摘要： 【目的】構(gòu)建p53 基因突變模型，為研究p53 基因突變引發(fā)腫瘤的發(fā)生和進展提供細胞模型資源?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，根據(jù) p53V149F 突變位點的序列，在線設(shè)計合成單鏈向?qū)gRNA，構(gòu)建CRISPR 打靶載體；將重組載體轉(zhuǎn)染細胞，流式分選陽性細胞群，提取細胞基因組，Sanger 測序分析Cas9 核酸酶對靶位點的切割情況，構(gòu)建同源修復(fù)模板，通過T7EN1 試驗進一步檢測編輯效率；將重組載體和同源模板通過電轉(zhuǎn)染方法共同轉(zhuǎn)染至成纖維細胞中，通過單克隆挑取、PCR 和Sanger 測序鑒定挑取含目標(biāo)突變的細胞株?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建靶向p53 基因目標(biāo)區(qū)域的CRISPR/Cas9 打靶載體；獲得5 個含目標(biāo)突變的克隆點，點突變率為10%，測序結(jié)果出現(xiàn)套峰，表明出現(xiàn)基因型多樣化；1 個細胞克隆的測序結(jié)果無雜峰，TA 克隆鑒定結(jié)果表明：一個等位基因存在p53V149F 位點突變，另一個等位基因存在240 bp 缺失?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了含p53V149F 的細胞系，并對基因的功能進行了初步驗證，為進一步構(gòu)建兩基因同時修飾模型奠定了基礎(chǔ)，并為藥物篩選提供可用的細胞模型資源，為創(chuàng)制模擬疾病發(fā)生的遺傳模式和臨床表現(xiàn)的小型豬實驗動物模型奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 基因編輯；打靶載體；癌癥；p53 基因

中圖分類號： Q78 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 03?0064?08

CRISPR/Cas9 技術(shù)是構(gòu)建基因編輯模型的重要手段，其優(yōu)勢使其成為生物和治療應(yīng)用基因工程的有利工具，被用于在活細胞或生物體中抑制/激活基因表達或標(biāo)記特定基因組位點的功能域，以探索發(fā)育機制、基因表達調(diào)控和動物行為[1]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為通過靶向基因修飾進行作物改良的有力工具，可對基因組序列進行精確地切割和修飾。ZHAO 等[2]利用CRIPSRi 系統(tǒng)在豬的細胞水平抑制了導(dǎo)入的GFP 基因表達，為在哺乳動物中開展基因表達調(diào)控研究提供了良好的借鑒。在研制用于器官移植和其他疾病研究的家豬模型中，已有研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)獲得豬腎細胞系PK15 中全部62 個拷貝的 PERV pol（多聚酶） 基因敲除的豬腎細胞系[3]。此外，在動物疾病模型的研究中，已獲得了皮膚白化病、帕金森疾病相關(guān)基因敲除體細胞克隆豬[4]以及白化病癥狀的兔子[5]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)旨在使精確的靶點產(chǎn)生目的基因突變，從而獲得目的靶向基因區(qū)域的打靶載體，通過有效的技術(shù)解析腫瘤發(fā)生的機制，確定藥物開發(fā)的靶點，提高武裝細胞進行治療的可能性，進而加速癌癥研究[6]。

從20 世紀被發(fā)現(xiàn)以來，癌癥的發(fā)病率不斷上升，全球每年登記的癌癥新病例超過1 400 萬例[7]，其特征是異常細胞不受控制地增殖和免疫系統(tǒng)的異常識別，被認為是“永不愈合的傷口”，但若能及早發(fā)現(xiàn)，所有的癌癥都可以治愈[8]。癌癥的常規(guī)治療主要靠消滅癌細胞或抑制其增殖，但復(fù)發(fā)的患者依然占比較高，無法獲得長期生存。因此，充分了解癌癥從發(fā)病到轉(zhuǎn)移再到復(fù)發(fā)的機制對其治療具有重要意義。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對癌癥的發(fā)病機制進行了多方面的研究，結(jié)果表明：癌癥的發(fā)病與p53、K-Ras、EGFR、P16等多個基因突變相關(guān)，特別是與p53 顯著相關(guān)[9]。約50% 的人類癌癥中存在p53 突變[10]，在某些特定癌癥的亞型中，如三陰性乳腺癌[11]、轉(zhuǎn)移性微衛(wèi)星陽性的結(jié)直腸癌[12]、鱗狀食管癌[13]等，至少80% 的病例發(fā)生p53 突變。由于p53 參與了多種腫瘤抑制途徑，其功能在人類癌癥中經(jīng)常受損。p53 突變通常是功能喪失，也可能提供新形態(tài)（功能獲得） 活動，如促進癌細胞干性、細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而促進癌癥發(fā)展[14]。

p53 作為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子[15]，受細胞內(nèi)外眾多的信號刺激，通過抑制細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡、促進DNA 損傷修復(fù)等過程抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在應(yīng)對DNA 損傷和異常生長信號時， p53 和鼠雙微體（murine double minute2，MDM2） 基因之間的相互作用被阻斷，p53變得穩(wěn)定，使得p53 主要通過靶基因的轉(zhuǎn)激活來調(diào)節(jié)一系列不同的細胞反應(yīng)。持續(xù)的DNA 損傷會阻止轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，從而阻礙細胞功能并促進細胞衰老和凋亡。DNA 損傷、電離輻射和活性氧都可以穩(wěn)定突變的p53[16-17]，突變主要發(fā)生在125～300 密碼子的DNA 結(jié)合區(qū)域內(nèi)[18]，這是p53 與DNA 結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能的必需區(qū)域。p53在惡性腫瘤中幾乎普遍失活，因此，它是抗癌新藥開發(fā)中極具吸引力的靶點。p53 激活的結(jié)果受其動態(tài)、與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及翻譯后修飾的控制。盡管已有多種針對功能失調(diào)的p53 治療癌癥的策略，但到目前為止，只有2 種策略產(chǎn)生了用于臨床試驗的化合物[19]。本研究以豬成纖維細胞構(gòu)建含p53V149F 的細胞系，并對基因功能進行初步驗證，以期為進一步構(gòu)建兩基因同時修飾的模型奠定基礎(chǔ)，并為藥物篩選提供可用的細胞模型資源，也為創(chuàng)制模擬疾病發(fā)生的遺傳模式和臨床表現(xiàn)的小型豬實驗動物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試質(zhì)粒：PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和spCas9，由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授課題組饋贈；供試33 日齡滇南小耳豬成纖維細胞系由云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術(shù)重點實驗室提供。

1.2 p53sgRNA 載體設(shè)計與構(gòu)建

通過網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu 設(shè)計與人157 密碼子區(qū)域同源的豬p53 基因（NC_010454.4） V149第5 號外顯子的sgRNA （TGGCACCCGTGTCCGCGCCA）。以滇南小耳豬DNA 為模板，以p53-snp（F：CAGCTATGATTTCCGTCTAGGG； R：GCTGTGTCGAAAAGTGTTTCTG）為引物進行PCR擴增，擴增片段為400 bp。反應(yīng)程序為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；68～58 ℃ （每進行1 個循環(huán)退火溫度下降1 ℃），30 s；72 ℃，1 min；10 個循環(huán)；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；25 個循環(huán)；72 ℃，7 min；12 ℃ 保存。PCR 結(jié)束后對產(chǎn)物進行凝膠電泳，將PCR 產(chǎn)物進行Sanger 測序，比對分析峰圖并進行sgRNA 的SNP 檢測；將sgRNA 正反鏈退火后形成雙鏈，連接到線性化的載體PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和PGL3-U6-sgRNA-puro，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，利用氨芐青霉素抗性LB 平板篩選，挑取菌落進行PCR 鑒定，并將其中1 個陽性克隆菌進行Sanger 測序，以獲得正確的PGL3-U6-p53sgRNA 載體，再通過試劑盒（北京天根，DP118-02） 提取PGL3-U6-p53sgRNA和spCas9 質(zhì)粒備用。

1.3 細胞培養(yǎng)

滇南小耳豬成纖維細胞系培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中（5% CO2），待細胞的生長覆蓋率達到60%～70% 時收集細胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染試驗。

1.4 p53sgRNA 活性鑒定和供體構(gòu)建

將提取的質(zhì)粒PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 和spCas9 按照1∶2 的比例通過電轉(zhuǎn)染（LONZA4D-Nucleofector） 豬成纖維細胞（即試驗組），以只加入轉(zhuǎn)染試劑、不加質(zhì)粒的處理為對照組，48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。采用流式細胞分選儀分選綠色熒光陽性細胞，收集陽性細胞，離心去除上清液，加細胞裂解液10 μL 裂解細胞，取樣品1 μL 為模板進行PCR 擴增，程序、引物和體系同1.2 節(jié)。將PCR 產(chǎn)物送至測序公司進行Sanger 測序，利用Snapgene 軟件進行序列比對，分析sgRNA 對p53 基因的編輯情況；通過T7EN1 對PCR 純化產(chǎn)物進行酶切，程序為：95 ℃，5 min；94 ℃，2 s，200 個循環(huán)（每進行1 個循環(huán)退火溫度下降0.1 ℃）；75 ℃，600 個循環(huán)（每進行1 個循環(huán)退火溫度下降0.1 ℃）；16 ℃，2 min，進行退火反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入T7EN1 酶0.5 μL，置于恒溫水浴鍋中37 ℃ 酶切30 min；加入5×Loading Buffer 滅活酶，使用1.2% 凝膠進行電泳鑒定；將sgRNA 打靶位置的左右50 nt 基因序列（包含C 到T 突變堿基） 進行ssODN 合成作為供體。

1.5 p53V149F 細胞系的單克隆培養(yǎng)與鑒定

將提取的質(zhì)粒PGL3-U6-p53sgRNA-puro、質(zhì)粒spCas9、ssODN 按照1∶2∶2 的比例通過電轉(zhuǎn)染豬成纖維細胞48 h，利用有限稀釋的方法分離和培養(yǎng)單克隆細胞。具體為：加入3 μg/mL 嘌呤霉素篩選陽性細胞，48 h 后收集細胞；按照每皿100～150 個的密度接種到培養(yǎng)皿（直徑9 cm） 中，單克隆生長培養(yǎng)15 d，取單細胞克隆點鑒定基因型；以裂解液裂解的單細胞克隆點作為模板，通過PCR 和Sanger 測序鑒定p53 基因位點的編輯情況，程序、引物和體系同1.2 節(jié)；再將克隆點PCR 產(chǎn)物進行TA 克隆，通過Sanger 測序分析基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源p53 基因打靶策略

豬p53 基因mRNA 總長1 849 bp，編碼386個氨基酸。在豬p53 基因第5 號外顯子第149 號氨基酸編碼的堿基位置設(shè)計sgRNA （圖1），連接到sgRNA 的表達載體骨架，根據(jù)細胞水平的活性驗證找到Cas9 的切口位置（PAM 結(jié)構(gòu)上游3、4 號堿基之間），設(shè)計包含目標(biāo)突變的ssODN。通過共轉(zhuǎn)染sgRNA 質(zhì)粒、Cas9 質(zhì)粒和ssODN，對目標(biāo)區(qū)域進行切割，造成雙鏈斷裂。由于提供了外源重組模板，通過機體同源重組修復(fù)機制從而引入點突變，實現(xiàn)p53 基因的第149 號氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸奖彼?，對?yīng)p53 基因mRNA5的94 號堿基由胞嘧啶（C） 突變?yōu)轼B嘌呤（G），從而獲得p53V149F。

2.2 p53sgRNA 目標(biāo)區(qū)域SNP 檢測

滇南小耳豬成纖維細胞系DNA 通過PCR 擴增和凝膠電泳，獲得865 bp 的目的條帶（圖2a）。將PCR 產(chǎn)物進行Sanger 測序比對基因組序列，結(jié)果顯示：峰圖無雜峰且與參考基因組序列一致（圖2b）。表明豬p53 的sgRNA 打靶區(qū)域不存在SNP 位點，可直接用于sgRNA 打靶設(shè)計。

2.3 p53 基因sgRNA 表達載體構(gòu)建結(jié)果

經(jīng)氨芐青霉素抗性LB 平板篩選，共挑取8個單菌落進行PCR 鑒定，PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示：8 個菌落都能擴增出單一的240 bp 目的條帶，與目標(biāo)大小一致（圖3a）；陽性克隆菌的Sanger測序結(jié)果表明已成功構(gòu)建PGL3-U6-p53sgRNApuro和PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 載體（圖3b）。

2.4 p53 基因sgRNA 表達載體細胞水平驗證

質(zhì)粒PGL3-U6-sgRNA-EGFP 和spCas9 電轉(zhuǎn)染進入細胞48 h 后，觀察到較強的GFP 熒光蛋白表達，而對照組未觀察到熒光，表明p53 基因sgRNA 表達載體成功轉(zhuǎn)染進細胞（圖4a）；T7EN1酶切試驗結(jié)果顯示：野生型原始條帶（865 bp） 未被切割，而共轉(zhuǎn)染PGL3-U6-p53sgRNA-EGFP 和spCas9 質(zhì)粒的細胞基因組PCR 條帶被切割為597和268 bp 的目的條帶（圖4b），表明在sgRNA 打靶位置Cas9 核酸酶發(fā)生了靶向切割；Sanger 測序峰圖顯示：從PAM 前3、4 號堿基之間出現(xiàn)雜峰（圖4c） 。

2.5 p53 基因供體構(gòu)建結(jié)果

選擇切口位置（目標(biāo)區(qū)域sgRNA 的PAM 結(jié)構(gòu)上游3、4 號堿基之間） 左右各50 nt 作為同源臂，合成含C 到T 突變位點的ssODN 作為同源重組修復(fù)的模板（圖5）。

2.6 單克隆細胞篩選及鑒定

經(jīng)過PCR 擴增和Sanger 測序50 個克隆點中，共有5 個克隆點含有目標(biāo)點突變（圖6a），其中P36 號克隆點測序未出現(xiàn)雜峰（圖6b）；該克隆點的TA 克隆和Sanger 測序鑒定結(jié)果顯示：該克隆點為單等位基因V149F 位點突變，缺失240 bp片段（圖6c）。

3 討論

對p53 基因的編碼區(qū)進行序列檢測發(fā)現(xiàn)：86% 的突變聚集在125～300 密碼子[20]，而目前針對p53 突變的癌癥模型構(gòu)建以R175H （豬167 位點同源） 為主[21-23]。有研究繪制了加合物在人類p53 基因的分布， 在密碼子157 （豬149 同源）CpG 序列的鳥嘌呤上形成了強且有選擇性的加合物，這是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的主要突變位點[24]，但目前鮮有對于該位點的研究報道。本研究獲得一個存在p53V149F 的p53 等位基因；而另一個等位基因存在240 bp 缺失，缺失的原因可能是：同源修復(fù)后，Cas9 核酸酶對靶向區(qū)域的二次切割，鑒定含目標(biāo)突變的克隆點為10% （5/50），點突變編輯效率偏低。YANG 等[25]和WANG 等[26]對成纖維細胞中點突變的編輯效率分別為11.4% （21/184） 和5.6% （5/90），這可能是受細胞類型、周期、同源重組模板質(zhì)粒遞送效率等因素的影響，導(dǎo)致細胞內(nèi)同源重組修復(fù)途徑發(fā)生的概率較低，造成點突變基因編輯效率也偏低，后續(xù)試驗將對這些影響因素進行進一步的研究。

通過在轉(zhuǎn)染過程中添加DNA ligase IV 抑制劑（SCR7）[27]、在同源修復(fù)模板上的PAM 結(jié)構(gòu)引入同義突變改變ssODN 上的PAM 結(jié)構(gòu)[28]、使用RNP 體系（Cas9 蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA） 代替質(zhì)?；蚓庉嫻ぞ遊29-30]等方法可以有效提高基因編輯點突變的發(fā)生頻率。在克隆點鑒定時，有5 個單克隆雖然含有目標(biāo)點突變，但測序結(jié)果出現(xiàn)大量套峰和雜峰，表明該克隆點可能含有多種基因型。這是由于本研究使用藥物篩選和有限稀釋的方式進行單克隆培養(yǎng)和挑取，細胞間出現(xiàn)粘連所致。將藥物篩選標(biāo)記換成熒光基團，使用流式細胞儀進行單細胞分選，或許能改善粘連的狀況，這將在后續(xù)的研究中進行驗證。此外，針對p53 點效率偏低的問題，后續(xù)研究將改進同源修復(fù)突變模板，突變修復(fù)模板ssODN 中的PAM 結(jié)構(gòu)，避免Cas9 核酸酶對靶向區(qū)域的二次切割；同時，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后向培養(yǎng)液中添加SCR7，抑制非同源性末端連接，提高同源重組概率，最終利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，結(jié)合構(gòu)建內(nèi)源性p53V149F點突變基因修飾成纖維細胞系，通過核移植獲得基因修飾的動物模型。

4 結(jié)論

本研究運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建了有效的基因編輯質(zhì)粒，并通過細胞水平的驗證和T7EN1 酶切試驗驗證了該質(zhì)粒的有效性；通過編輯后的細胞基因組測序結(jié)果設(shè)計了重組模板ssODN，經(jīng)共轉(zhuǎn)染基因編輯質(zhì)粒和ssODN、藥物篩選以及單克隆培養(yǎng)獲得含有目標(biāo)突變的細胞系，證明了利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)靶向p53基因發(fā)生單堿基替換（G→T） 的定點精確編輯是切實可行的。

[ 參考文獻 ]

[1]MA Y W， ZHANG L F， HUANG X X. Genome modificationby CRISPR/Cas9[J]. FEBS Journal， 2014， 281（23）：5186. DOI： 10.1111/febs.13110.

[2]ZHAO Y C， DAI Z， LIANG Y， et al. Sequence-specificinhibition of microRNA via CRISPR/CRISPRi system[J].Scientific Reports， 2014， 4（1）： 3943. DOI： 10.1038/srep03943.

[3]YANG L H， GüELL M， NIU D， et al. Genome-wide inactivationof porcine endogenous retroviruses （PERVs）[J].Science， 2015， 350（6264）： 1101. DOI： 10.1126/science.aad1191.

[4]ZHOU X Q， XIN J G， FAN N N， et al. Generation ofCRISPR/Cas9-mediated gene-targeted pigs via somaticcell nuclear transfer[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2015， 72（6）： 1175. DOI： 10.1007/s00018-014-1744-7.

[5]HONDA A， HIROSE M， SANKAI T， et al. Single-stepgeneration of rabbits carrying a targeted allele of the tyrosinasegene using CRISPR/Cas9[J]. Experimental Animals，2015， 64（1）： 31. DOI： 10.1538/expanim.14-0034.

[6]ZHAN T Z， RINDTORFF N， BETGE J， et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy[J]. Seminarsin Cancer Biology， 2019， 55： 106. DOI： 10.1016/j.semcancer.2018.04.001.

[7]ROY P S， SAIKIA B J. Cancer and cure： a critical analysis[J]. Indian Journal of Cancer， 2016， 53： 441. DOI：10.4103/0019-509x.200658.

[8]YIN W， WANG J L， JIANG L L， et al. Cancer and stemcells[J]. Experimental Biology and Medicine， 2021， 246：1791. DOI： 10.1177/15353702211005390.

[9]KEOHAVONG P， LAN Q， GAO W M， et al. Detectionof p53 and K-ras mutations in sputum of individuals exposedto smoky coal emissions in Xuanwei County， China[J]. Carcinogenesis， 2005， 26（2）： 303. DOI： 10.1093/carcin/bgh328.

[10]LEROY B， ANDERSON M， SOUSSI T. TP53 mutationsin human cancer： database reassessment and prospectsfor the next decade[J]. Human Mutation， 2014，35（6）： 672. DOI： 10.1002/humu.22552.

[11]KAUR R P， VASUDEVA K， KUMAR R， et al. Role ofp53 gene in breast cancer： focus on mutation spectrumand therapeutic strategies[J]. Current Pharmaceutical Design，2018， 24（30）： 3566. DOI： 10.2174/1381612824666180926095709.

[12]YAEGER R， CHATILA W K， LIPSYC M D， et al. Clinicalsequencing defines the genomic landscape of metastaticcolorectal cancer[J]. Cancer Cell， 2018， 33（1）： 125.DOI： 10.1016/j.ccell.2017.12.004.

[13]SONG Y M， LI L， OU Y W， et al. Identification of genomicalterations in oesophageal squamous cell cancer[J].Nature， 2014， 509（7498）： 91. DOI： 10.1038/nature13176.

[14]LIEBL M C， HOFMANN T G. The role of p53 signalingin colorectal cancer[J]. Cancers， 2021， 13（9）： 2125.DOI： 10.3390/cancers13092125.

[15]GADEPALLI V S， DEB S P， DEB S， et al. Lung cancerstem cells， p53 mutations and MDM2[M]//DEB S P， DEBS. Mutant p53 and MDM2 in Cancer. Dordrecht： Springer，2014.

[16]LI D， MARCHENKO N D， MOLL U M. SAHA showspreferential cytotoxicity in mutant p53 cancer cells bydestabilizing mutant p53 through inhibition of the HDAC6-Hsp90 chaperone axis[J]. Cell Death and Differentiation，2011， 18（12）： 1904. DOI： 10.1038/cdd.2011.71.

[17]SUH Y A， POST S M， ELIZONDO-FRAIRE A C， et al.Multiple stress signals activate mutant p53 in vivo[J]. CancerResearch， 2011， 71（23）： 7168. DOI： 10.1158/0008-5472.Can-11-0459.

[18]PETITJEAN A， MATHE E， KATO S， et al. Impact ofmutant p53 functional properties on TP53 mutation patternsand tumor phenotype： lessons from recent developmentsin the IARC TP53 database[J]. Human Mutation，2007， 28： 622. DOI： 10.1002/humu.20495.

[19]DUFFY M J， SYNNOTT N C， O’GRADY S， et al. Targetingp53 for the treatment of cancer[J]. Seminars inCancer Biology， 2022， 79（8）： 58. DOI： 10.1016/j.semcancer.2020.07.005.

[20]OLIVIER M， HOLLSTEIN M， HAINAUT P. TP53mutations in human cancers： origins， consequences， andclinical use[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2010， 2（1）： a001008. DOI： 10.1101/cshperspect.a001008.

[21]SAALFRANK A， JANSSEN K P， RAVON M， et al. Aporcine model of osteosarcoma[J]. Oncogenesis， 2016，5（3）： e210. DOI： 10.1038/oncsis.2016.19.

[22]PRINCIPE D R， OVERGAARD N H， PARK A J， et al.KRASG12D and TP53R167H cooperate to induce pancreaticductal adenocarcinoma in Sus scrofa pigs[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 12548. DOI： 10.1038/s41598-018-30916-6.

[23]SIEREN J C， MEYERHOLZ D K， WANG X J， et al.Development and translational imaging of a TP53 porcinetumorigenesis model[J]. Journal of Clinical Investigation，2014， 124（9）： 4052. DOI： 10.1172/jci75447.

[24]DENISSENKO M F， CHEN J X， TANG M S， et al.Cytosine methylation determines hot spots of DNAdamage in the human P53 gene[J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States ofAmerica， 1997， 94（8）： 3893. DOI： 10.1073/pnas.94.8.3893.

[25]YANG Y， WANG K P， WU H， et al. Genetically humanizedpigs exclusively expressing human insulin are generatedthrough custom endonuclease-mediated seamlessengineering[J]. Journal of Molecular Cell Biology， 2016，8（2）： 174. DOI： 10.1093/jmcb/mjw008.

[26]WANG K K， TANG X C， LIU Y， et al. Efficient generationof orthologous point mutations in pigs via CRISPRassistedssODN-mediated homology-directed repair[J].Molecular Therapy Nucleic Acids， 2016， 5（11）： e396.DOI： 10.1038/mtna.2016.101.

[27]RAY U， VARTAK S V， RAGHAVAN S C. NHEJ inhibitorSCR7 and its different forms： promising CRISPRtools for genome engineering[J]. Gene， 2020， 763（15）：144997. DOI： 10.1016/j.gene.2020.144997.

[28]張楷， 劉蔚， 劉小鳳， 等. 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人HPRT1基因定點突變細胞株[J]. 遺傳， 2019， 41（10）： 939.DOI： 10.16288/j.yczz.19-108.

[29]FU Y W， DAI X Y， WANG W T， et al. Dynamics andcompetition of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and AAVdonor-mediated NHEJ， MMEJ and HDR editing[J].Nucleic Acids Research， 2021， 49（2）： 969. DOI： 10.1093/nar/gkaa1251.

[30]許永漢， 齊澤宇， 李文靜， 等. 精準(zhǔn)序列替換基因組編輯技術(shù)研究進展[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)）， 2024，39（2）： 162. DOI： 10.12101/j.issn.1004-390X（n）.202302027.

責(zé)任編輯：何承剛

基金項目：云南省重大科技專項計劃項目（202102AA100054）。