摘要：【目的】克隆鉤藤堿的合成關(guān)鍵酶即色氨酸合成酶a鏈基因（UrTSA），并分析其組織表達(dá)特異性，為探究該基因的鉤藤堿生物合成機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā繌纳镯?xiàng)目數(shù)據(jù)庫（BioProject）篩選得到鉤藤堿的生物合成相關(guān) 酶基因UrTSA，以鉤藤的根、葉、莖鉤和蒴果的cDNA為模板，PCR克隆UrTSA基因的開放閱讀框（ORF），并進(jìn)行生 物信息學(xué)分析，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UrTSA基因在鉤藤不同組織中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】UrTSA基因的ORF為963bp，編碼320個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為33924.49Da，理論等電點(diǎn)（pI）為9.11，不穩(wěn)定指數(shù)I為33.50，脂溶指數(shù)為102.12，總平均親水性指數(shù)為0.117，說明UrTSA蛋白為穩(wěn)定、脂溶性好的疏水蛋白。UrTSA蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠 體，不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)，為非分泌型蛋白；不具有潛在的糖基化位點(diǎn)，有30個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括16個(gè)絲氨酸 （Ser）、13個(gè)蘇氨酸（Thr）和1個(gè)酪氨酸（Tyr）；二級(jí)結(jié)構(gòu)由a-螺旋（43.44%）、無規(guī)則卷曲（31.87%）、延伸鏈（15.94%）和β-折疊（8.75%）組成。UrTSA蛋白與其他11個(gè)植物物種的TSA蛋白具有較高的氨基酸序列相似性（69.78%～92.77%）， 其中與阿拉比卡咖啡（Coffee arabica）和歐基尼奧伊德斯種咖啡（Coffea eugenioides）TSA蛋白的親緣關(guān)系較近。UrTSA基因在鉤藤的根、葉、莖鉤和蒴果中均有表達(dá)，其中在蒴果、根和葉中相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于莖鉤中的相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01），分別是莖鉤的2.17、1.58和1.20倍?！窘Y(jié)論】UrTSA基因具有組織表達(dá)特異性，主要在蒴果鉤藤堿合成 中發(fā)揮調(diào)控作用，為后續(xù)研究鉤藤堿在鉤藤中不同部位的累積及其生物合成途徑提供思路和線索。

關(guān)鍵詞：鉤藤；UrTSA基因；基因克??；生物信息學(xué)分析；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S567.19

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1079-10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Cloning and tissue expression specificity analysis of UrTSA gene of Uncaria rhynchophylla

ZHANG Yao， MU De-tian， WANG Li-ya， LU Ying， TANG Qi*， ZHU Li-na*

（College of Horticulture，Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to clone the key enzyme for the alkaloid synthesis of Uncaria rhynchophylla， the tryptophan synthase a-chain gene （UrTSA）， and to organize the expression specificity analysis， so as to provide theoretical references for exploring the mechanism of alkaloid biosynthesis in U. rhynchophylla by this gene.【Method】The alkaloid biosynthesis-related enzyme gene UrTSA of U. rhynchophylla was screened and obtained from the BioProject database. The opening reading frame （ORF） of UrTSA gene was cloned by PCR using cDNAs of root， leaf， stem hook and capsule of U. rhynchophylla as templates， and bioinformatic analysis was performed， combined with real- time fluorescence quantitative PCR to analyze the expression pattern of UrTSA gene in different tissues of U. rhyncho- phylla. 【Result】The ORF of UrTSA gene was 963 bp， encoding 320 amino acid residues， with relative molecular weight of 33924.49 Da， theoretical isoelectric point （pI） of 9.11， instability index I of 33.50， lipid solubility index of 102.12， and total average hydrophilicity index of 0.117. It indicated that the UrTSA protein was a stable， lipid-soluble hydropho- bic protein. The UrTSA protein was subcellularly localized to chloroplasts without signal peptide and transmembrane re- gion， and was non-secretory protein. Without potential glycosylation sites， it had 30 potential phosphorylation sites， in- cluding 16 serine（Ser）， 13 threonine（Thr） and 1 tyrosine （Tyr） . The secondary structure consisted of a-helix （43.44%），random coil （31.87%） ， extended strand （15.94%）， and β-fold （8.75%）. The UrTSA protein showed relatively high amino acid sequence similarity （69.78% to 92.77%） with TSA proteins from 11 other plants， with closer affinities to the TSA proteins of Coffee arabica and Coffea eugenioides. The UrTSA gene was expressed in roots， leaves， stem hooks and capsule of U. rhynchophylla， with the relative expression in capsules， roots and leaves being extremely significantly higher than that in stem hooks （Plt;0.01）， which was as 2.17， 1.58 and 1.20 times as that in stem hooks， respectively.【Conclusion】UrTSA gene has tissue expression specificity and mainly plays a regulatory role in the synthesis of capsule al- kaloid in U. rhynchophylla， which provides ideas and clues for the subsequent study on the accumulation of alkaloids in different tissues of U. rhynchophylla and its biosynthetic pathway.

Key words： Uncaria rhynchophylla; UrTSA gene; gene cloning; bioinformatics analysis; real-time fluorescence quantitative PCR

Foundation items： Hunan Natural Science Foundation （2022JJ30305）; Key Project of Hunan Department of Education （21A0138） ; Hunan Graduate Research Innovation Project （CX20220689） ; Hunan Agricultural University Graduate Research Innovation Project（2022XC062）

0 引言

【研究意義】鉤藤（Uncaria rhynchophylla）為茜草科（Rubiaceae）鉤藤屬（Uncaria）的常綠藤本植物，是萜類吲哚生物堿的重要植物來源，分布廣泛，常見于我國(guó)廣西、廣東、湖南及湖北省等多個(gè)省（區(qū)）（Yanget al.，2022；楊紅霞等，2023）。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》記載，鉤藤的藥用部位是帶鉤的莖枝，其性涼，味甘，具息風(fēng)定驚及清熱平肝之效（國(guó)家藥典委員會(huì)，2020）。研究表明，鉤藤中含有生物堿、三萜、甾醇、香豆素、黃酮、酚類等多類次生代謝產(chǎn)物，其中生物堿被認(rèn)為是鉤藤的主要活性成分，包括鉤藤堿和異鉤藤堿等（Zhang et al.，2015；余俊和黃宗雯，2021；劉新宇等，2022）。近年來，較多研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿對(duì)阿爾茲海默癥等神經(jīng)類疾?。╔u et al.，2021）、高血壓等心血管疾?。℅ao et al.，2022）及肝臟損傷（Shinet al.，2021）等具有顯著的治療作用，促使鉤藤藥材的需求量趨升（駱輯等，2022），探索鉤藤堿的生物合成途徑，有助于提高植株中鉤藤堿含量，降低成本。色氨酸合成酶a鏈（Tryptophan synthase alpha chain，TSA）是一種色氨酸合酶（TS），參與萜類吲哚生物堿（TIAs）的生物合成，用于催化重要的前體物質(zhì)即色氨酸的合成（陳越等，2016）。因此，克隆鉤藤堿生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因 UrTSA，分析其在不同組織間的表達(dá)模式，對(duì)解析鉤藤堿的生物合成機(jī)制具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]鉤藤堿是一類萜類吲哚生物堿（TIAs），其生物合成途徑包括環(huán)烯醚萜途徑和吲哚途徑的上游部分（圖1-A和圖1-B）（鄭浩杰等，2023）。環(huán)烯醚萜途徑中的香葉基二磷脂經(jīng)過香葉醇合酶（GES）、香葉醇8-羥基化酶（G8H）等一系列酶催化生成斷馬錢子苷（Secologanin）（章瑤等，2023）（圖 1-A）;吲哚途徑的分支酸（Chorismate）在鄰氨基苯甲酸合成酶（AS）、TSA等各種關(guān)鍵酶催化下合成色氨酸（Tryptophan）（陳越等，2016）（圖1-B）;色氨酸和斷馬錢子苷經(jīng)過異胡豆苷合酶（STR）的催化，能進(jìn)一步合成鉤藤堿的重要合成前體一異胡豆苷（Strictosidine），再經(jīng)氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）等一系列酶催化生成鉤藤堿（吳世文等，2018）（圖1-D）。吲哚途徑的吲哚-3-甘油磷酸（IGP）通過TS催化合成色氨酸（Tryptophan），TS 根據(jù)亞基的不同可分為TSA和色氨酸合成酶β鏈（TSB），IGP首先經(jīng)過 TSA 的催化生成吲哚（Indole），再經(jīng)過TSB 的催化生成色氨酸（Salvini et al.，2008;Parveen et al.，2019）（圖1-C）。因此，TS被看作是調(diào)節(jié)鉤藤堿在植物組織中積累的關(guān)鍵酶之一。目前，已有多項(xiàng)研究對(duì)TSA 的蛋白結(jié)構(gòu)和催化功能進(jìn)行研究。Nishio等（2005）不僅確定了嗜溫菌（Escherichia coli）中TSA的螺旋結(jié)構(gòu)，還發(fā)現(xiàn)其螺旋結(jié)構(gòu)的形成是TSA與TSB相互作用時(shí)刺激2個(gè)酶活性的主要原因;O'Rourke等（2018，2021）研究了TSA在催化過程中的獨(dú)特變構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)TSA在催化過程中存在構(gòu)象交換事件，并通過后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證其新的變構(gòu)現(xiàn)象;Kriechbaumer等（2008）首次對(duì)ZmTSA及其同系物進(jìn)行了功能分析，通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)證明ZmTSA作為TS 的a亞基催化色氨酸的生物合成。此外，對(duì)生物合成途徑上的相關(guān)酶基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，是作為提高次生代謝產(chǎn)物累積的重要技術(shù)手段之一，目前已有學(xué)者對(duì)TSA基因進(jìn)行相關(guān)研究。Guo等（2023）在馬藍(lán)（Baphicacanthus cusia）中克隆得到BcTSA基因，并證實(shí)其編碼蛋白催化IGP轉(zhuǎn)化成吲哚的功能，當(dāng)其在菘藍(lán)（Isatis indigotica）的毛狀根中過表達(dá)時(shí)，可刺激靛藍(lán)生物堿的合成；Jin等（2016）通過cDNA末端快速克?。≧ACE）PCR擴(kuò)增獲得蓼藍(lán)（Polygonum tinctorium）中TSA相關(guān)的2個(gè)基因，并通過互補(bǔ)試驗(yàn)、亞細(xì)胞定位及苯并噻二唑（BTH）誘導(dǎo)等試驗(yàn)，證明長(zhǎng)度較短（822 bp）的PtINS基因參與靛藍(lán)的生物合成，而長(zhǎng)度較長(zhǎng)（951bp）的PtTSA基因未發(fā)現(xiàn)該功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前鮮見有關(guān)鉤藤TS相關(guān)基因克隆及表達(dá)分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從生物項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫（Bio-Project）篩選得到鉤藤堿的生物合成相關(guān)酶基因UrTSA，以鉤藤的根、葉、莖鉤和蒴果的cDNA為模板，PCR克隆UrTSA基因的開放閱讀框（ORF），并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UrTSA基因在鉤藤不同組織中的表達(dá)模式，為探究該基因的鉤藤堿生物合成機(jī)制提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的鉤藤[U.rhynchophylla（Miq.）Miq.exHavil]種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中藥材生產(chǎn)（湖南）技術(shù)中心。剪取鉤藤的根、葉、莖鉤及蒴果，用滅菌水洗凈，吸干水分后分別切片，液氮速凍，于-80℃下保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭憾嗵嵌喾又参颮NA提取試劑盒和2×SYBR Green Pro Tag HS premix購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；PrimerScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Mix購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T載體和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有 限公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit購自康寧 生命科學(xué)（吳江）有限公司。主要儀器設(shè)備：MicroDrop超微量分光光度計(jì)（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）、VeritiTM 96孔熱循環(huán)儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司公司）和ABI7300實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司公司）。

1.2RNA提取及互補(bǔ)DNA合成

利用多糖多酚植物RNA提取試劑盒分別提取 鉤藤根、葉、莖鉤和蒴果的總RNA，用Micro Drop超微量分光光度計(jì)測(cè)定各組織RNA的濃度和純度，并 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量和完整性。利用帶gDNA橡皮擦的PrimerScriptTMRT試劑盒（完美實(shí)時(shí)）試劑盒將總核糖核酸反轉(zhuǎn)錄 合成互補(bǔ)DNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3UrTSA基因克隆及測(cè)序分析

在生物項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫（BioProject）中搜索鉤藤基 因組（PRJNA931770），獲得一段注釋為“tryptophan synthase alpha chain”的序列信息，通過SnapGene設(shè) 計(jì)其引物PCR-UrTSA-F和PCR-UrTSA-R（表1），并以鉤藤根、葉、莖鉤和蒴果4個(gè)組織的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增該片段。反應(yīng)體系100.0pL：2×TagPCR Mix 50.0 μL，cDNA模板（100 ng/μL）8.0 μL，PCR-UrTSA-F和PCR-UrTSA-R（10umol/L）各4.0uL，RNase free water補(bǔ)足至100.0 uL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min;94℃30s，60℃30s，72℃58s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切取目的條帶，用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit純化回收產(chǎn)物，使用MicroDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)回收產(chǎn)物的濃度和純度，將PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂板后置于37℃培養(yǎng)12h。對(duì)篩選到的陽性克隆菌斑進(jìn)行菌液PCR，并送至武漢華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.4UrTSA蛋白生物信息學(xué)分析

將UrTSA基因提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，利用BLASTp工具對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)；利用EditSeq查找UrTSA基因的ORF；利用ProtParam在線預(yù)測(cè)UrTSA基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；通過ExPASy在線網(wǎng)站的ProtScale 工具預(yù)測(cè)蛋白的親/疏水性；分別通過NetNGlyc 1.0Server和NetPhos 3.1 Server在線預(yù)測(cè)蛋白的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)；采用WoLFPSORT預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；利用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)UrTSA蛋白的跨膜域結(jié)構(gòu)；以SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽；分別利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)UrTSA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過SWISS-MODEL獲得預(yù)測(cè)的蛋白模型。從NCBI數(shù)據(jù)庫的PubChem中下載IGP小分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，通過OpenBa-bel 2.4.1轉(zhuǎn)換格式后，將其與蛋白模型在AutoDock-Tools 1.5.6進(jìn)行對(duì)接，利用PYMOL和plip網(wǎng)站使對(duì)接構(gòu)想可視化并預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)；經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得同源氨基酸序列，通過DNAMAN9.0進(jìn)行多重比對(duì)分析，再用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5UrTSA基因表達(dá)分析

通過Beacon Designer7設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物RT-qPCR-UrTSA-F和RT-qPCR-UrTSA-R（表1）。以SAM為內(nèi)參基因（穆德添等，2023），對(duì)UrTSA基因在鉤藤的根、葉、莖鉤和蒴果4個(gè)組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析。通過ABI 7300 Real-Time FluorescencePCR System，采用2×SYBR Green Pro Taq HS premix染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為20.0 uL：2×SYBR Green Pro Tag HS Premix 10.0 pL，cDNA模板（25 ng/uL）2.0pL，RT-qPCR-UrTSA-F和RT-qPCR-UrTSA-R引物（10 mmol/L）各0.4 μL，ROX（10 mmol/L）0.4 uL，RNase free water補(bǔ)充至20.0μL。擴(kuò)增程序：95°℃預(yù)變性3min；95℃30s，60℃30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每樣品設(shè)3次重復(fù)，最后利用2-AAa法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1鉤藤UrTSA基因克隆結(jié)果

以鉤藤不同部位的cDNA為模板PCR擴(kuò)增UrTSA基因，擴(kuò)增獲得的條帶大小約900bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。此外，該條帶測(cè)序的結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)中參考序列完全一致，表明已成功克隆UrTSA基因（GenBank登錄號(hào)：OP669358），可用于后續(xù)試驗(yàn)。EditSeq分析結(jié)果顯示，UrTSA具有完整的ORF，長(zhǎng)度為963bp，編碼320個(gè)氨基酸殘基（圖3）。

2.2生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1理化性質(zhì)分析

通過ProtParam推測(cè)UrTSA基因編碼的蛋白由4878個(gè)原子組成，其分子式為C1518H2495N405O451S9，相對(duì)分子量為33924.49Da，理論等電點(diǎn)（pI）為9.11，不穩(wěn)定指數(shù)I為33.50，脂溶指數(shù)為102.12，總平均親水性指數(shù)為0.117，推測(cè)該UrTSA蛋白為穩(wěn)定、脂溶性好的疏水蛋白。此外，對(duì)UrTSA蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果顯示，該蛋白由20種氨基酸構(gòu)成，其中異亮氨酸（Leu）的含量最高，占比11.2%，色氨酸（Trp）的含量最低，占比0.3%；帶負(fù)電荷的殘基[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]共有31個(gè)，帶正電荷的殘基[（精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]共有37個(gè)。同時(shí)，通過ProtScale預(yù)測(cè)UrTSA蛋白的親/疏水性，結(jié)果如圖4所示。多肽鏈上第20位氨基酸谷氨酰胺（Gln）的分值最低，達(dá)-2.889；第287位氨基酸甘氨酸（Gly）的分值最高，達(dá)2.133，并發(fā)現(xiàn)疏水區(qū)明顯多于親水區(qū)，與理化性質(zhì)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，說明UrTSA為疏水性蛋白。NetNGlyc和NetPhos預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，UrTSA蛋白不具有潛在的糖基化位點(diǎn)，有30個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包含16個(gè)絲氨酸（Ser）、13個(gè)蘇氨酸（Thr）和1個(gè)酪氨酸（Tyr）（圖5）。

2.2.2亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析

利用WoLFPSORT對(duì)UrTSA蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，獲得定位系數(shù)，其中葉綠體11.5，葉綠體和線粒體7.0，線粒體為 1.5， 細(xì)胞質(zhì)（cyto）1.0，由此推測(cè)該蛋白很可能定位在葉綠體上，屬于一種胞內(nèi)蛋白，并在葉綠體和線粒體中發(fā)揮重要作用。利用TMHMM 2.0 對(duì)UrTSA 蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，且所有氨基酸均位于膜外（圖6）。同時(shí)，SignalP 4.1預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，UrTSA蛋白不含信號(hào)肽，說明其為非分泌型蛋白（圖7）。

2.2.3蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分子對(duì)接結(jié)果

經(jīng)過SOPMA 對(duì)UrTSA 蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白中占比最高的結(jié)構(gòu)是a-螺旋（43.44%）和無規(guī)則卷曲（31.87%），數(shù)量分別為139 和102個(gè)，延伸鏈（15.94%）和β-折疊（8.75%）占比較少，數(shù)量分別為51 和28個(gè)，說明該蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為a-螺旋和無規(guī)則卷曲（圖8）。通過SWISS-MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，獲得 1 個(gè)以 SMTL ID為1rd5.1.A 的結(jié)構(gòu)作為模板建立的蛋白結(jié)構(gòu)，UrTSA同1rd5.1.A 模板的序列相似性為 62.16%，同源區(qū)域的氨基酸殘基范圍在模板序列的 56～318位，同時(shí)，全域模型質(zhì)量估計(jì)值（GMQE）高達(dá)0.74（圖9），說明該模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性較高?？傮w而言，二級(jí)結(jié) 構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

基于SWISS-MODEL建立的蛋白模型（圖9），與IGP小分子在antodock工具中預(yù)處理后，通過兩 者對(duì)接共獲得10個(gè)對(duì)接結(jié)果。一般認(rèn)為，兩者對(duì)接 的結(jié)合能小于0，說明兩者可自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合能越 低，結(jié)合的可能性越大（劉魏魏等，2023）。因此，選 擇結(jié)合能最小為-5.53的對(duì)接結(jié)果，利用PYMOL進(jìn)行可視化分析，再通過PLIP在線工具，最終預(yù)測(cè)到 3個(gè)重要的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)，分別為第114、228和231位的Asp、Tyr和Ser。

2.2.4系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

根據(jù)UrTSA基因編碼的氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得同源序列，并通過DNAMAN9.0對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果如圖10所示。UrTSA氨基酸序列分別與擬南芥（Arabi-dopsis thaliana，NC_003074.8）、阿拉比卡咖啡（Coffeearabica，XP 027098196）、歐基尼奧伊德斯種咖啡（Coffea eugenioides，XP_027151216.1）、狹葉油茶（Camellia lanceoleosa，KAI7983235.1）、茶（Camelliasinensis，XP_028076212.1）、松蒿（Phtheirospermumjaponicum，GFP97998.1）、野甘草（Scoparia dulcis，AYC63472.1）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha，XP057461586.1）、木樨欖（Olea europaea subsp.euro-paea，CAA2971792.1）、中華獼猴桃（Actinidia chinen-sis var.chinensis，PSR86101.1）、君遷子（Diospyroslotus，XP 052169984.1）等11個(gè)物種的TSA氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，其序列相似性依次為69.78%、92.77％、92.14％、80.50％、79.87％、79.18％、78.30％、80.44%、79.68%、80.13%和80.19%，并推測(cè)TSA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖10）?？梢姡琔rTSA蛋白與其他物種的TSA氨基酸序列具有較高的相似性。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖11），發(fā)現(xiàn)鉤藤與阿拉比卡咖啡（C.arabica）和歐基尼奧伊德斯種咖啡（C.eugenioides）的親緣關(guān)系較近。

2.3 UrTSA基因表達(dá)模式分析結(jié)果

為研究 UrTSA基因在不同組織的表達(dá)特異性，通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)其在不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，UrTSA基因在不同組織中均有表達(dá)，且在蒴果中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是根和葉，均極顯著高于莖鉤中的相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01），分別是莖鉤的2.17、1.58和1.20倍（圖12），說明UrTSA基因具有組織表達(dá)特異性。

3討論

鉤藤是我國(guó)的一種重要藥用植物資源，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，并在臨床上應(yīng)用廣泛，其對(duì)高血壓和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的顯著藥理作用成為近年來的研究熱點(diǎn)（柳威等，2021;王舸和李倩，2022）。因此，為了擴(kuò)大鉤藤的應(yīng)用范圍，國(guó)內(nèi)外有很多學(xué)者對(duì)鉤藤的化學(xué)成分和藥理毒理機(jī)制等進(jìn)行研究，杜建平等（2023）利用響應(yīng)面法對(duì)鉤藤主要的化學(xué)成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;陳蕾等（2023）以大鼠為模型，闡明了鉤藤相關(guān)的降壓解郁藥方是通過減少炎性因子的分泌等方式改善大鼠高血壓并發(fā)抑郁癥的癥狀；張留記等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤總堿對(duì)小鼠的急性毒性小，并對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）損傷具有一定的保護(hù)作用。鉤藤堿作為上述藥理活性的主要成分（蔣京辰等，2021），與長(zhǎng)春花堿和喜樹堿同屬于TIAs類物質(zhì)，已有大量研究對(duì)該類物質(zhì)的生物合成途徑進(jìn)行解析（匡雪君等，2016;王瑤瑤等，2019），結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些途徑具有相似的生物合成環(huán)節(jié)，色氨酸的合成是其中必不可少的一步。對(duì)鉤藤中色氨酸合成的相關(guān)酶基因進(jìn)行分析，有助于推動(dòng)后續(xù)鉤藤堿生物合成的研究進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，TSA位于質(zhì)體中通過催化生成吲哚，在色氨酸的生物合成中起重要作用（Kriechbaumeret al.，2008）。游離的TSA很穩(wěn)定，其催化生成吲哚后，吲哚在TSB催化下迅速生成色氨酸，故TSA存在的時(shí)間短暫（Ferrer et al.，2022）。目前，已從擬南芥（Radwanski et al.，1995）、菘藍(lán)（楊樹，2014）、馬藍(lán)（公培民，2020）中克隆獲得TSA 的編碼基因，并獲得該酶的擬南芥突變體（Radwanski et al.，1996）。鉤藤作為一種傳統(tǒng)的大宗中藥材（付金娥，2013），目前還未見鉤藤TSA編碼基因的克隆及生物信息學(xué)分析的研究報(bào)道。而在對(duì)關(guān)鍵酶的功能研究中，基因克隆和生物信息學(xué)分析是重要環(huán)節(jié)。穆德添等（2022）篩選出適合鉤藤的RNA 提取方法，隨后對(duì)其關(guān)鍵限速酶基因 STR進(jìn)行克隆，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)模式同鉤藤堿在不同組織的特異性表達(dá)結(jié)果相符;鄭浩杰等（2023）對(duì)鉤藤上游環(huán)烯醚萜途徑的環(huán)烯醚萜氧化酶（IO）基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析及其在不同激素處理下轉(zhuǎn)錄水平比較，并通過酵母單雜交試驗(yàn)驗(yàn)證了堿性/螺旋一環(huán)螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子與該基因啟動(dòng)子的互作關(guān)系。本研究從鉤藤中克隆獲得 UrTSA基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白是一種穩(wěn)定、疏水的胞內(nèi)蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)且在細(xì)胞核膜外，可能有利于暫存在細(xì)胞膜外的游離TSA與TSB進(jìn)一步形成TS復(fù)合物，從而刺激TSA產(chǎn)生相應(yīng)的活性;該蛋白主要定位于葉綠體，與Guo等（2023）的研究結(jié)果相符，說明IGP向吲哚的轉(zhuǎn)化在葉綠體中完成。本研究還以IGP為小分子，與UrTSA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型對(duì)接，基于對(duì)接結(jié)果預(yù)測(cè)到UrTSA蛋白上3個(gè)重要的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)研究該蛋白酶的底物特異性及催化功能提供重要線索。

此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在鉤藤4個(gè)組織中，蒴果的鉤藤堿含量最高（穆德添等，2023）。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UrTSA基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在鉤藤的根、葉、莖鉤和蒴果中均有表達(dá)，且在蒴果中具有較高表達(dá)，與上述蒴果的鉤藤堿含量最高的結(jié)論相符，說明UrTSA基因具有組織特異性，推測(cè)其主要在蒴果鉤藤堿合成中發(fā)揮調(diào)控作用。而在傳統(tǒng)工藝中，通常采用鉤藤的莖鉤作為鉤藤堿的提取物來源（吳順，2022），結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)，蒴果可作為具有潛在開發(fā)價(jià)值的一種藥材資源，提高鉤藤植物的利用率，以適應(yīng)鉤藤藥材市場(chǎng)的需求量。但UrTSA作為鉤藤堿上游合成途徑的相關(guān)酶基因，還需結(jié)合后續(xù)多種酶的作用，生成最終的次生代謝產(chǎn)物，其表達(dá)量的高低不能直接影響鉤藤堿含量。因此，對(duì)鉤藤堿生物合成相關(guān)的酶基因進(jìn)行克隆研究，生物信息學(xué)分析以及組織表達(dá)的特異性分析，為后續(xù)驗(yàn)證該基因的功能及TIAs其他生物合成相關(guān)酶基因的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

UrTSA基因具有組織表達(dá)特異性，主要在蒴果鉤藤堿合成中發(fā)揮調(diào)控作用，為后續(xù)研究鉤藤堿在鉤藤中不同部位的累積及其生物合成途徑提供思路和線索。

參考文獻(xiàn)（References）：

陳蕾，劉葉倩，趙紅霞，黃鈴格，李弘，龔?qiáng)櫍R丹鳳，陳春茗，曾水清，易健，劉林，龍紅萍，王宇紅，任衛(wèi)瓊.2023.鉤藤降壓解郁方對(duì)高血壓并發(fā)抑郁大鼠血壓及抑郁樣行為的改善作用[J].中成藥，45（6）：1831-1838.[ChenL，LiuY Q， Zhao H X，Huang L G， Li H，Gong S， Ma D F， ChenC M，Zeng S Q，Yi J，Liu L，Long H P，Wang Y H，Ren WQ. 2023. Gouteng Jiangya Jieyu Recipe elicited improve-ment of blood pressure and depression-like behavior inhypertensive rats complicated with depression [J]. ChineseTraditional Patent Medicine ， 45 （6） ： 1831-1838.] doi ： 10.3969/j.issn.1001-1528.2023.06.014.

陳越，張青磊，黃玉香，譚何新，刁勇，張磊.2016.吲哚生物堿生物合成研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，18（11）：1914-1920. [Chen Y，Zhang Q L，Huang Y X，Tan HX， Diao Y，Zhang L. 2016. A research progress on the bio-synthetic pathways of indole alkaloids [J]. Modernizationof Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology， 18（11）： 1914-1920.] doi：10.11842/wst.2016.11.013.

杜建平，韋啟迪，崔宏浩，霍可以，喬光.2023.響應(yīng)面法優(yōu)化鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿和毛鉤藤堿的提取工藝[J/OL].分子植物育種.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230602.1439.013.html. [Du J P， Wei Q D， Cui H H，Huo K Y， Qiao G. 2023. The optimization of the extractionprocess of rhynchophylline， isorhynchophylline and hirsu-tine from Uncarine by response surface method [J/OL].Molecular Plant Breeding. http：//kns.cnki. net/kcms/detail/46.1068.S.20230602.1439.013.html.]

付金娥，龍海榮，谷筱玉，李吾來，韋樹根.2013.不同產(chǎn)地鉤藤中鉤藤堿含量比較研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，24（12）：3000-3001. [Fu J E，Long H R，Gu X Y，Li W L，Wei S G.2013. Comparative study on the content of rhynchophyl-line in Uncaria rhynchophylla （Miq.） Miq. ex Havil. fromdifferent areas[J]. Lishizhen Medicine and Materia MedicaResearch， 24 （12） ： 3000-3001.] doi： 10.3969/j. issn. 1008-0805.013.12.078.

公培民，寧書菊，葉齊，馬曉莉，趙璇璇，沈繼偉，胡永樂，魏道智.2020.馬藍(lán)色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表達(dá)分析[J].分子植物育種，18（3）：873-881.[Gong P M，NingS J， Ye Q， Ma X L， Zhao X X， Shen J W， Hu Y L， Wei DZ. 2020. Cloning， sequence and expression analysis oftryptophan synthase from Baphicacanthus cusia [J]. Mole-cular Plant Breeding，18（3）：873-881.] doi：10.13271/j.mpb.018.000873.

國(guó)家藥典委員會(huì).2020.中國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社：268.[Chinese Pharmacopoeia Commission.2020Pharmacopoeia of the People's Republic of China M]. Bei-jing：China Medical Science Press： 268.]

蔣京辰，李梅珊，朱廷春.2021.鉤藤現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，30（22）：74-78.[Jiang J C，Li M S，Zhu TC. 2021. Modern research progress of Uncaria rhyncho-phylla [J]. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，30（22）：74-78.]doi： 10.3969/j.issn.1007-8517.2021.22.zgmzmjyyzz202122019.

匡雪君，王彩霞，鄒麗秋，朱孝軒，孫超.2016.長(zhǎng)春花萜類吲哚生物堿生物合成與調(diào)控研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，41（22）：4129-4137.[Kuang X J，Wang C X，Zou L Q，ZhuX X， Sun C. 2016. Advance in biosynthesis of terpenoidindole alkaloids and its regulation in Catharanthus roseus[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 41（22）：4129-4137.]doi： 10.4268/cjcmm20162208

.柳威，鄧林華，趙英強(qiáng).2021.鉤藤提取物及鉤藤堿的藥理研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，32（6）：899-904.[LiuW，Deng L H，Zhao Y Q. 2021. Research progress on phar-macological effects of uncaria extract and rhynchophylline[J]. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Phar-macology，32（6）：899-904.]doi： 10.19378/j.issn.1003-9783.2021.06.022

劉魏魏，張宇欣，周煒煒，戴小楓，付弘赟，雒文捷，李秀梅2023.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析金銀花緩解牛氧化應(yīng)激的分子機(jī)制[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，50（8）：3391-3402.[Liu W W，Zhang YX，Zhou W W，Dai X F，F(xiàn)u HY， Luo W J， Li X M. 2023. Mechanism of LoniceraeJaponicae Flos alleviating oxidative stress in cattle basedon network pharmacology and molecular docking[J]. ChinaAnimal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 50（8）： 3391-3402.]doi： 10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.08.037.

劉新宇，侯杏子，郭強(qiáng)，屠鵬飛，張慶英.2022.鉤藤中甾醇類化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，47（3）：684-691.[LiuX Y，Hou X Z， Guo Q， Tu P F，Zhang Q Y. 2022. Steroidsfrom Uncaria rhynchophylla[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 47 （3） ： 684-691.] doi ： 10.19540/j. cnki.cjcmm.20211012.204.

駱輯，李滿香，甘夢(mèng)蘭.2022.鉤藤高效栽培技術(shù)要點(diǎn)[J].耕作與栽培，42（6）：135-137.[LuoJ，LiMX，Gan ML.2022.Key points of efficient cultivation techniques of RammulusUncariae CumUncis [J]. Tillage and Cultivation， 42 （6） ：135-137.] doi：10.13605/j.cnki.52-1065/s.2022.06.012.

穆德添，萬凌云，韋樹根，吳長(zhǎng)橋，潘麗梅，柳亦松，田藝，付金娥，唐其.2022.鉤藤不同部位總RNA提取及UrSTR基因的克隆與表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，30（9）：1737-1746. [Mu D T，Wan L Y，Wei S G， Wu C Q，Pan LM， Liu Y S， Tian Y， Fu J E， Tang Q. 2022. Extraction oftotal RNA and cloning and expression analysis of UrSTRgene from Uncaria rhynchophylla [J]. Journal of Agricul-tural Biotechnology，30（9）：1737-1746.] doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2022.09.008.

穆德添，萬凌云，章瑤，韋樹根，陸英，付金娥，田藝，潘麗梅，唐其.2023.鉤藤管家基因篩選及生物堿合成相關(guān)基因的表達(dá)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，39（2）：126-138.[MuDT，Wan L Y，Zhang Y，Wei S G，Lu Y，F(xiàn)u J E，Tian Y，PanL M， Tang Q. 2023. House-keeping genes screening andexpression patterns analysis of genes involved in alkaloidbiosynthesis in Uncaria rhynchophylla [J]. BiotechnologyBulletin，39（2）：126-138.] doi： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2022-0567.

王舸，李倩.2022.鉤藤堿對(duì)腎性高血壓大鼠血管緊張素、醛固酮及降鈣素基因相關(guān)肽的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，20（11）：1965-1968.[Wang G，Li Q.2022.Effects of rhynchophylline on angiotensin， aldosterone andcalcitonin gene-related peptide in renal hypertensive rats[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine on Cardio-Cerebrovascular Disease ， 20 （ 11 ） ： 1965-1968. ] doi ： 10.12102/ji.ssn.1672-1349.2022.11.008.

王瑤瑤，丁劍蘭，韓卓，郭亞鑫，劉詩卉，劉曉寧.2019.喜樹堿關(guān)鍵酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（2）：92-93.[Wang Y Y，Ding JL，Han Z，Guo Y X，Liu S H， Liu X N. 2019. Cloning and bioinformatic analy-sis of key enzyme in Camptotheca acuminata [J]. ModernAgricultural Science and Technology， （2）：92-93.]

吳世文，楊盟權(quán)，肖友利.2018.單萜吲哚生物堿的合成生物學(xué)研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué)，38（9）：2243-2258.[WuS W，Yang M Q， Xiao Y L. 2018. Synthetic biology studies ofmonoterpene indole alkaloids[J]. Chinese Journal of Orga-nic Chemistry， 38 （9） ： 2243-2258.] doi： 10.6023/cjoc201806001.

吳順，孫健鵬，謝麗霞，陳澤陽，張嘉桐，顏彬彬.2022.鉤藤堿的超聲輔助提取及其含量變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，50（12）： 158-160. [Wu S， Sun J P， Xie L X， Chen Z Y，Zhang J T， Yan B B. 2022. Ultrasound-assisted extractionand its content changes of rhynchophylline [J]. Journal ofAnhui Agricultural Sciences， 50 （12） ： 158-160.] doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.040.

楊紅霞，唐艷紅，郭常交.2023.仿生條件下鉤藤高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種植模式探討[J].種子科技，41（6）：56-59.[Yang H X，Tang Y H， Guo C J. 2023. Discussion on high-yield and high-quality cultivation mode of Uncaria rhynchophylla underbionic conditions[J]. Seed Science amp; Technology，41（6）：56-59.] doi：10.19904/j.cnki.cn14-1160/s.2023.06.018.

楊樹，潘淑琴，張麗紅，王喆之，李燾.2014.菘藍(lán)色氨酸合成酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），42（6）：66-70.[Yang S，Pan S Q，Zhang LH， Wang Z Z， Li T. 2014. Gene cloning and bioinformaticanalysis of tryptophan synthase from Isatis indigotica [J].Journal of Shaanxi Normal University （Natural ScienceEdition） ， 42 （6） ： 66-70. ] doi ： 10.15983/j.cnki.jsnu.2014.06.013.

余俊，黃宗雯.2021.鉤藤屬化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中藥材，44（1）： 233-239. [Yu J， Huang Z W. 2021. Progress in thestudy of the chemical composition of Uncaria [J]. Journalof Chinese Medicinal Materials， 44（1） ： 233-239. ] doi： 10.13863/j.issn1001-4454.2021.01.045.

張留記，夏曼玉，吳冰帆，屠萬倩，李開言，盧新.2023.鉤藤總堿的提取工藝和急性毒性及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，40（10）：1330-1336.[Zhang L J， Xia M Y， Wu B F， Tu W Q， Li K Y，Lu X.2023. Extraction process of total alkaloids of Uncariarhynchophylla， and its acute toxicity and protective effecton HUVEC[J]. Chinese Journal of Modern Applied Phar-macy，40（10）：1330-1336.] doi： 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.20221448.

章瑤，穆德添，周宇，陸英，柳亦松，左夢(mèng)婷，董壯，劉兆穎，唐其.2023.鉤吻看家基因篩選及生物堿合成相關(guān)酶基因的表達(dá)分析[J].生物工程學(xué)報(bào)，39（1）：286-303.[ZhangY，Mu D T，Zhou Y，Lu Y， Liu Y S，Zuo M T，Dong Z，LiuZ Y， Tang Q. 2023. Screening of housekeeping genes inGelsemium elegans and expression patterns of genesinvolved in its alkaloid biosynthesis[J]. Chinese Journal ofBiotechnology ， 39 （1） ： 286-303.] doi ： 10.13345/j.cjb.220345.

鄭浩杰，王曉紅，李永權(quán)，李雪，上官黎陽，田宇航，張明生.2023.鉤藤UrIO基因及其啟動(dòng)子的克隆與分析[J].農(nóng)業(yè)

生物技術(shù)學(xué)報(bào)，31（4）：741-753.[Zheng HJ，Wang XH， Li Y Q， Li X， Shangguan L Y， Tian Y H， Zhang M S.

2023. Cloning and analysis of the UrIO gene and its promoter in Uncaria rhynchophylla [J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 31 （4） ： 741-753.] doi： 10.3969/j.issn.1674-7968.2023.04.007.

Ferrer L， Mindt M，Suarez-Diez M，Jilg T， Zagorscak M， Lee J H， Gruden K， Wendisch V F， Cankar K. 2022. Fermentative indole production via bacterial tryptophan synthase alpha subunit and plant indole-3-glycerol phosphate lyase enzymes [J]. Journal Agricultural and Food Chemistry，70（18）：5634-5645. doi： 10.1021/acs.jafc.2c01042.

Gao L， Kong X Q， Wu W Y， Feng Z J， Zhi H J， Zhang Z J， Long H L， Lei M， Hou J J， Wu W Y， Guo D A. 2022. Dissecting the regulation of arachidonic acid metabolites by Uncaria rhynchophylla（Miq）. Miq. in spontaneously hypertensive rats and the predictive target sEH in the antihypertensive effect based on metabolomics and molecular docking [J]. Frontiers in Pharmacology， 13： 909631. doi：10.3389/fphar.2022.909631.

Guo Z Y， Chen J F，Lv Z Y，Huang Y X， Tan H X，Zhang L， Diao Y. 2023. Molecular cloning and functional characterization of BcTSA in the biosynthesis of indole alkaloids in Baphicacanthus cusia [J]. Frontiers in Plant Science， 14： 1174582. doi：10.3389/FPLS.2023.1174582.

Jin Z H，Kim JH， Park S U，Kim S U. 2016. Cloning and char-acterization of indole synthase （INS） and a putative trypto-phan synthase 0-subunit（TSA） genes from Polygonum tinc-torium[J].Plant Cell Reports， 35 （12）： 2449-2459.doi：10.1007/s00299-016-2046-3.

Nishio K， Morimoto Y， Ishizuka M，Ogasahara K， Tsukihara T， Yutani K. 2005. Conformational changes in the alphasubunit coupled to binding of the beta 2-subunit of tryptophan synthase from Escherichia coli： Crystal structure of the tryptophan synthase alpha-subunit alone [J]. Biochemistry，44（4）：1184-1192. doi：10.1021/bi047927m.

O'Rourke K F， Axe J M， D'Amico R N， Sahu D， Boehr D D.

2018. Millisecond timescale motions connect amino acid interaction networks in alpha tryptophan synthase[J].Frontiers in Molecular Biosciences， 5： 92. doi： 10.3389/fmolb.2018.00092.

O'Rourke K F， D'Amico R N， Sahu D， Boehr D D. 2021. Distinct conformational dynamics and allosteric networks in alpha tryptophan synthase during active catalysis [J]. Protein Science： A Publication of the Protein Society，30（3） ：543-557. doi： 10.1002/pro.4011.

Yang M Q， Yao B W， Lin R M. 2022. Profiles of metabolic genes in Uncaria rhynchophylla and characterization of the critical enzyme involved in the biosynthesis of bioactive compounds-（iso） rhynchophylline [J]. Biomolecules，

12（12）：1790. doi：10.3390/biom12121790.

Parveen T， Kamran M， Fatmi Q M. 2019. Structural and dynamical thermostability of psychrophilic enzyme at various temperatures：Molecular dynamics simulations of tryptophan synthase [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，663：297-305. doi：10.1016/j.abb.2019.01.022.

Radwanski E R， Zhao J， Last R L. 1995. Arabidopsis thaliana

tryptophan synthase alpha： Gene cloning， expression， and subunit interaction [J]. Molecular amp; General Genetics， 248（6）：657-667. doi：10.1007/BF02191705.

Radwanski E R，Barczak A J，Last R L. 1996. Characterization of tryptophan synthase alpha subunit mutants of Arabidopsis thaliana [J]. Molecular amp; General Genetics， 253 （3） ：

353-361. doi：10.1007/pl00008602.

Salvini M， Boccardi T， Sani E， Bernardi R， Tozzi S， Puglies C， Durante. 2008. Alpha-tryptophan synthase of Isatis tinctoria：Gene cloning and expression[J]. Plant Physiology and Biochemistry，46（7）：715-723. doi：10.1016/j.plaphy.2008.04.002.

Shin M R，Kim M J，Lee J A，Roh S S. 2021. Effect of Uncaria rhynchophylla against thioacetamide-induced acute liver injury in rat [J]. Canadian Journal of Gastroenterology amp; Hepatology，2021：5581816. doi：10.1155/2021/5581816.

Kriechbaumer V， Weigang L， Fiesselmann A， Letzel T， Frey M， Gierl A， Glawischnig E. 2008. Characterisation of the tryptophan synthase alpha subunit in maize[J]. BMC Plant Biology，8（1）：44. doi：10.1186/1471-2229-8-44.

Xu Q Q，Shaw P C，Hu Z，Yang W，Ip S P，Xian Y F，Lin Z X.

2021. Comparison of the chemical constituents and antiAlzheimer's disease effects of Uncaria rhynchophylla and Uncaria tomentosa[J]. Chinese Medicine， 16（1） ： 110. doi：10.1186/s13020-021-00514-2.

Zhang Q， Zhao J J， Xu J，F(xiàn)eng F，Qu W. 2015. Medicinal uses， phytochemistry and pharmacology of the genus Uncaria [J]. Journal of Ethnopharmacology， 173： 48-80. doi： 10.1016/j.jep.2015.06.011.

（責(zé)任編輯陳燕）