摘要： 【目的】探索長順綠殼蛋雞 GRIN1 基因3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR） 多態(tài)性對蛋殼品質(zhì)的影響?！痉椒ā窟x擇185 只健康蛋雞，測定其第45 周齡產(chǎn)蛋的蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋殼厚度和蛋殼質(zhì)量5 個指標；使用NCBI 和PrimerPremier 3.0 設(shè)計引物，采用正向測序法篩選GRIN1 基因在3′ UTR 區(qū)域的SNP 位點?！窘Y(jié)果】GRIN1 基因的3′ UTR 檢測到4 個SNP 位點：g.30871Cgt;T、g.31017Agt;G、g.31158Agt;C 和g.31166Ggt;C，其中僅g.31158Agt;C 和g.31166Ggt;C 之間存在強連鎖不平衡，且g.30871Cgt;T 和g.31017Agt;G 都極顯著偏離哈代—溫伯格平衡（Plt;0.01）。g.31017Agt;G 與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析中，GG 基因型的蛋質(zhì)量顯著高于AA 基因型（Plt;0.05）。4 個SNP 位點共產(chǎn)生5 個單倍型（H1、H2、H3、H4、H5） 和8 個雙倍型（H1H1、H1H2、H1H3、H2H2、H2H3、H2H4、H3H5、H4H4），雙倍型H3H5 的蛋質(zhì)量顯著高于雙倍型H2H2 和H2H3 （Plt;0.05），雙倍型H3H5 的蛋殼質(zhì)量顯著高于雙倍型H2H2 （Plt;0.05），其他雙倍型指標間的差異未達到顯著水平（Pgt;0.05）?！窘Y(jié)論】長順綠殼蛋雞GRIN1 基因與蛋殼品質(zhì)存在顯著關(guān)聯(lián)；g.31017Agt;G 對蛋殼品質(zhì)有顯著影響，能夠作為改善蛋殼品質(zhì)的分子標記位點參考。

關(guān)鍵詞： 長順綠殼蛋雞；GRIN1 基因；3′非翻譯區(qū)；SNP 位點；蛋殼品質(zhì)

中圖分類號： S831.2 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 03?0056?08

長順綠殼蛋雞是貴州省地方品種，中心產(chǎn)區(qū)為黔南布依族苗族自治州長順縣，是該縣的地方特產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)：長順綠殼雞蛋富含維生素、腦磷脂、卵磷脂、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，其營養(yǎng)價值高于普通地方雞種所產(chǎn)雞蛋。MARIE 等[3]研究發(fā)現(xiàn)：蛋殼是生物陶瓷性材料，其碳酸鈣含量高達95.0%，基質(zhì)蛋白含量為3.5%。隨著當(dāng)代畜牧業(yè)規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖模式的迅猛發(fā)展，提高蛋殼品質(zhì)對于禽類養(yǎng)殖和蛋類生產(chǎn)具有重要意義。無論是在雞蛋后期的收集、包裝和運輸過程中如何提高蛋的商業(yè)價值，還是如何降低蛋的損耗率、提高孵化率等，皆對雞蛋蛋殼品質(zhì)有著較高的要求[4]。蛋殼品質(zhì)不僅受疾病、高溫、品種、年齡、營養(yǎng)等因素影響[5]，家禽機體對鈣的吸收利用也會使蛋殼的厚度和強度下降，導(dǎo)致產(chǎn)軟殼蛋甚至是無殼蛋[6]，在實際生產(chǎn)過程中造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，有效提高蛋殼品質(zhì)、確保蛋類生產(chǎn)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展是亟待解決的問題。

谷氨酸離子受體NMDA 型亞單位1 （glutamateionotropic receptor NMDA type subunit 1，GRIN1）基因位于雞的17 號染色體，含有21 個外顯子和20 個內(nèi)含子。NMDA 受體是谷氨酸離子型受體的主要亞型，包括3 個亞基：NR1、NR2（NR2A-2D） 和NR3 （NR3A 和NR3B）[7]，主要在調(diào)控學(xué)習(xí)記憶、興奮性神經(jīng)毒性、突觸可塑性等生理過程中發(fā)揮作用[8]。目前有關(guān)GRIN1 基因的研究主要集中于人類疾病，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其表達與精神分裂癥相關(guān)[9]，該基因發(fā)生變異可引起癲癇性腦病、語言落后、精神發(fā)育遲緩等與大腦相關(guān)的疾病[10-12]。5 ′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR） 和3′ UTR 是GRIN1 基因的重要調(diào)控結(jié)構(gòu)域，microRNA （miRNA） 是由21～25 個核苷酸組成的小型非編碼RNA，其與3′ UTR 中的序列互補，從而直接影響mRNA 的表達[13]。目前，國內(nèi)外對于GRIN1 基因與雞蛋殼品質(zhì)的研究還比較少。本研究以45 周齡長順綠殼蛋雞為研究對象，在GRIN1 基因上尋找SNP 位點，驗證GRIN1 基因與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，以期為育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院農(nóng)場選擇同批出雛、健康無病的長順綠殼蛋雞185 只，在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)45 周；收集其在第45 周齡的產(chǎn)蛋量，共計582 枚，并逐枚標記。

1.2 生產(chǎn)性能指標的測定

根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量計算方法》（NY/T 823 —2020）[14]， 對蛋質(zhì)量、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋殼厚度和蛋殼質(zhì)量進行測定，并對蛋雞進行翅靜脈采血1.0～1.5 mL，于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 的提取和引物設(shè)計

將185 份長順綠殼蛋雞血樣解凍，按照血樣DNA 試劑盒的說明書提取DNA，于?20 ℃ 保存?zhèn)溆?。在NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找雞的GRIN1 全基因序列（NC_052548.1），根據(jù)GRIN1 的基因序列設(shè)計在g.30448～g.31640區(qū)域的１對引物（F：5′-GGGAAAGGACTTGGAAGGCA-3 ′ ， R： 5 ′ -CGCCTATGGCTGCTTGAAAC-3′），Tm 值為58 ℃，擴增序列長度為504 bp。

1.4 PCR 擴增

PCR 擴增反應(yīng)體系為20 μL，包括：RNase-freeH2O 7 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃ 預(yù)變性8 min；94 ℃ 變性30 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃ 終延伸5 min；4 ℃ 保存。先用1% 瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測鑒定，再送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序，獲取目的基因片段。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar V7.1.0 中的EditSeq、MegAlign 程序以及Chromas 軟件，結(jié)合人工校對法對測序結(jié)果進行比對，查找 SNP位點。參考張晉華[15]的方法計算基因型頻率、等位基因頻率、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）、χ2 值等；根據(jù)SERROTE等[16]的方法判斷基因多態(tài)性，即：PICgt;0.50為高度多態(tài)，0.50≥PIC≥0.25 為中度多態(tài)，PIClt;0.25 為低度多態(tài)。利用SPSS 23.0 軟件一般線性模型中的單因素方差分析SNP 位點與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性。運用離線軟件haploview 對SNP 位點的連鎖不平衡、單倍型和雙倍型進行分析，當(dāng)滿足連鎖不平衡系數(shù)（D′）gt;0.80 且相關(guān)系數(shù)（R2）gt;0.33時，SNP 位點處于連鎖不平衡狀態(tài)[17-18]。利用在線軟件RNAfold （http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi） 預(yù)測mRNA 的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GRIN1 基因的SNP 位點

GRIN1 基因的3′ UTR 共發(fā)現(xiàn)4 個SNP 位點（圖1），分別為g.30871Cgt;T、g.31017Agt;G、g.311-58Agt;C 和g.31166Ggt;C，且4 個SNP 位點均產(chǎn)生3種基因型。

2.2 GRIN1 基因SNP 位點的遺傳特性

由表1 可知：g.30871Cgt;T 的優(yōu)勢基因型是CC，基因型頻率為0.805，優(yōu)勢等位基因為C，等位基因頻率為0.870；g.31017Agt;G 的優(yōu)勢基因型為AA，基因型頻率為0.611，優(yōu)勢等位基因為A，等位基因頻率為0.686；g.31158Agt;C 的優(yōu)勢基因型為AA，基因型頻率為0.416，優(yōu)勢等位基因為A，等位基因頻率為0.614；g.31166Ggt;C的優(yōu)勢基因型為GG，基因型頻率為0.416，優(yōu)勢等位基因為G，等位基因頻率為0.614。根據(jù)χ2檢驗結(jié)果， g.30871Cgt;T 和g.31017Agt;G 位點的χ2 值都大于χ20.01 （9.210），表明這2 個位點都極顯著偏離哈代—溫伯格平衡（Plt;0.01）；g.31158Agt;C和g.31166Ggt;C 位點未偏離哈代—溫伯格平衡（Pgt;0.05）。g.30871Cgt;T 的PIC 為0.226，為低度多態(tài)；而g.31017Agt;G、g.31158Agt;C 和g.31166Ggt;C 的PIC值分別為0.430、0.474 和0.474，皆為中度多態(tài)。

2.3 GRIN1 基因SNP 位點的連鎖不平衡、單倍型和雙倍型

由表2 可知：僅g.31158Agt;C 和g.31166Ggt;C之間的D′值和R2 值滿足D′gt;0.80 和R2 gt;0.33，即這2 個位點之間完全連鎖；其余SNP 位點之間不滿足此條件，不存在強連鎖不平衡。

4 個SNP 位點之間存在5 種單倍型（H1、 H2、H3、 H4、 H5） 和8 種雙倍型（H1H1、 H1H2、 H1H3、H2H2、H2H3、H2H4、H3H5、H4H4）。雙倍型中，H1H1 的頻率最高，為0.189；其次是H1H3，頻率為0.168；H4H4 的頻率最低，為0.065 （表3）。

2.4 GRIN1 基因SNP 位點與長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性

由表4 可知：位于3' UTR 的4 個SNP 位點中，g.31017Agt;G 顯著影響蛋質(zhì)量，基因型AA的蛋質(zhì)量顯著高于基因型GG，另外3 個SNP 位點對蛋殼品質(zhì)的影響均未達到顯著水平。

雙倍型關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果（表5） 顯示：H3H5的蛋質(zhì)量顯著大于H2H2 和H2H3， H3H5 的蛋殼質(zhì)量顯著大于H2H2，其他雙倍型的各指標間無顯著差異。因此，雙倍型H3H5 為最優(yōu)雙倍型。

2.5 GRIN1 基因3' UTR SNPs 對mRNA 二級結(jié)構(gòu)的影響

單倍型H1 （CACC），即原序列mRNA 的最小自由能為?440.70 kcal/mol；單倍型H2 （CAAG） 對應(yīng)的mRNA 最小自由能為?440.50 kcal/mol；單倍型H3 （CGAG） 對應(yīng)的mRNA 最小自由能為?443.70 kcal/mol；單倍型H4 （TAAG） 對應(yīng)的mR-NA 最小自由能為?439.50 kcal/mol；單倍型H5 （CGCC）對應(yīng)的mRNA 最小自由能為?443.90 kcal/mol（圖2）?？梢姡鲉伪缎蚼RNA 的穩(wěn)定性為H5gt;H3gt;H1gt;H2gt;H4。

3 討論

蛋殼雖只占雞蛋總質(zhì)量的10%，卻有著重要的功能，可為雞蛋提供物理保護和微生物防御，從而保證雞蛋的安全并提高雞蛋孵化率[19]。段忠意[20]研究發(fā)現(xiàn)：蛋殼基質(zhì)蛋白作為蛋殼的重要成分，參與蛋殼的形成，影響蛋殼品質(zhì)。本研究分析GRIN1 基因的多態(tài)性及其與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，旨在從基因水平篩選蛋殼品質(zhì)優(yōu)良的個體[21]。

3' UTR 參與調(diào)控真核生物細胞的表型、生長和分化，是細胞內(nèi)因子相互作用的重要區(qū)域[22]。有研究表明：3' UTR 可調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性[23-24]、亞細胞mRNA 定位[25]和mRNA 的翻譯[26]。朱路路[27]研究認為：3' UTR 內(nèi)的多態(tài)性可能是基因表達抑制或增強的潛在因素。本研究以長順綠殼蛋雞為對象，探究GRIN1 基因3' UTR 多態(tài)性對長順綠殼蛋雞蛋殼品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)GRIN1 基因的3' UTR 有4 個突變位點，其中g(shù).31017Agt;G、g.31158Agt;C 和g.31166Ggt;C 屬于中度多態(tài)，有一定的遺傳變異潛力，對分子遺傳育種有一定價值[28]；而g.30871Cgt;T 為低度多態(tài)，對于分子育種價值不大。根據(jù)χ2 檢驗，g.31158Agt;C 和g.311-66Ggt;C 位點處于哈代—溫伯格平衡，表明它們未受到基因突變、人工選育、自然選擇、遺傳漂變等因素的影響，或是經(jīng)過長時間的人工選擇后重新處于平衡狀態(tài)，也有可能是長時間未與其他種群之間進行基因交流所致[29]。這說明部分長順綠殼蛋雞受到人工選育或基因突變等因素的影響較小，環(huán)境適應(yīng)性強，有利于優(yōu)良基因的保種；而部分長順綠殼蛋雞受到人工選育或基因突變等因素的影響較大，環(huán)境適應(yīng)性差，可根據(jù)保種需求將其淘汰。

基因突變產(chǎn)生的單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量動物群體遺傳變異的重要指標[30]。本研究中的4 個SNP 位點共產(chǎn)生5 種單倍型和8 種雙倍型，而5 種單倍型理論上能夠產(chǎn)生15 種雙倍型，但另外7 種雙倍型并未檢測到，推測可能是由于人工選擇的干預(yù)、樣本數(shù)據(jù)不足、人工選育過程中被淘汰等原因所致。本研究在長順綠殼蛋雞GRIN1 基因3' UTR 上發(fā)現(xiàn)４個突變位點，轉(zhuǎn)錄為mRNA 后位于3' UTR 端，不翻譯為蛋白質(zhì)；但GRIN1 基因的3' UTR 序列與miRNA 互補，直接作用于mRNA 的表達[13]，故僅是通過影響DNA 水平和mRNA 的穩(wěn)定性間接影響蛋白質(zhì)的表達豐度，產(chǎn)生一定差異[31]。而本研究中4 種單倍型的mRNA 二級結(jié)構(gòu)和自由能均發(fā)生了變化，推測４個SNP 位點主要是通過影響mRNA的穩(wěn)定性間接影響蛋白質(zhì)水平[32-33]，但其是否達到改變翻譯結(jié)果的程度仍有待進一步驗證。4 個SNP 位點與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示：g.31017Agt;G 突變對蛋質(zhì)量有顯著影響，基因型GG 的蛋質(zhì)量顯著大于基因型AA，這一結(jié)果可為長順綠殼蛋雞的選育工作提供參考。本研究還表明：雙倍型H3H5 個體的蛋質(zhì)量顯著高于H2H2和H2H3 個體，且 H3H5 個體的蛋殼質(zhì)量顯著高于H2H2 個體，可見，單個SNP 位點對蛋殼品質(zhì)的影響小于雙倍型，這一結(jié)果與譚光輝等[34]和游敏芳等[35]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究以長順綠殼蛋雞GRIN1 基因為研究對象，發(fā)現(xiàn)4 個SNP 位點，其中g(shù).31017Agt;G 對其蛋殼品質(zhì)有顯著影響，雙倍型H3H5 對于蛋殼品質(zhì)也有顯著影響，它們可作為改善蛋殼品質(zhì)的分子標記位點參考。

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責(zé)任編輯：何謦成

基金項目：貴州省科技合作計劃項目[ 黔科合LH 字（2016）7454 號 ]。