，和正常樣本相比，這些增強(qiáng)子還傾向于在癌癥中表現(xiàn)出差異甲基化，并傾向于CpG Island上。在功能方面，這些增強(qiáng)子調(diào)控的靶基因參與了如P53等癌癥發(fā)生過程中的重要通路，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子也參與了如DNA修復(fù)等人類生命活動(dòng)過程中的必須通路。

綜上所述，本文系統(tǒng)分析了癌癥中受甲基化影響的增強(qiáng)子調(diào)控，識(shí)別了關(guān)鍵的增強(qiáng)子通過調(diào)控重要的靶基因參與癌癥發(fā)生發(fā)展的功能。分析惡性腫瘤中活性改變的增強(qiáng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供了理論基礎(chǔ)和新的視角。

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（2023-04-23收稿）