［摘要］目的探索調(diào)控宮頸癌中鐵死亡的環(huán)狀核糖核酸（circRNAs）對開發(fā)新的治療靶點的作用。方法基于GSE102686、TCGA、GSE9750數(shù)據(jù)分析宮頸癌組和對照組之間的差異表達的circRNAs（DEcircRNAs）、差異表達的微小核糖核酸（DEmiRNAs）和差異表達的信使核糖核酸（DEmRNAs）。通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與DEmiRNAs具有靶向調(diào)控關(guān)系的circRNAs、mRNAs，并與差異分析結(jié)果進行比較分析。對mRNAs進行富集分析以識別與細胞死亡（細胞周期、凋亡和鐵死亡）相關(guān)的mRNAs，并構(gòu)建相關(guān)競爭性內(nèi)源性RNAs（ceRNAs）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過單因素Cox回歸分析識別顯著影響患者預(yù)后的miRNAs和mRNAs。收集12例宮頸癌患者的宮頸癌組織及遠處對照宮頸組織樣本，利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印記方法檢測基因的表達，并利用雙熒光素酶報告檢測基因的靶向結(jié)合。結(jié)果宮頸癌和對照之間鑒定了179個DEcircRNAs、93個DEmiRNAs和739個DEmRNAs，并發(fā)現(xiàn)了160個DEcircRNAs，565個DEmRNAs與DEmiRNAs有靶向關(guān)系。最終鑒定出circ_0001461/ miR-145-5p/ 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFRC）的ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與鐵死亡相關(guān)。circ_0001461、TFRC在宮頸癌組織中顯著上調(diào)（Plt;0.05），miR-145-5p下調(diào)表達（Plt;0.05）。TFRC蛋白在宮頸癌組織中顯著上調(diào)表達（Plt;0.05）。此外，miR-145-5p與circ_0001461和TFRC均具有靶向結(jié)合能力（Plt;0.05）。結(jié)論circ_0001461/ miR-145-5p/ TFRC的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)鐵死亡，并與宮頸癌患者的預(yù)后相關(guān)，可為宮頸癌患者提供新的治療方法。

［關(guān)鍵詞］宮頸癌；競爭性內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)；總體生存；鐵死亡

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.03.012

circ_0001461/ miR-145-5p/ TFRC Regulation of Ferroptosisand the Prognostic Value in Cervical Cancer

Ma Xiaorong，Xie Qun，Guo Jing，Wan Li**

Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Uygur AutonomousRegion Institute，Urumqi830000

**Corresponding author：Wan Li，email：wanli2029@163.com

［Abstract］ObjectiveTo explore circular RNAs（circRNAs） that regulate ferroptosis in cervical cancer，in the development of new therapeutic targets.MethodsThe differentially expressed circRNAs（DEcircRNAs），differentially expressed microRNAs（DEmiRNAs） and differentially expressed mRNAs（DEmRNAs） between cervical cancer and control groups were analyzed based on GSE102686，TCGA，GSE9750.circRNAs and mRNAs with targeted regulatory relationships with DEmiRNAs were predicted by the Starbase database and compared with differential analysis results.Enrichment analysis of mRNAs was performed to identify mRNAs associated with cell death（cell cycle，apoptosis，and iron death） and to construct relevant competitive endogenous RNAs（ceRNAs） regulatory networks.Univariate Cox regression analysis was performed to identify miRNAs and mRNAs that significantly affect patient outcomes.Cervical cancer tissues and distant control cervical tissue samples from 12 patients with cervical cancer were collected to detect gene expression using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western blot，and targeted binding of genes was detected using a dual-luciferase reporter.ResultsA total of 179 DEcircRNAs，93 DEmiRNAs，and 739 DEmRNAs were identified between cervical cancer and controls，and 160 DEcircRNAs were found，and 565 DEmRNAs were targeted to DEmiRNAs.The ceRNAs regulatory network of circ_0001461/miR-145-5p/transferrin receptor（TFRC） was finally identified to be associated with ferroptosis.circ_0001461 and TFRC were significantly upregulated and miR-145-5p was downregulated in cervical cancer tissues（Plt;0.05）.The protein expression of TFRC in cervical cancer tissues was significantly upregulated（Plt;0.05）.In addition，miR-145-5p had target binding ability to both circ_0001461 and TFRC（Plt;0.05）.ConclusionThe ceRNAs network of circ_0001461/miR-145-5p/TFRC regulates ferroptosis and is associated with the prognosis of patients with cervical cancer，which may provide novel therapeutic approaches for patients with cervical cancer.

［Key words］Cervical cancer；Competitive endogenous RNAs network；Overall survival；Ferroptosis

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，新增病例數(shù)和死亡人數(shù)均居癌癥中的第四位［1］。2020年，全球約有60.4萬宮頸癌新發(fā)病例和34.2萬宮頸癌死亡病例，因此宮頸癌對全球女性的生命健康已構(gòu)成嚴重威脅，導(dǎo)致宮頸癌的主要病因之一是高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染［2-3］。盡管多數(shù)國家進行了人乳頭瘤病毒篩查以及預(yù)防性疫苗接種，但宮頸癌仍然是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［4］。對于局部晚期宮頸癌患者，子宮切除術(shù)、放療、化療和免疫療法是主要的治療手段，盡管治療效果較好，但不良事件仍不可避免［5］。

研究表明，多種微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）可能作為宮頸癌早期檢測和預(yù)后的可靠生物標志物［6］。已有研究評估了miRNAs作為預(yù)測宮頸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物標志物的效用［7］。此外，通過環(huán)狀核糖核酸（circular RNAs，circRNAs）與信使核糖核酸（messenger RNA，mRNAs）的相互作用，形成競爭性內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNAs，ceRNAs）的網(wǎng)絡(luò)，參與宮頸癌的發(fā)展［8］。近年來，ceRNAs網(wǎng)絡(luò)在促進宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，其可被靶向用于開發(fā)治療劑或作為篩選的生物標志物［9］。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性細胞死亡、參與多種癌癥的病理過程［10-11］。此外，miRNAs和circRNAs均參與鐵死亡的調(diào)控機制［12］。然而，目前宮頸癌中關(guān)于鐵死亡的調(diào)控機制的研究十分有限。

本研究基于宮頸癌患者的circRNAs、miRNAs和mRNAs表達數(shù)據(jù)，構(gòu)建ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討其在宮頸癌中對鐵死亡的調(diào)控作用機制。

1對象與方法

1.1數(shù)據(jù)收集

GSE9750數(shù)據(jù)集中包含了33例宮頸鱗狀細胞癌樣本和24例正常宮頸上皮細胞樣本的mRNAs表達譜；GSE102686數(shù)據(jù)集中包含了5例宮頸鱗狀細胞癌組織和5例配對癌旁宮頸組織的circRNAs表達譜；TCGA數(shù)據(jù)集中包含了236例宮頸鱗狀細胞癌樣本和3例相鄰的正常樣本的miRNAs表達譜。使用R語言limma包對宮頸癌和對照之間差異表達的mRNAs（Differentially expressed mRNA，DEmRNAs）、差異表達的circRNAs（Differentially expressed circRNAs，DEcircRNAs）、差異表達的miRNAs（Differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs）進行鑒定。

1.2生物信息學(xué)分析

使用Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與DEmiRNAs具有靶向調(diào)控關(guān)系的circRNAs、mRNAs。將預(yù)測結(jié)果分別與DEcircRNAs、mRNAs進行交集分析。使用R語言ENRICHR包對交集的mRNAs進行KEGG富集分析鑒定出與鐵死亡相關(guān)的mRNAs。進而將交集的circRNAs、鐵死亡相關(guān)的mRNAs和DEmiRNAs構(gòu)建為ceRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.3臨床樣本收集

收集2021年6月—2022年6月期間在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院就診的20例宮頸癌患者的宮頸癌組織及遠處對照宮頸組織樣本。臨床樣本保存在液氮中用于定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）實驗。所有研究內(nèi)容經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查通過（2019XE0155）。患者均知曉研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.3.1qRT-PCRqRT-PCR用來檢測circRNAs、miRNAs和mRNAs的表達。首先利用Trizol（廣州碩譜生物科技有限公司，生產(chǎn)批號22024565）從組織樣本中提取總RNA；再經(jīng)PrimeScript RT reagent Kit（成都福際生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號Z21011）將500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；后使用SYBR Green PCR Kit（成都福際生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號P221001）進行qRT-PCR。使用以下熱循環(huán)條件：95 ℃ 55 s；95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 s；72 ℃ 10 min。以GAPDH作為circRNAs和mRNAs的內(nèi)參基因，以U6作為miRNAs的內(nèi)參基因，利用2ΔΔCt方法計算相對表達，引物序列見表1。

1.3.2WB實驗使用含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀試驗裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號0329422220614）提取組織樣本的總蛋白質(zhì)，并使用雙辛可寧酸蛋白質(zhì)分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號MK222410）測定蛋白質(zhì)濃度。隨后將30 μg的蛋白質(zhì)通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，并轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜（Millipore公司，生產(chǎn)批號0000261849）上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，并用抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor，TFRC）抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，生產(chǎn)批號4000000582）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，生產(chǎn)批號3522122856）在4 ℃中孵育過夜，然后與含辣根過氧化物酶綴合的二抗在室溫下孵育2 h。GAPDH用作內(nèi)參對照蛋白，使用標準化學(xué)發(fā)光試劑盒（廣州碩譜生物科技有限公司，生產(chǎn)批號22005761）檢測蛋白質(zhì)條帶，并使用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行量化分析。

1.4雙熒光素酶測定

使用PCR擴增含有預(yù)測的miR-145-5p結(jié)合位點的TFRC mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）和circ_0001461的3′-UTR，并將所得產(chǎn)物克隆到pGL3熒光素酶報告載體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號041229370420）的螢火蟲熒光素酶基因的下游，構(gòu)建野生型（Wild type，WT）載體。同時，使用QuickChange定點突變試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號02261210817）通過PCR誘變產(chǎn)生TFRC 3′-UTR和circ_0001461 3′-UTR中miR-145-5p結(jié)合位點的突變，構(gòu)建突變型（Mutant type，MUT）載體。然后，將HeLa宮頸癌細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）接種到24孔板中，使用Lipofectamine 2000（Polyplus公司，生產(chǎn)批號0000000806）分別將含有TFRC 3′-UTR（WT或MUT）和circ_0001461 3′-UTR（WT或MUT）載體與miR-145-5p模擬物（mimic）和mimic NC（30 nM）共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染2 d后，使用雙熒光素酶報告基因測定法測定熒光素酶活性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

生物信息學(xué)分析使用R軟件（3.6.0版）進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，配對t檢驗用于配對樣本的比較，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。差異表達的circRNAs、mRNAs中|log2FC|gt;1且Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；差異表達的miRNAs中|log2FC|gt;2且Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；對ceRNAs網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的mRNAs和miRNAs進行單因素Cox回歸分析識別顯著影響患者預(yù)后的基因，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鑒定差異表達基因

通過差異分析在宮頸癌和對照之間鑒定了179個DEcircRNAs，見圖1A；93個DEmiRNAs，見圖1B；739個DEmRNAs，見圖1C。在Starbase數(shù)據(jù)庫中預(yù)測與DEmiRNAs有靶向調(diào)控關(guān)系的circRNAs和mRNAs。通過交集分析發(fā)現(xiàn)了160個DEcircRNAs與DEmiRNAs有靶向關(guān)系，見圖1D；565個DEmRNAs與DEmiRNAs有靶向關(guān)系，見圖1E。

2.2構(gòu)建鐵死亡相關(guān)的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)

對565個交集mRNAs進行富集分析以鑒定參與細胞死亡（細胞周期、凋亡和鐵死亡）的mRNAs，見圖2A。進一步對這些mRNA構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2B。其中，circ_0001704（下調(diào)）/miR-141-3p（上調(diào)）/JUN（下調(diào)）；circ_0001704/miR-200a-3p（上調(diào)）/JUN（下調(diào)）；circ_0001461（上調(diào)）/miR-145-5p（下調(diào)）/TFRC（上調(diào)）的表達方向符合ceRNAs的調(diào)控機制。Cox回歸分析結(jié)果顯示，TFRC、JUN、PIK3R3顯著影響宮頸癌患者的預(yù)后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖2C；miR-145-5p、miR-345-5p顯著影響宮頸癌患者的預(yù)后，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖2D。富集分析結(jié)果中TFRC參與鐵死亡，因此，circ_0001461/ miR-145-5p/ TFRC被鑒定為關(guān)鍵的鐵死亡相關(guān)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)。

2.3分子實驗驗證

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示與癌旁對照組織相比，circ_0001461、TFRC在宮頸癌組織中顯著上調(diào)，而miR-145-5p表達水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；WB實驗結(jié)果顯示，與癌旁對照組織相比，TFRC在宮頸癌組織中顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3和表2。

2.4miR-145-5p直接靶向circ_0001461和TFRC的表達

與mimic NC相比，miR-145-5p mimic與WT-circ_0001461共轉(zhuǎn)染顯著降低了HeLa細胞中熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），而在與MUT-circ_0001461共轉(zhuǎn)染中無顯著變化。與mimic NC相比，miR-145-5p mimic與WT-TFRC共轉(zhuǎn)染顯著降低了HeLa細胞中熒光素酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），而在與MUT-TFRC共轉(zhuǎn)染中無顯著變化，見表3。

3討論

盡管近年來大量研究報告關(guān)注了癌癥中鐵死亡的過程，但鐵死亡在宮頸癌中的調(diào)控機制仍有待闡明，circRNAs對宮頸癌中鐵死亡的作用仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)了circ_0001461（circFAT1）海綿miR-145-5p調(diào)控TFRC的表達，以及參與宮頸癌鐵死亡的作用機制。

轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)顯示，大量circRNAs在腫瘤組織中異常表達，并且失調(diào)的circRNAs在腫瘤進展中起關(guān)鍵作用［13-14］。本研究結(jié)果顯示circ_0001461在宮頸癌組織中的表達高于癌旁健康組織。circ_0001461在口腔鱗癌細胞系和腫瘤組織中均被證實為高表達，敲除circ_0001461可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制異種移植瘤的生長［15］。circ_0001461作為miRNAs的海綿靶向調(diào)節(jié)基因表達促進骨肉瘤和甲狀腺乳頭狀癌的進展和轉(zhuǎn)移［16-17］。然而，尚未有研究證實circ_0001461在宮頸癌中的潛在作用。

在宮頸癌中，本研究結(jié)果證實了miR-145-5p的低表達。與之相似的是，Aftab等［18］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者的尿液、血清、腫瘤活檢和宮頸刮片中均檢測到miR-145-5p的表達低于健康對照組，并可作為宮頸癌早期檢測的可靠生物標志物。miR-145-5p在宮頸癌組織和細胞中下調(diào)，其過表達抑制了HeLa細胞的遷移、侵襲和生存能力［19］。本研究結(jié)果提示miR-145-5p是宮頸癌患者預(yù)后的保護因素。Chen等［20］研究顯示在宮頸癌中過表達miR-145-5p與延長的患者生存期密切相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

TFRC是細胞鐵吸收過程中不可或缺的鐵轉(zhuǎn)運蛋白，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中促進鐵死亡［21］。本研究結(jié)果顯示TFRC在宮頸癌中高表達，Wang等［22］發(fā)現(xiàn)TFRC在宮頸癌中表達上調(diào)，是患者預(yù)后的危險因素，與本研究結(jié)果一致。

本研究通過雙熒光素酶報告基因證實了circ_0001461和miR-145-5p、miR-145-5p和TFRC之間的靶向調(diào)控關(guān)系，建立了與患者的預(yù)后顯著相關(guān)的circ_0001461/ miR-145-5p/ TFRC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了circ_0001461/ miR-145-5p/ TFRC調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵功能，為開發(fā)治療此類疾病的新藥提供了潛在的機會。

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（2023-01-30收稿）